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Analyses structurales des protéines par MS
en condition in situ
Julien Franck
Laboratoire PRISMProtéomique, Réponse Inflammatoire &
Spectrométrie de MasseINSERM U1192
Laboratoire PRISM (Protéomique, Réponse Inflammatoire & Spectrométrie de Masse)-Campus Universitaire Lille 1-Bâtiment SN3, 1er étage
Localisation
Mr. Jean-Pascal Gimeno
Plateforme CLIC-Imaging Bâtiment SN3, Porte 107, Université Lille 1
59655 Villeneuve d’Ascq CedexTel : (+33) 03 20 33 60 32
Jean-Pascal.Gimeno@univ-lille1.fr
Nous contacter
Plateforme CLIC-IMAGINGImagerie MALDI MS et Micro-protéomique
Plateforme CLIC-IMAGINGImagerie MALDI MS et Micro-protéomique
Spectromètres (8)- MALDI-TOF/TOF, Ultraflex II, Bruker Daltonics- MALDI-TOF, Autofkex Speed, Bruker daltonics- MALDI-LTQ-Orbitrap, Thermo Scientific- SYNAPT 2GS, IMS, ETD, Waters- QExactive, Thermo Scientific- Qexactive+, Thermo Scientific- HCT Ultra, ETD, Bruker Daltonics
Equipements
Techniques Séparatives- 1 Nano LC, Easy-nLC II, Proxeon- 1 Nano UHPLC, EASY- nLC 1000, Proxeon- 1 Nano UPLC, Aquity, Waters- 1 électrophorèse capillaire , PA 800, Beckman -Coulter
Préparation d’Echantillons- 1 système nanoESI haut débit + micro-extraction par LMJ, LESA Nanomate
Triversa, Advion- 1 Micro-spoteur piézoélectrique, CHIP 1000, Shimadzu- 1 Micro-sprayeur, ImagPrep, Bruker Daltonics- 1 cryostat- 1 Scanner de lames
2 IE (1 ½ ETP) Jean-Pascal Gimeno et Dounia MouajjahPersonnels
I. Sacrifice & dissection de l’organe
II. sections & transfert sur lames de verre ITO
III. Dépôt de la matrice
(Cryostat, Microtome)
M/z
Inte
nsity
(a.u
.)
M/z1 M/z2 M/z3
x1 x2 x3 x4 … … xn
y1 I1;1 I1;2 I1;3 I1;4 … … I1;n
y2 I2;1 I2;2 I2;3 I2;4 … … I2;n
y3 I3;1 I3;2 I3;3 I3;4 … … I3;n
y4 I4;1 I4;2 I4;3 I4;4 … … I4;n
y5 I5;1 I5;2 I5;3 I5;4 … … I5;n
y6 I6;1 I6;2 I6;3 I6;4 … … I6;n
y7 I7;1 I7;2 I7;3 I7;4 … … I7;n
x1 x2 x3 x4 … … xn
y1 I1;1 I1;2 I1;3 I1;4 … … I1;n
y2 I2;1 I2;2 I2;3 I2;4 … … I2;n
y3 I3;1 I3;2 I3;3 I3;4 … … I3;n
y4 I4;1 I4;2 I4;3 I4;4 … … I4;n
y5 I5;1 I5;2 I5;3 I5;4 … … I5;n
y6 I6;1 I6;2 I6;3 I6;4 … … I6;n
y7 I7;1 I7;2 I7;3 I7;4 … … I7;n
x1 x2 x3 x4 … … xn
y1 I1;1 I1;2 I1;3 I1;4 … … I1;n
y2 I2;1 I2;2 I2;3 I2;4 … … I2;n
y3 I3;1 I3;2 I3;3 I3;4 … … I3;n
y4 I4;1 I4;2 I4;3 I4;4 … … I4;n
y5 I5;1 I5;2 I5;3 I5;4 … … I5;n
y6 I6;1 I6;2 I6;3 I6;4 … … I6;n
y7 I7;1 I7;2 I7;3 I7;4 … … I7;n
IV. Analyse MALDI
V. Traitement des données et reconstruction des images
micro-dépôtou micro-sprayautomatique
Fournier et al., Expert Rev. Proteomics (2008) 5(3): 413Wisztorski et al. Dev. Neurobiol. (2008) 68: 845Franck et al., Mol. Cell. Proteomics (2009) 8(9): 8023
m/z1 m/z2 m/z3
Imagerie MALDI MS
Imagerie MALDI MSm/z 1066.63
m/z 2110.14
2015
Outils Bioinformatiques
Temps d’Acquisition
Résolution Spectrale
2002
Résolution Spatiale
Domaines d’Applications de CLIC-Imaging
•Cancer- Cancer gynécologiques (ovaires, trompes, endomètres,…)- Cancer de la prostate- Gliomes
Oncologies
•Maladies neurodégénératives- Parkinson, Alzheimer, Epilepsie, ALS
Pathologies du Système Nerveux
