idb hc3 en hc4 enzymen en enzymkinetiek michaelis menten inhibitie van enzymen ivo horn

IDB HC3 en HC4Enzymen en enzymkinetiek

Michaelis Menten

Inhibitie van enzymen

Ivo Horn

Te bestuderen

• Wilson and Walker, Principles and techniques

of biochemistry and molecular biology: blz

581-588

• Campbell and Farrell, 7e editie: H6, 6.1-6.7

optioneel:

• Campbell and Reece, 9e editie: H8: 8.4

Biologische katalyse

• Katalyse is de belangrijkste functie van eiwitten

• Katalyse: versnellen/efficienter laten verlopen van

een reactie

• Biologische katalytische eiwitten: enzymen

• Verhogen de snelheid 1020. niet-enzymen komen tot

104

• Er zijn enkele niet-eiwit katalytische biomoleculen:

ribozymen. Dit zijn katalytische RNA’s

Biologische wasmiddelen• Bevatten enzymen

• Unilever research

• Hittebestendig maken van

eiwitten!

• Normale enzymen werken

optimaal bij 37 graden

Celsius

Een enzym betrokken bij ziekten

• Het GTPase Ras is een

enzym

• Zet GTP in GDP om

• Verandert daarbij van

conformatie/vorm

• De GTP –gebonden vorm

is aktief en geeft

signalen door in de cel

• In bijvoorbeeld bepaalde

tumoren is Ras

gemuteerd en constant

in de aktieve conformatie

Acetylcholine esterase (ACE)

Bij Alzheimer: het enzym acetylcholine esterase wordt geremd waardoor afbraak van acetylcholine tegen wordt gegaan

Functies van eiwitten:

• Enzymen: versnellen reacties• Structurele eiwitten: collageen (in bot)

en keratine (in haar)• Opslag eiwitten: albumine (in bloed) en

caseïne (in melk)• Transport eiwitten: Hb (O2 in bloed),

albumine (bili in bloed)• Hormonale eiwitten: insuline, glucagon• Receptor eiwitten• Contractiele eiwitten in spierweefsel• Defensieve eiwitten: antilichamen

PKMζ

Indeling van enzymen:

• Transferases (verplaatsen groepen op eiwitten)

• Hydrolases (maken water vrij)

• Ligases (“lijmen” DNA stukken aan elkaar)

• Kinases (fosforyleren eiwitten)

• GTPases (zetten GTP om in GDP)

• Fosforylases (verwijderen fosfaatgroepen)

• etc

geheugenfunctie

• PKMζ is betrokken bij geheugenvorming

• Muizen kregen saccharine toegediend

• Misselijkheid werd opgewekt direct daarna

• Reactie later op saccharine: misselijkheid

(geheugen!)

• Injectie ZIP in de cortex, geen misselijkheid.

Remming enzym PKMζ

Voorbeeld groep 1

CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH+ H+

ethanol ethanalAlcoholdehydrogenase (alcohol:NAD oxidoreductase)Nummer 1.1.1.1 (EC-rules)1.Hoofdgroep1.CH-OH is donor1.NAD+ of NADP+ is acceptor1.Eerst gevonden enzym in deze groep

Verwijdert protonen en vormt daardoor ethanal uit ethanol

Overzicht

• Katalytisch vermogen,specificiteit, regulatie

• Introductie enzymkinetiek • Kinetiek van enzym-

gekatalyseerde reacties • Enzyminhibitie • Ribozymen

Enzymen

• Enzymen laten cellen beschikken over

het vermogen om reacties zo snel te

laten verlopen als nodig is voor de cel

• Enzymen zijn de stoffen die gerelateerd

zijn aan een metabolische functie

Gekatalyseerde reacties

vergen minder

activatie energie

De DG waarde

• Negatief: exergone reactie. Spontaan

verlopende reactie; er komt energie vrij

• Positief: endergone reactie. Reactie vraagt

energie om te verlopen. Energetisch dus

ongunstig

• Nul: exergoon noch endergoon. Evenwicht

situatie

De Gibbs vrije energie, DG

• DG = Gproducten – G reactanten

• DG is onafhankelijk van de gekozen route

• DG zegt niets over de snelheid van de

reactie

• Indien negatief: dan kan de reactie plaats

vinden. Dat wil niet zeggen dat het

merkbaar of snel gebeurt!

