mια Μεντελική προσέγγιση - forth-imbb · igenetics Ακαδημαϊκές...

iGeneticsMια Μεντελική προσέγγιση

iGenetics 2Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

Κεφάλαιο 16 (+κεφάλαιο 9 Hartwell)

Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA

Πήκτωμα αγαρόζης, στο οποίο έχουν διαχωριστεί με ηλεκτρο-φόριση τμήματα DNA, ενώ εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία.

iGenetics 3Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.1. Θέση περιορισμού συμμετρική ως προς τον άξονα που περνά από το μέσο της. Στην εικόνα φαίνεται η θέση αναγνώρισης της EcoRI. Η αλληλουχία είναι παλίνδρομη: είναι ίδια και στις δύο αλυσίδες του DNA όταν διαβάζεται στην ίδια κατεύθυνση.

4

Εικόνα από το κεφ. 9 (Hartwell): Πως ανακαλύφθηκαν τα περιοριστικά ένζυμα

Το βακτήριο στο δικό του DNA Τροποποιεί μέσω μεθυλίωσης τις θέσεις αναγνώρισης

των περιοριστικών ενύμων έτσι ώστε να μην υφίσταται πέψη το γονιδίωμα του

iGenetics 5Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

>400 διαφορετικά ένζυμα περιορισμού.

Πρώτο γράμμα: όνομα γένουςΔεύτερο/τρίτο γράμμα: το όνομα του οργανισμού που απομονώθηκαν

iGenetics 6Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

iGenetics 7Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

iGenetics 8Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.2

Παραδείγματα του τρόπου με τον οποίο τα ένζυμα περιορισμού κόβουν

το DNA. (α) Η SmaI δημιουργεί λεία άκρα. (β) Η BamHI δημιουργεί προεξέχοντα 5΄ μο-νόκλωνα (κολλώδη) άκρα. (γ) Η PstI

δημιουργεί προεξέχοντα 3΄ μονόκλωνα (κολλώδη) άκρα.

Τα συμπληρωματικά άκρα ζευγαρώνουν με δεσμούς υδρογόνου και συνδέονται με ομοιοπολικό δεσμό μέσω της DNA λιγάσης. Ισχύει και για τα τμήματα με λεία άκρα.

DNA λιγάση:καταλύει το σχηματισμό φωσφοδιε-στερικού δεσμού.

iGenetics 9Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.3

Πέψη του DNA από το ένζυμο περιορισμού EcoRI. Το ένζυμο EcoRI δημιουργεί δύο συμμετρικές εγκοπές που ονομάζονται ασυμπτωτικές. Έτσι προκύπτουν κολλώδη άκρα. Όταν δύο τμήματα DNA προέρχονται από πέψη με το

ίδιο ένζυμο, έχουν τα ίδια κολλώδη άκρα και μπορούν να συνδεθούν μέσω ζευγαρώματος των συμπληρωματικών βάσεων. Οι εγκοπές που παραμένουν είναι δυνατόν να κλείσουν με

το σχηματισμό ομοιοπολικών δεσμών από την DNA λιγάση.

iGenetics 10Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

Πλασμιδιακοί φορείς κλωνοποίησης

ΧαρακτηριστικάΠλασμίδιο: εξωχρωμοσωμικό γενετικό στοιχείο το οποίο αντιγράφεται αυτόνομα μέσα στο κύτταρο.

Είναι παράγωγα φυσικών πλασμιδίων που έχουν τροποποιηθεί

Κυκλικό, δίκλωνο DNA

Λειτουργικά στοιχείαΦέρουν αλληλουχία έναρξης της αντιγραφής για τον πολλαπλασιασμό τους

Φέρουν δείκτη επιλογής για να διακρίνονται εύκολα τα κύτταρα E.coli που το περιέχουν.

Φέρουν μια ή περισσότερες θέσεις αναγνώρισης θέσης περιορισμού

Εικόνα από το Κεφάλαιο 9

Hartwell

Πρέπει να διασφαλίσουμε οτι

το ανθρώπινο

DNA θα “μπει” στο

πλασμίδιο και ότι το πλασμίδιο

θα “μπει” στο E.coli κύτταρο.

iGenetics 12Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.4

Ο πλασμιδιακός φορέας κλωνοποίησης pUC19.

Το πλασμίδιο αυτό φέρει μια θέση έναρξης της αντιγραφής (ori), το δείκτη επιλογής ampR

και έναν πολυσυνδέτη που εδράζεται στο τμήμα άλφα του γονιδίου της β-γαλακτοζιδάσης,

lacZ+.

iGenetics 13Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.5

Ένθεση ενός τμήματος DNA στον πλασμιδιακό φορέα κλωνοποίησης pUC19 και δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου μορίου DNA.

