Mariana Velasquez Cano

Paula Andrea Pizarro Marín

DISRUPTION OF AMYLOID PLAQUES INTEGRITY AFFECTS

THE SOLUBLE OLIGOMERS CONTENT FROM ALZHEIMER

DISEASE BRAINS.Sebastian Jimenez1,2,4., Victoria Navarro1,2,4., Javier Moyano1,2,4, Marı´a Sanchez-Mico1,2,4, Manuel Torres1,2¤, Jose Carlos Davila3,4, Marisa Vizuete1,2,4,

Antonia Gutierrez 3,4" *, Javier Vitorica 1,2,4" *

1. Departamento Bioquı´mica y Biologı´a Molecular, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain, 2. Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS)-Hospital

Universitario Virgen del Rocı´o/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain, 3. Departamento Biologı´a Celular, Gene´tica y Fisiologı´a, Facultad de Ciencias, Instituto de

Investigacio´ n Biome´ dica de Ma´ laga (IBIMA), Universidad de Ma´ laga, Ma´ laga, Spain, 4. Centro de Investigacio´ n Biome´ dica en Red sobre Enfermedades

Neurodegenerativas (CIBERNED), Madrid, Spain

INTRODUCTION

ALZHEIMER DISEASE

Characterized by progressive

cognitive and behavioral deficits

Common symptoms

• Memory loss

• Confusion

• Impaired judment

• Personality changes

• desorientation

Jeffrey B. Halter, Joseph G. Ouslander, Mary E. Tinetti, Stephanie Studenski, Kevin P. High, Sanjay Asthana.(2009).Hazzard's Geriatric Medicine and Gerontology, 6e.Chapter 65. Dementia Including

Alzheimer's Disease

ALZHEIMER DISEASE

Late onset (sporadic AD)

• >60 years

• Associated with environmental

and genetic risk

APOE4: maybe influences the

aggregation of amyloid β- peptide

Early onset (familial AD)

• <60 years

• Has been linked to mutation in

the genes for

APP

PS1

PS2

Jeffrey B. Halter, Joseph G. Ouslander, Mary E. Tinetti, Stephanie Studenski, Kevin P. High, Sanjay

Asthana.(2009).Hazzard's Geriatric Medicine and Gerontology, 6e.Chapter 65. Dementia Including Alzheimer's Disease

• BRAAK I- II:

TRANSENTORHINALE

PHASE

• BRAAK III-IV:

LIMBISCHE PHASE

• BRAAK V- VI:

NEOKORTIKALE PHASE

Jimenez S, Navarro V, Moyano J, Sanchez-Mico M, Torres M, et al. (2014) Disruption of Amyloid

Plaques Integrity Affects the Soluble Oligomers Content from Alzheimer Disease Brains. PLoS ONE

9(12): e114041. doi:10.1371/journal.pone.0114041

The neuropathological hallmarks of AD

include

• Amyloid plaques

• Neurofibrillary tangles

AMYLOID PLAQUES

Β- AMYLOID

Is an amino-acid hydrophobic

peptide realeased from the

amyloid presursor protein APP

SENILE PLAQUE

OBJETIVE

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Analysed the Abeta content in the soluble fractions of the

hippocampus from human AD autopsy samples and

transgenic models in order to investigate the posible

repersussion of the homogenization protocols in the

soluble fraction preparation.

MATERIALES Y MÉTODOS

ANTICUERPOS

Proteínas de globulina que

reaccionan específicamente con el

antígeno que estimula su

producción

• Neutralizar toxinas y virus

• Activan el complemento

• Evitan fijación de microbios

• Capacidad catalítica

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MATERIALES Y MÉTODOS

30 muestras

humanas

BTIN IDIBELL

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MATERIALES Y MÉTODOS

FRACCIONES SOLUBLES

Preparación de lisados de cerebros

humanos

Homogeneizador

Dounce en TRIS SOBRENADANTE

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Amyloid Plaques Integrity Affects the Soluble Oligomers Content from Alzheimer

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MATERIALES Y MÉTODOS

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•Ruptura celular

•Verificación de purificación

de la proteína

•Lisis

•Homogenización

•Desintegración térmica

Extracción de proteínas

MATERIALES Y MÉTODOS

ELISA

(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Cuantificación de antígeno con anticuerpo

ELEMENTOS

• Fase solida

• Antígeno o anticuerpo

• Enzima

• sustrato

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MATERIALES Y MÉTODOS

• FASE SÓLIDA• Favorecen la adsorción

• Permiten fijación covalente

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MATERIALES Y MÉTODOS

• ENZIMA • Debe unirse fácilmente

• Debe tener un substrato cromogénico

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MATERIALES Y MÉTODOS

• SUSTRATO • No toxico ni mutagénico

• Fácil de manipular

• Bajo costo

• Sensibilidad/ especificidad

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MATERIALES Y MÉTODOS

ELISA

COMPETITIVA NO COMPETITIVA

MATERIALES Y MÉTODOS

•Ruptura del tejido/ célula

•Separación de la fracción deseada

•Diferencia de densidad

•Presencia de algún antígeno

Fracciones

MATERIALES Y MÉTODOS

WESTERN BLOTT

Se utiliza para detectar proteínas especificas

en una muestra determinada mediante

electroforesis en gel

MATERIALES Y MÉTODOS

• Tamaño de una proteína

• confirmar la presencia de

modificaciones post-traduccionales

como la fosforilación

• comparar cuantitativamente los

niveles de proteína entre muestras.