Relatie tussen vrije energie en evenwichtsconstante K

• DG = DG0 + RT ln K

• K is quotiënt van de concentraties

reactanten

• K = [AB]/[A][B]

• R is de gasconstante

• DG0 is de standaard vrije energie (vaste

waarde)

Allosterische enzymen: sigmoidale curve

Allosterische enzymen

• Binden een bepaald molecule

• Veranderen dan van vorm

• Kunnen nu efficiënt aan substraat

binden

• Hemoglobine kent een allosterisch

effect door zuurstof binding

Gekoppelde enzymatische reacties

Co-factoren, co-enzymen en prostetische groep

• Veel enzymen hebben andere verbindingen

nodig

• Zijn klein t.o.v. het eiwit

• Anorganisch: Co-factor

• Organisch:

– Covalent: prostetische groep

– Niet-covalent: co-enzym (vaak afgeleid van

vitamines)

Prosthetische groepen en cofactoren: zijn nodig voor enzymatische activiteit

Katalytisch vermogen

• Enzymen kunnen reacties versnellen tot 1016 x zo snel als niet-gekatalyseerde reacties!

• Urease is een goed voorbeeld: – gekatalyseerd: 3x104/sec – Niet gekatalyseerd: 3x10-10/sec – Ratio is 1x1014 !

Specificiteit

• Enzymen herkennen hun substraat (substraat-specificiteit)

• Enzymen leveren een opbrengst van meer dan 95% (reactiespecificiteit)

• Specificiteit wordt bepaald door de unieke “fit” tussen het substraat en het enzym

Enzymatische modellen

De cyclus van een enzym

Enzymatische werking

Schematisch de werking van een enzym

Een voorbeeld van een enzym

Wat enzymen doen....

• Enzymen versnellen reacties door

verlaging van de activeringsenergie

• Enzymen doen dit door de “transition

state” van de reactie beter te binden dan

het substraat

enzymreacties

Foutje in tekstboek: DP is niet negatief, want wordt gevormd!

Enzymreacties

k1 k2

E + S ES E + P k-1

E is enzymS is substraatES is het complex van E en SP is productk zijn snelheidsconstantesK is (k-1 + k2) / k1

VerzadigingBij kleine hoeveelheid enzym

t.o.v. substraat

Enzym op maximale snelheid

Enzym kan niet sneller omzetten

Verzadiging van het enzym

Reactiesnelheid is afhankelijk van de concentratie substraat

Bij hoge S concentraties nadert v de Vmax waarde

Michaelis - Menten

Leonor Michaelis Maud Menten

Michaelis Menten kinetiek

• De basis voor de meeste niet-

allosterische enzym-reacties

• Ontwikkeld in 1913

• Karakteriseert enzym-activiteit in

termen van snelheid en binding aan

het substraat

Reactieschema

k1 k2

E + S ES E + P k-1

Michaelis-Menten vergelijking

Michaelis-Menten's theorie

• Gaat uit van de vorming van een enzymsubstraatcomplex

• ES is in een snel evenwicht met E en S

• De reactie van ES naar E en P gaat langzaam

Eerste orde kinetiek: er is een lineair verband tussen enzymatische snelheid

en substraat concentratie

Michaelis-Menten mechanisme

snelheid vorming ES = k1.[E].[S] snelheid van afbraak van ES

= (k-1+k2).[ES] a Km = [E].[S] = (k-1+k2)/k1

[ES]Km = Michaelis-Menten constante

Michaelis-Menten – vergelijking:

Vmax.[S] v = ---------------- Km + [S]

De Vmax

• Vmax is een “constante”

• Vmax is de theoretisch maximale snelheid van de

reactie

• Vmax vereist dat alle enzymmoleculen aan het

substraat gebonden zijn

• Vmax wordt benaderd als de substraatconcentratie

hoog is

De steady state• Er is weinig enzym-substraat

complex aanwezig

• Complex vorming en afbraak zijn in

evenwicht

• Enzymen bereiken snel de steady

state fase: zijn efficiënt in het

katalyseren van de reactie

Het turnover getal

Een maat voor de katalytische activiteit

• is het aantal substraatmoleculen omgezet in product per

enzymmolecuul per sec, als het enzym (E) is verzadigd met

substraat.

