Jpn J Electroph 1994; 38: 133

〔シ ン ポ ジ ウ ム: ALPア イ ソ ザ イ ム 分 析 の 現 状 と今 後 の 展 望 〕

小腸ALPの 基質特異性とその役割

入野 勤＊・松下 誠 ＊・安藤克 己＊＊・山本 法＊＊

SUMMARY

The phosphohydrolytic activity in human liver, bone, term placenta and intestinal alkaline

phosphatases (ALPs) determined with phosphorylcholine (PC), phosphorylethanolamine, pyridoxal-5'-phosphate and p-nitrophenylphosphate at pH 8.8 was studied. In this process, the differencesin their enzymatic natures as apparent Km, Vmax/Km, transphosphorylation activity, aminoacid inhibition and susceptibility to Na2HPO4 were evaluated. The apparent Km value (0.9mM)of the intestinal ALP with PC showed the highest of all ALPS tested. Although intestinalALP hydrolysed PC the most, the affinity order of choline as a transphosphorylation acceptorwas liver/bone>intestinal≫placental ALP(s). In addition, the intestinal ALP activity with PC

was most susceptible to Na2HPO4 in the tested ALP. Furthermore, the intestinal ALP activityand phospholipid contents in the rat serum were well accorded to one another. Consequently,

present results suggest that the intestinal ALP may regulate a metabolism of choline/PC as partof phosphatidylcholine and/or phosphatidylcholine dependent synthesis of triglyceride.

Key words: intestinal alkaline phosphatase, phosphorylcholine, choline.

は じ め に

アル カ リ性ホス ファターゼ (ALP) は近年, ectoenzyme

として の本酵素 とそ の遊離機構1), ALP遺 伝子の クロー

ニ ング2), 低ALP血 症3)など基礎 と臨床 の両 面か ら追

求が なされてい る. またこれまで にALPと 骨代謝 との.

関連性4)や胎盤ALPと ヒ トIgGと の相互作 用5)が報告

されて いる. しか し未 だにALPの 真の基質お よび生理

的意義 については不明のままであ る. そ こで, 今回, 生

体 内の生理的基質 と考え られ るホ スホ リル コ リン (PC),

ホスホ リル エタノール ア ミン (PEA), ピ リドキサ ール

リン酸 (PLP) を用いて ヒ ト肝, 骨, 胎盤, 小 腸ALP

のpH 8.8に おけ るKm値, Vmax/Km値 お よび水解活

性 を比較検討 した. 次いで リン酸受容体 として のコ リン

の存在下 における リン酸転移活性, またPCが 基質の場

合の リン酸阻害な どについて検討 した. その結果, ALP

アイソザ イムの基質特異性 の違 いとPC/コ リンの 体 内

プール と脂質代謝 と の興 味 あ る 関連性 について報告す

る.

実験材料お よび方法

ヒ ト肝臓, 骨, 胎盤, 小腸 の各ALPア イソザ イムは

Koyama らの方法6)に従 って調製 した. PCを 用 いた時

のALP活 性測定法は, コ リンオキシダーゼ ・トリン

ダ ー試薬7)を用いて行 った. またPEA, PLPの 場合 は

Fiske・Subbarow 法 に基づ くp-メ チルア ミノフ ェノー

ル還元法 (ホス ファC-テ ス トワコー) を利用 した. リン

酸転移活性8)はp-ニ トロフェニル リン酸 (pNPP) か ら

コ リンへの リン酸転移活性 として測定 した. なお緩衝液

はと くに断わ らない限 り1mM MgCl2, 20μM Zn(CH3

Substrate specificity of intestinal ALP activity and its possible function.

＊ Tsutomu Irino, Makoto Matsushita; 埼 玉 県 立 衛 生 短 期 大 学 臨 床 化 学 教 室

＊＊ Katsumi Andoh, Sadamu Yamamoto; 同, 病 理 学 教 室

Correspondence address: Tsutomu Irino, Department of Clinical Chemistry, Saitama College of

Health, 519 Kamiohkubo, Urawa 338, Japan.