Blue-white selection με Xgal

Κάποια παλσμίδια επανασυνδέονται με τη λιγάση χωρίς όμως να περιέχουντο νέο κομμάτι DNA.

Η χρησιμότητα της αλκαλικής φωσφατάσης στη δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου μορίου DNA.

Η αλκαλική φωσφατάση απομακρύνει τη 5’ φωσφορική ομάδα από τα συμπληρωματικά μονόκλωνα άκρα του φορέα αφήνοντας μια 5’ υδροξυλομάδα. Απουσία της φωσφορικής ομάδας η DNA λιγάση δεν μπορεί να συνδέσειτα κολλώδη άκρα του φορέα εκτός και αν υπάρχει ανάμεσα τους το υπό κλωνοποίηση νέο τμήμα DNA (το οποίοπεριέχει τις φωσφορικές ομάδες)

Κάποια πλασμίδια φέρουν υποκινητές για την έναρξη της μεταγραφής

Η χρησιμότητα της πέψης με δύο περιοριστικά ένζυμα.

Η χρήση δύο περιοριστικών ενζύμων δεν επιτρέπει την επανακυκλοποίηση του πλασμιδίου χωρίς την ένθεση του νέου τμήματος DNA. Επίσης το νέο τμήμα DNA εισέρχεται στο φορέα με συγκεκριμένη κατεύθυνση.

Κάποια πλασμίδια φέρουν υποκινητές που αναγνωρίζονται από τις RNA πολυμεράσες των φάγων για την έναρξη της μεταγραφής

iGenetics 16Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.6

Τυπικό τεχνητό χρωμόσωμα ζυμομύκητα (YAC).YAC: φορέας που επιτρέπει την κλωνοποίηση μεγάλων τμημάτων DNA σε κύτταρα ζύμης.Τμήματα DNA >5-10kb σε μέγεθος είναι ασταθή όταν κωνοποιούνται σε πλασμίδια.

To YAC περιέχει:ένα τελομερές ζυμομύκητα (TEL) σε κάθε άκρο, ένα κεντρομερές ζυμομύκητα (CEN), ένα δείκτη επιλογήςζυμομύκητα σε κάθε βραχίονα (εδώ τους TRP1 και URA3), μία αυτόνομα αντιγραφόμενη αλληλουχία (ARS) και θέσεις περιορισμού για την κλωνοποίηση του εξωγενούς DNA.

1. Τα ευκαρυωτικά χρωμοσώματα φέρουν τελομερή.2. Τα γονίδια Trp1 και Ura3 στο YAC είναι τροφικοί δείκτες και επιτρέπουν σε ένα κύτταρο ζύμης που στερείται λειτουργικών γονιδίων Trp1και Ura3 να αναπτυχθεί σε θρεπτικό μέσο από το οποίο απουσιάζει η τρυπτοφάνη και ουρακίλη. 3. ARS: επιτρέπει στο φορέα την αντιγραφή4. Ένα πολυσυνδέτη για την κλωνοποίηση.

Τα BACs φέρουν μικρότερα κομμάτια DNA από τα YACs αλλά προτιμώνται επειδή υφίστανται λιγότερες αναδιατάξεις μέσα στο ξενιστή.

17Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

Tεχνητό χρωμόσωμα βακτηρίων (BAC).BAC: φορέας που επιτρέπει την κλωνοποίηση μεγάλων τμημάτων DNA (300kb) σε E.Coli.To BAC φέρει τη θέση έναρξη αντιγραφής ενός φυσικού πλασμιδίου που ονομάζεται παράγοντας F.

1. repE: επιτρέπει την αντιγραφή του πλασμιδίου και τη ρύθμιση του αριθμού αντιγράφων2. parA και parB: επιτρέπει το διαχωρισμό του F plasmid DNA στα θυγατρικά κύτταρα.3. Δείκτες επιλογής: για αντοχή στα αντιβιοτικά; Μερικά BACs έχουν lacZ για blue/white selection.4. T7 & Sp6 phage υποκινητές για τη μεταγραφή γονιδίων.

iGenetics 18Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

Bιβλιοθήκες DNA

Γονιδιωματική βιβλιοθήκη: συλλογή κλώνων που περιέχει όλες τις αλληλουχίες DNA του γονιδιώματος

Χρωμοσωμικές βιβλιοθήκες: συλλογή κλώνων που περιέχεισυγκεκριμένα τμήματα χρωμοσωμάτων

Βιβλιοθήκες συμπληρωματικού DNA: συλλογή DNA κλώνων που προέρχονται από τα mRNA του κυττάρου

iGenetics 19Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

Γονιδιωματική Bιβλιοθήκη

Πλήρης πέψη του γονιδιωματικού DNA με ένζυμο περιορισμού: -αν περιέχει >1 θέση περιορισμού, το κάθε γονίδιο θα χωρισθεί σε >2 τμήματα-με αλληλουχίες αναγνώρισης 6kb, τα ένζυμα κόβουν το DNA σε±4kb (μικρό μέγεθος!)