• k2 = kcat = Vmax/[Et]

• kcat varieert per enzym (minder dan 1/sec tot vele

miljoenen/sec

Enzymen beschrijven we middels kcat en Km

De Michaelisconstante Km

• Km is een constante waarbij de Vmax

half-maximaal is• Km is afgeleid van de reactiesnelheid-

constanten• Kleine Km: sterke binding; hoge Km:

zwakke binding

Bepaling Km

Lineaire Plot van Michaelis-Mentenvergelijking

V0 = Vmax.[S]/(KM + [S])

Lineweaver-Burk: zet in reciproke vorm

1/V0 = (KM/Vmax).1/[S] + 1/Vmax

Vergelijk met : y = a.x + b

Lineweaver-Burk-plotDoor de Michaelis Menten curve lineair te maken zijn Km en Vmax eenvoudig te bepalen

Invloed pH

Invloed temperatuur

• Hogere temperatuur:

• Moleculen bewegen sneller

• Reactie verloopt sneller

Te hoge temperatuur: enzym denatureert

Dus enzymen hebben een optimum

Invloed temperatuur

b.v. Taq DNA polymerase

Enzym inhibitie

• Enzymen kunnen specifiek geremd worden

• Farma bedrijven proberen soms een miljoen “lead compounds”

• Uiteindelijk blijft er 1 over die precies past in het enzym en

specifiek de activiteit remt

• Ontwikkeling kost soms miljoenen euros

• Terugverdienen via octrooirecht op het uiteindelijke

geneesmiddel

• Ethisch: derde wereld ziekten en ontwikkeling medicijnen

• Medicijnen zijn soms heel duur

Enzymremmers

Reversibel versus Irreversibel

• Reversibele inhibitors: niet-covalente

binding

• Irreversibele inhibitors: (bijna)

covalente binding

Remming van enzymen• Competitief - inhibitor (I) bindt aan actieve plaats

• Niet-competitief- inhibitor (I) bindt elders

Competitieve remming

• Een remmer bindt op de plaats van het substraat

• Er is meer substraat nodig om de remming op te

heffen

• De Km wordt dus groter

Competitieve remmingCompetitieve remming

Niet-competitieve remming

Het enzym wordt ten dele geremd doordat een

remmer op een andere plaats bindt dan het

substraat, maar wel de katalyse beinvloed

Niet-competitieve remming

De Michaelis curve bij remming

Irreversibele remming

• Remmer bindt zeer sterk aan het

enzym en laat vrijwel niet meer los

• Zowel remmer als enzym gaan dus

verloren in het irreversibele complex

Enzymactiviteit bepalen...Hoe?

Kies de

o de substraatconcentratie......?

o het substraat.....?

o de pH........?

o de aard van de buffer.....?

o de temperatuur.....?

Enzymactiviteit bepalen...Waarom?

• Diagnostiek: veel eiwitten spelen een rol in medische

situaties

• Eiwitzuiveringen, isolaties, research

• Met hoeveel enzym(in Units) begin je?

• Hoeveel enzym (in Units) heb je nog over?

• Hoe zuiver (U/mg) is het?

Diagnostiek

Enzym NormaleWaarden (IU/l)

Verhoogd wijst op

Creatine- fosfokinase

40-240 (man)40-200 (vrouw)

Hartinfarct

Alkalische fosfatase

30-125 galstuwing

Zure fosfatase 2,5 Prostaat- carcinoom

Lactaatdehydro-genase

200-450 leverziekten

Waarom Units en geen mol/l?

• Eiwitten ingewikkeld mengsel• Eiwitten kunnen denatureren

Kijk daarom naar de activiteit van het enzym!!!

1 I.U = die hoev.enzym die in staat is om 1 mol substraat/min om te zetten (onder bepaalde condities)

Voorbeeld enzymbepaling

• Zorg voor:

– Substraat met kleine KM, goede affiniteit

– Hoge [S]

– Optimale temperatuur

– Optimale pH

– Optimale buffer

En meet A/min en activiteit enzym

Km en Kcat• Belangrijkste parameters voor

enzymen

• Hiermee karakteriseren we enzymen!

• Km: affiniteit voor substraat en = ½

Vmax

• Kcat: turnover getal, dus mate van

katalytisch vermogen ten opzichte

van het substraat

Voorbeeld: enzym remming bij AIDS

• Tegen drie cruciale virale enzymen zijn remmers

ontworpen

• De enzymen zijn “gekristalliseerd”, dwz, de structuur is

onderzocht en bekend

• Er zijn “gericht” medicijnen gemaakt tegen deze enzymen

Virale enzymen en AIDS

Anti-virale middelen en enzymatische targeting

Samenvatting

• Enzymen zijn zeer efficiënte katalytische eiwitten

• Michaelis en Menten beschreven een zeer goed model voor

niet-allosterische enzym activiteit

• Uit een Michaelis Menten curve kan men de Km bepalen

• Kcat kan berekend worden uit de hoeveelheid gevormd

product (is k2)

• Enzymen kunnen competitief niet-competitief geremd worden

• Bij competitieve remming verandert de Km

• Bij niet-competitieve remming verandert de Vmax