• Cerveau et périphérie- Lésion de la moelle épinière- Microbiome(Intestin)- Rate, poumon (infection bactérienne)- Inflammation de la peau(psoriasis, Acné, dermatite)- Yeux
Inflammation
• Perturbateurs Endocriniens• Petites molécules
Maladies endocrines
MSI TriclosanCancer prostate
Imagerie MALDI MS Exemples d’Applications
Suivi & Quantification de Médicaments- Organes ou Whole Body, Etudes DMPK
Imagerie de Xénobiotiques- Triclosan dans le Cancer de la prostate
Imagerie de lipides Imagerie de peptides/protéines
MSI lipides dansl’œil de lapin
Recherche de marqueurs de pathologies- Cancer, maladies neurodégénératives,….
Identification des marqueurs (micro-protéomique)- Marqueurs diagnostics / pronostics- Compréhension des mécanismes physiopathologiques
Histologie Moléculaire- Classification de pathologies
m/z 1066.63
MSI peptides hyppocampe de
patients TLE
MSI Imatinibrein de souris
2-hydroxymethyl metabolite
N-desmethyl metabolite
MSI Olanzapine et métabolites dans WBA souris
Micro-protéomique
m/z 782.528m/z 782.579m/z 782.633
Cancer Normal
MSI Peptidescolonie bactérienne
MSI marqueurCancer de l’ovaire
Identification de marqueurs Cancer de l’ovaire
OLZ
De l’Imagerie MS à l’identification de MarqueursUn lien entre l’imagerie et la protéomique
???
MALDI MSI
Localisation & Classification Moléculaire
Protéomique Conventionnelle
Identification &
Quantification
MALDI MS Imaging & Identification• MS2 in-situ sur tissue• Top-Down: ISD (par de sélection d’ion précurseur, non applicable sur FFPE)• Bottom-Up: Très forte complexité due à la digestion enzymatique
Micro-échantillonnage par Microextraction (LMJ)
S1P111
S2P117
S3P140
48
8453
1405
S1 vs S3 S2 vs S3
S1 vs S2
Position 1: Thalamic nucleus
• 1350 grouped proteinsidentifiées
• 1900 cellules analysées• Grande reproductibilité (< 5%
variation pour une même position)
197 2721137
Quanico et al, J. Proteomics (2013) 79: 200-18
Bottom-Up Microproteomique
De l’Imagerie MS à l’identification de Marqueurs
Longuespée R. et al., Proteomics Clin Appl. (2013) 7 (5-6): 337 / Wisztorski M. et al., Proteomics Clin. Appl. (2013) 7(3-4): 234Longuespée R. et al., Cancer Metastasis Rev., 2012, 31(3-4):713 / Vaysse C. et al., J Gynecol Oncol., 2011, 22(1): 9
85% de cancers épithéliaux- 70% origine séreuse dont 90% de hauts grades & 10% de bas grades-Autres: carcinomes endométrioïdes (10-15%), cellules claires (10%) & mucineux(3%)
Cancer Séreux de Haut Grade (HGSC) FFPE conservation 10 ans
Mésothélium Vaisseau sanguin Microdigestion & Microextraction
Région Bénigne
Région cancéreuse
315 123669CD44
VCANEZRIN
MAPK1
STIP-1
Myc
ARF
HUWE1 p53
RPL5
TIF-1
PML ACTR3
Bénin
Cancer
Application à l’étude de tissus FFPE du Cancer de l’Ovaire
Stratégie
Franck et al, Anal. Chem., 2013 85(17): 8127-34
4. Identification des Protéines
1. Echantillonnage des TissusQuadrillage de pixels
eg. Parafilm Assisted Micro-exision
5. Quantification Relative1 pixel vs tous les autres (Label Free)
2. Collecte des TissusPar pixels
3. Analyse Protéomiqueeg. ShotGun
6. Reconstruction des Images sur les données de
quantification