Μηχανική θραύση DNA με πέρασμα μέσα από λεπτή βελόνα.-μεγαλύτερα τμήματα 100-150kb αλλά τα άκρα των τμημάτων απαιτούν πρόσθετους Χειρισμούς για να κλωνοποιηθούν σε πλασμίδια.

Μηχανική θραύση + μερική πέψη με ένζυμο.-Παράγεται ενας πληθυμσμός σχετικά μεγάλων αλληκαλυπτόμενων τμημάτων DNA.-στη συνέχεια γίνεται ηλεκτροφόρηση για να επιλεγούν τα τμήματα με το σωστό μέγεθος.

iGenetics 20Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.7

Παραγωγή τμημάτων DNA κατάλληλου μεγέθους για την κατασκευή μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης, μέσω μερικής πέψης με ένζυμο περιορισμού.

Τα Sau3a άκρα είναι συμπληρωματικά με εκείνα που προκύπτουν από πέψη με Bamh1

Sau3a: GATCBamh1: GGATCC

Πόσους κλώνους πρέπει να σαρώσει κανείς για να εντοπίσει σε μια βιβλιοθήκη το γονίδιο που επιθυμεί

να κλωνοποιήσει;

ln (1-P)N= ----------

ln (1-f )Ν: α απαιτούμενος αριθμός κλώνωνP: η επιθυμητή πιθανότηταf: το μέσο μέγεθος των τμημάτων DNA που θα εισαχθούν

στο φορέα/συνολικό μεγέθους του γονιδιώματοςln: φυσικός λογάριθμος

Για πιθανότητα 99%: Ζύμη (γονδίωμα: 12000kb/15kb τμηματα) 3682 κλώνοι Ανθρώπινο γονιδίωμα (3.000.000 kb 920.000 κλώνοι!

Για αυτό προτιμώνται τα YACs ή τα BACs

FFF

Χρωμοσωμικές βιβλιοθήκες

Για να καταστεί πιο εύκολη η διαδικασία της σάρωσης ενός γονιδίου: Ξεχωριστές βιβλιοθήκες για κάθε χρωμόσωμα = 22 αυτοσωμικές +2 φυλετικές για τον άνθρωπο.

Πως;

Διαχωρισμός με κυτταρομετρία ροής1. Χρώση με φθορίζουσα χρωστική των χρωμοσωμάτων2. Ακτινοβόληση με δεσμη ακτίνων λέιζερ3. Εκπομπή φθορίζουσας ουσίας 4. Διαχωρισμός με βάση την ένταση (λόγω και του διαφορετικού αρχικού μεγέθουςτων χρωμοσωμάτων)

iGenetics 23Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.8

Σύνθεση δίκλωνου cDNA από πολυαδενυλιωμένο mRNA με τη χρήση της αντίστροφης μεταγρα-

φάσης (RNA εξαρτώμενη DNA πολυμεράση), της

RNάσης Η, της DNA πολυμεράσης Ι και της

DNA λιγάσης.

cRNA?

Βιβλιοθήκες cDNA

iGenetics 24Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.9

Πως κλωνοποιούμε τα μόρια cDNA σε φορείς

Κλωνοποίηση cDNA με τη χρήση linkers (συνδετών) BamHI.

Πρόβλημα: οι θέσεις Bamh1 μπορεί να υπάρχουν και μέσα στο γονίδιο

iGenetics 25Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.10

Σάρωση μιας βιβλιοθήκης cDNA με τη χρήση ενός σημασμένου αντισώματος.

iGenetics 26Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.10

Σάρωση μιας βιβλιοθήκης cDNA με τη χρήση ενός σημασμένου

αντισώματος.

iGenetics 27Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.11

Σάρωση μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης σε πλασμιδιακό φορέα με ιχνηθέτη ένα σημασμένο μόριο DNA.

iGenetics 28Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.11

Σάρωση μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης σε πλασμιδιακό φορέα με ιχνηθέτη ένα σημασμένο μόριο DNA.

Η ραδιενεργή σήμανση του ιχνηθέτη γίνεται με αποδιάταξη της διπλής έλικας του DNA και ενίσχυση τουιχνηθέτη με τυχαίους εκκινητές (εξανουκλεοτίδια με τυχαία αλληλουχία) και ραδιοσημασμένα dNTPs.