MATERIALES Y MÉTODOS

PCR

(reacción de cadena polimerasa)

CICLOS REPETITIVOS

DE

• Desnaturalización

• Unión

• Extensión

MATERIALES Y MÉTODOS

APLICACIONES • Clonaciones de fragmentos de DNA

• Detección de células tumorales

• Detección de secuencias sin purificación

previa

• Secuencia de ácidos nucleicos

• Establecimiento de polimorfismos

• Rastreo de mutaciones

MATERIALES Y MÉTODOS

DIFICULTADES• Falsos positivos por contaminación

• Costos

• Interpretación clínica puede ser

difícil

MATERIALES Y MÉTODOS

Se obtiene una fracción

Aislamiento de la placa amiloide

MATERIALES Y MÉTODOS

Nutrientes

carbohidratos

Inhibidores

Antibióticos

Factores de crecimiento

Colorantes e indicadores

RESULTADOS

Bajo contenido de oligomeros de abeta

soluble en pacientes con AD en la formación

hipocampal.

Se analizó el contenido de la abeta soluble

usando homogenización DOUNCE y ultra

centrifugación en BRAAK estadío V-VI y en el

control no demente BRAAK estadío II-IV.

RESULTADOS

FIGURA 1.B

Bajo contenido de oligomeros de abeta soluble en

pacientes con AD en la formación hipocampal.

Caracterización de las especies abeta utilizando western blots.

RESULTADOS

FIGURA 1.C

Bajo contenido de oligomero s de abeta soluble en

pacientes con AD en la formación hipocampal.

Mayor contenido de proteínas (100

microgramo de fracción soluble) en 6E10 ensayo de inmunoprecipitación.

RESULTADOS

FIGURA 2.A

El procedimiento de homogenización largamente

determinado del contenido de las especies abeta en la

fracción soluble.

Compararon los efectos de la homogenización y zonificación a diferentes intensidades.

Usaron la corteza cerebral de un raton transgénico con abundantes placas abeta.

Despues de la homogenizacion el TBS, MICROSOMAL se aislaron por centrifugacion. Y se extrajo el abeta con 2% SDS Y 4% SDS 8M urea..

RESULTADOS

FIGURA 2.A

El procedimiento de homogenización largamente

determinado del contenido de las especies abeta en la

fracción soluble.

RESULTADOS

FIGURA 2.E

El procedimiento de homogenización largamente

determinado del contenido de las especies abeta en la

fracción soluble.

Las placas fueron

aisladas por ultra

centrifugación en

sacarosa y fue

homogenizado por

DOUNCE o

zonificación.

RESULTADOS

FIGURA 3.A

Análisis bioquímico de los derivados de DOUNCE

en las fracciones solubles.

Se evaluó el protocolo de aislación usando (en adicion

del antibeta) anti soluble APP alfa anticuerpo, (como un

marcador del compartimeinto extraceluar), un anti ATP

SINTETASA beta (mitocondria) LC3I (CITOSOL) Y un

LC3II (marcado de vesículas autofagicas).

RESULTADOS

FIGURA 3.A

Análisis bioquímico de los derivados de

DOUNCE en las fracciones solubles.

RESULTADOS

FIGURA 3.C

Análisis bioquímico de los derivados de DOUNCE

en las fracciones solubles.

El PS1*APP muestras

corticales (12 meses)

fueron primero

homenizadas, con

DOUNCE, y ultrafugadas

en orden para eliminar

toda la abeta soluble

putativa. Lo que queda de

los granulos(contienen las

placas) fueron sujetas a un

segundo round de

homogenización usando

aunque DOUNCE O

ZONIFICACION

DISCUSSION

Author Review Agreement orDisagreement

Dohler F.et al.

¨Resported the presence of large amounts of

different soluble Abeta species, specialy ofhumas AD samples.¨

Sanchez-Varo R et al.

¨When the brain tissue is not manipulated the

abeta levels in the intereticial fluids are much

lowe than the obteined in the TBS extraccionalfraction¨.

DISCUSSION

Author Review Agreement orDisagreement

Hong, S.Et al.

¨Microdialysis showed the existence of low levels

of Abeta species¨.

¨Soluble fractions isolated using mild or strong

homenization approaches are nor representative

of the real Abeta content in the instersticial fluids,

and that only microdialysis, using large cutoff

membranes, may better represent the actualAbeta equilibrium in the IFS (intersticial fluid)¨.

Hong, S.Et al.

CONCLUSIONS

This study showed the principal objective that was to find out

how the different intensivities on the homeginazation will

permite a disruption in the amyloid plaques.

This discoveries are a new base for other investigators to

find new protocols to isolated the extracelualar soluble

fraction.

CONCLUSIONES

The Abeta peptide 42 increase the concentration at the same

time as the desease progression. It is important to know this,

because in future, investigations will be lead by this discovery

and will be more precise on finding the cure or the treatment

of alzheimer desease.

The difference between this study and the others might be

the brain regions that were used. It is important because all

regions are different and the acumalation of the plaques

are too.

Mariana Velásquez Cano

Thanks

BIBLIOGRAFIA

• Jimenez S, Navarro V, Moyano J, Sanchez-Mico M, Torres M, et al. (2014) Disruption of Amyloid Plaques Integrity Affects

the Soluble Oligomers Content from Alzheimer Disease Brains. PLoS ONE 9(12): e114041.

doi:10.1371/journal.pone.0114041

• Kim E, Barret, Scott Boitano, Susan M, Barman, Heddwen L. Brooks. “gagnon´s review of medical physiology” 24th Ed.

Charpter 15. Learning, momory, lenguaje and speech.

• Warren Levinson, MD, PhD.” Review of Medical Microbiology and Immunology”, 13Ed.