[x1, y1] [x2, y1]-------------------------- [xn, y1][x1, y1]
[x1, y2]
[x1, yn]
0 1 2 1 1 2
1 1 1 1 0 0 0
2 1 0 0 1 0 0
1 0 0 0 0 0 1
0 1 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 1 1
0 0 0 1 0 0 0
0 0 0 0 0 1
0 0 0 0 0 0
Toll-interacting protein
Vers l’imagerie MS Quantitative des Protéines
Imagerie Possible des Protéines de plus faible abondance
Parafilm Assisted Micro-excision sur coupe entière
Franck et al, Anal. Chem., 2013 85(17): 8127-34
ProSAAS Chromogranin-B Chromogranin-C Granulins Angiotensin-converting enzyme
Oxytocin-neurophysin 1
Vasopressin-neurophysin 2-
copeptin
Somatostatin Proenkephalin-ACD82 antigen
IL-16 Glia maturation factor beta
Pleiotrophin Disks large homolog 4
Basigin/Glycoprotein CE9
Leucine-rich glioma-inactivated protein 1
Macrophage migration inhibitory
factor
Prohibitin
100 %
0 %
Vers l’imagerie MS Quantitative des Protéines
Images MALDI Segmentation
Tumor
PAM
Bénin Tumeur
117 2081154
Identification des protéines
Analyse des réseaux de protéines
Tissu tumoralProstate tumors
Application à l’étude de tissus frais du Cancer de la prostate
Identification Top-Down par Microproteomique
MWexp = 17268.949 DaMWth = 17.268.9 Da
Error = 4.31 ppm
PTM profile de la Stathmin
ROI1
ROI2
80 Da
Nter-Ac + 1P + 2 P
80 Da
ROI3
m/z 772.577
m/z 844.703
80 Da
80 Da 80 Da
15 178
115 5
16
ROI3ROI1
ROI2
ROI1 ROI2
ROI3
m/z 864.686
Micro-Echantillonnage par Microextraction
1983
Today
Low spatial resolution2D imaging High spatial
resolution 2D imaging High spatial resolution 3D imaging
Vers un Imagerie Basée sur la Quantification HR et 3DAnalyse Structurale in situ?
Vers l’imagerie MS Quantitative des Protéines
Pontages intra-protéine
Pontage inter-protéine
Pontage Digestion
Analyses MS(MALDI-TOF)
Helin et al, RCMS, 1999
Pontages intra-protéines• Repliement de la protéine• Résidus proches • Informations sur la structure
Pontages inter-protéines• Partenaires d’interaction• Régions et distances d’interaction
Analyses MS & MS2
Peptides non pontés
Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiquePrincipe de la stratégie de pontage chimique par MS (XLMS)
Purification par affinité Sélection par marquage isotopique
Sulfo-SBED
Δ = 4.0247 Da
4Δ = 4.0243 Da
ESI-MS
xQuest/xProphet
Candidat peptide
Protéine cible
Partenaire
Purification par affinité sur colonne
de streptavidine
Protéines pontées avec réactif léger
Protéines pontées avec réactif lourd
biotine
Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueXLMS de mélanges complexes
Définition et découped’une région d’intérêt
2 mm
1
1. Réaction de pontage2. Réduction, alkylation,
digestion3. Dessalage
2 4
Analyse des 3 fractionspar nanoLC-MS/MS
3 Fractions
Fractionnement par chromatographie
d’exclusion stérique
Abso
rban
ce (A
U)
Volume (mL)
3
1 2 3
Fractions
5 6 7
I D E N T I F I C A T I O N D E S P R O T É I N E S E T P O N T A G E S P A R A N A L Y S E B I O I N F O R M A T I Q U E
P O N T A G E C H I M I Q U E S U R T I S S U E T A N A L Y S E P A R S P E C T R O M É T R I E D E M A S S E
Fraction 1
Fraction 2
Fraction 3
PROTEOMEDISCOVERER
Fraction 3 Fraction 1Fraction 2