Μη ραδιενεργή σήμανση DNA με DIG-labeled dUTP που ενσωματώνεται απέναντι από τα νουκλεοτίδια αδενίνης

iGenetics 29Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.12

Παράδειγμα κλωνοποίησης ενός γονιδίου ζυμομύκητα (του ARG1) μέσω λειτουργικής συμπληρωματικότητας.

ARG1: βιοσύνθεση αργινίνηςURA3: βιοσύνθεση ουρακίλης

Ετερόλογοι ιχνηθέτεςΕντοπισμός συγκεκριμένων γονιδίων σε μια γονιδιωματική

βιβλιοθήκη με τη χρήση ιχνηθετών cDNA από ομόλογα γονίδια άλλων οργανισμών (ποντίκι άνθρωπος)

Νουκλεοτιδικοί ιχνηθέτεςΕφόσον γνωρίζουμε μέρος της αμινοξικής αλληλουχίας του γονιδίου:

Σχεδιάζουμε μείγμα με σημασμένα oligos 20bp όλων των δυνατών επιλογών βασιζόμενοι στον εκφυλισμό του γενετικού κώδικα.

Μοριακή ανάλυση κλωνοποιημένου DNA

iGenetics 32Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.13Χαρτογράφηση

περιορισμού: ο χάρτης που προκύπτει μετά

από πέψη με ένα περιοριστικό

ένζυμο

iGenetics 33Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.13

Χαρτογράφηση περιορισμού.

iGenetics 34Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.14

Συσκευή ηλεκτροφόρησης πηκτώματος αγαρόζης (δεξιά) και τροφοδοτικό (αριστερά).

iGenetics 35Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.15

Παράδειγμα χαρτογρά-φησης περιορισμού με

σκοπό τον προσδιορισμό του προσανατολισμού

ενός τμήματος DNA που έχει κλωνοποιηθεί σε

κάποιο πλασμίδιο.

iGenetics 36Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.16

Ανάλυση κατά Southern γονιδιω-ματικού DNA με σκοπό τον εντο-

πισμό αλληλουχιών συμπληρωμα-τικών προς ένα σημασμένο ιχνη-θέτη (για παράδειγμα, ένα μόριο

cDNA). Σε αυτό το θεωρητικό παράδειγμα, ο

ιχνηθέτης υβριδοποιείται με τρία τμήματα DNA. Οι αντίστοιχες ζώ-νες καθίστανται ορατές μέσω αυτο-ραδιογραφίας ή χημειοφωταύγειας.

iGenetics 37Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.16

Ανάλυση κατά Southern γονιδιω-ματικού DNA με σκοπό τον εντο-

πισμό αλληλουχιών συμπληρωμα-τικών προς ένα σημασμένο ιχνηθέτη (για παράδειγμα, ένα μόριο cDNA). Σε αυτό το θεωρητικό παράδειγμα, ο ιχνηθέτης υβριδοποιείται με τρία τμήματα DNA. Οι αντίστοιχες ζώ-νες καθίστανται ορατές μέσω αυτο-ραδιογραφίας ή χημειοφωταύγειας.

iGenetics 38Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

Ανάλυση κατά Northern: RNA

Ανάλυση κατά Western: πρωτείνες

iGenetics 40Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.17

Αλληλούχιση με διδεοξυνουκλεοτίδια. Ο «αριθμός νουκλεοτιδίου» αναφέρεται στη θέση που καταλαμβάνουν στην υπό προσδιορισμό αλληλουχία τα νουκλεοτί-δια τα οποία διαβάζονται σε κάθε διαδρο-μή. Για παράδειγμα, τα Α που διαβάζονται

στην πρώτη διαδρομή βρίσκονται στις θέσεις 1, 6 και 8 της υπό προσδιορισμό

αλληλουχίας. Ο «αριθμός νουκλεοτιδίου» αντιστοιχεί στην απόσταση ανάμεσα στο 3΄ άκρο του εκκινητή και στη θέση που

ενσωματώθηκε το ddNTP. Στο «μήκος των σημασμένων τμημάτων σε νουκλεοτίδια»

δε λαμβάνεται υπόψη το μήκος του εκκινητή.

iGenetics 41Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.18

Ένα διδεοξυνουκλεοτίδιο.

iGenetics 42Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.19

Αυτοραδιογράφημα ενός πηκτώματος αλλη-λούχισης με τη χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων. Τα γράμματα πάνω από τις διαδρομές (A, C, G

και T) υποδεικνύουν το διδεοξυνουκλεοτίδιο που χρησιμοποιήθηκε στην αντίστοιχη αντίδραση.

iGenetics 43Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.20

Αποτελέσματα αυτοματοποιημένης αλληλούχισης με διδεοξυνουκλεοτίδια

σημασμένα με φθορίζουσες χρωστικές.

iGenetics 44Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.21

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR).

iGenetics 45Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2009

ΕΙΚΟΝΑ 16.21

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR).

RT-PCR