8
Identification des protéines de la région
d’intérêt
Génération de labase de données
.fasta
Validationdes pontages identifiés
Recherchedes pontages
Vérification de lastructure
tridimensionnelle
Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueStratégie pour le XLMS sur tissus (TXLMS)
Heat shock cognate 71 kDa proteinLys325-Lys319 D = 9.7 Å
Spectre MS/MS d’un fragment ponté intramoléculairede la protéine HSC 70
Validation des données d’interaction obtenues / structure tertiaire
Ions fragments non pontésIons fragments pontés
DAKLDKSQIHDIVLVGGSTR
GTLDPVEKALR
Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueTXLMS et pontages intramoléculaires
Histone H2B (bleu)-H2A (cyan)K35-K37, Score = 34.31D = 15.4 Å
Tubuline α1(bleu)-Tubulineβ4(cyan) K112-K252, Score = 36.86D = 19.5 Å
Actine F homodimère pontageinter chaineK113-K191, Score = 42.12D = 14.9 A
Histone H2B (bleu)-H2A (cyan)K37-K86, Score = 26.58D = 20.4 Å
ATP synthase sous unité βK133-K159, Score = 30.23D = 14.3 Å
Tubuline α1 K96-K112, Score = 27.88D = 13.5 Å
Pompe Na/K sous unité a ATPaseK602-K352, Score = 28.44D = 24.4 Å
Heat shock cognate 71 kDaproteinK505-K510, Score = 31.18 D = 13.4 Å
Profilin 2K89-K68, Score = 30.23D = 5.7 Å
Malate deshydrogenaseK239-K236, Score = 35.62D = 5.5 Å
Histone H3K57-K65 Score = 36.88D = 20.3 Å
1433-gK69-K78, Score = 34.28D = 10.8 Å
Vesicle-associated membrane protein 2K59-K52, Score = 37.17D = 10.3 Å
Heat shock cognate 71 kDa proteinK325-K319, Score = 40.56D = 9.7 Å
Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueTXLMS et pontages intramoléculaires
Syntaxin binding proteinP sur S306, S313 et T574
Serine/threonine proteinphosphatase 5
Ions fragments non pontésIons fragments pontés
• Technique capable d’identifier de probables nouvelles interactions• Pourrait permettre de décrire de nouveaux processus biologiques importants
REPLPSLEAVYLITPSEKVSMSLISDFK
KYIKGYYR
Vers l’analyse structurale in situ par pontage chimiqueTXLMS et interactions protéines-protéines
0
10
20
30
40
50
0 200 400
Deut
eriu
m In
corp
orat
ed
Time, min
m/z 8128
R1R2R3
Vers l’analyse structurale in situ échange H/DTDXMS à partir de 3 régions différentes
Taux d’échange différent dans la région 3• Partenaires d’interaction différents?• Différente conformation?
Vers l’analyse structurale in situ échange H/DTDXMS à partir de 3 régions différentes
kexFast Slow
R1 0.0184 3.30E-03R2 0.0061 3.30E-03R3 0.0186 1.90E-03
• Scientifiques M. Salzet, M. Wisztorski, C.Meriaux, J-P. Gimeno, D.Mouajjah, J. Quanico, A. DesmonsB. Fatou, M. Duhamel, S. Devaux, P. Saudemont, T. Maulouet
• Cliniciens CHRU et COLProf. D. Vinatier, Prof. P. Collinet, Dr. J-P. LucotProf. E. Leblanc, Dr. F. Narducci, Dr. Y-M. Robin, Dr. I. Farré,
MENESR-Institut Universitaire de France (IUF Junior)
INCA-SIRIC ONCOLILLE , Grant INCA-DGOS-INSERM 6041aa
ANR-ANR Santé-Bien Etre CE17, REALITY’MS
INSERM-Programme PhysiCancer
MATWIN-Best Breakthrough Innovation Awards
Soutiens Financiers
ET MERCI POUR VOTRE ATTENTION…
Merci à
Remerciements
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