第44回 電 気 泳 動 学 会 総 会 ・シ ン ポ ジ ウ ム

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COO)2を 含む50mMベ ロナール緩衝液 (pH 8.8) を用

いた.

トリオ レインの投与実験には6週 齢の ウィスター ラッ

トのオ スを使用 した. 餌を水のみ としてか ら15時 間,

24時 間 および36時 間後の計3回, トリオ レイ ン (0.5

ml/体 重100g) を投与 し, 40時 間後に解剖 した. 次い

で肝臓 および小腸か らの組織抽出は Seetharam らの方

法9)に 従 って行 った. そのALP活 性 はpNPP法 (pH

10), タ ンパ ク量 はピロガ ロール レッ ド法 (マイクロTP

テス トワコー) で測定 し, 比活性を求めた. ポ リアク リ

ル ア ミドゲ ル電気泳動法 はわれわれ の方法でゲル を調製

し, デ ィス ク電気泳動 にて 行 った. ALP活 性バ ン ド

の検出には, 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate p-

toluidine 塩を含む試薬 (アル フォー, 常光) を使用 し

た.

実 験 結 果

1. pH 8.8に おけるALPア イソザイムのKm値,

Vmax/Km値, 水解活性

pH 8.8に おける各ALPア イ ソザイ ムのPC, PEA,

PLP, pNPPに 対す るKm値 お よびVmax/Km値 は,

Scatchard プ ロッ ト法で求 めて, その結 果を Table 1に

示 した. 小腸ALPのPCに 対す るKm値 (0.9mM) は,

4種 類の基質 に対 す る各 アイソザ イム の中で最 も大 き

く, 一方, 小腸ALPのpNPPに 対す るKm値 (0.01

mM) は最 も低値で あ った. またVmax/Km値 の うち小腸

ALPのPCに 対す るそれが最小で あるが, pNPPの 水

解活性に対す るPC水 解活性 の比は小腸ALPの それが

約2と 最大値を示 した (Fig. 1).

2. コ リンに対 するALPの リン酸転移活性

pH 8.8に おけるpNPPか ら リン酸 受容体へ の リン酸

転移活性 は, 400mMの コ リンの存在下 で測定 した. ま

ずpH 9.1～10.7 (50mM炭 酸 ・重炭酸緩衝液) の範囲 内

における各ALPの リン酸転移活 性の至適pH曲 線 は,

pNPP水 解活性 のそれ と合致 した. pNPP水 解活性 に対

す る リン酸転移活性の百分比 を リン酸転移率 とす ると,

各ALPの リン酸転移率 は約60～10%の 範囲内 と互 い

に異 なるものの, それ ぞれのALPの リン酸転移 率は

pHが 異 なって もほぼ一定で あ った.

次 にpNPP濃 度を2mMに 固定 して, コ リン濃度を

0～560mMの 範囲で変 えて, 各ALPの リン酸転移活 性

のKm値 とVmax/Km値 を求 めた (Fig. 2). その結果,

肝, 骨, 胎盤, 小腸ALPのKm値 (mM) は順に790,

250, 80, 310で あ った. また各Vmax/Km値 (min-1) は

1.6×10-4～5×10-5の 範囲内の値であ り, 胎盤ALPの

Km値 と速度定数 の値 は ともに最小 であ った. また肝 と

骨 のALPの リン酸転移率は どちらも560mMコ リン濃

度 で 約50%で あ り, しか もほぼ同 じ容量依存性 を示 し

た. しかし胎盤ALPの リン酸転移率 は10%以 下 と低

く, 最小 値であ った.

また500mMエ チ ル ア ミノ エタノール緩衝液 (pH

10.5) に コ リンを0～600mMの 濃度範囲 で 加 えて,

Table 1. Apparent Km, Vmax/Km values and relative activities of fourALP isozymes with pNPP, PLP, PEA and PC as substrates (pH 8.8).

The ratio means the relative Vmax which set up as 1.0 for the Vmax with pNPP as the

substrate. All data were obtained in duplicates and shown in their mean values.

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Fig. 1. Correlation between ALP activities for 20 human seradetermined with 2.0mM pNPP and/or 5.0mM PC in 50mMbarbital buffer (pH 8.8) containing 1.0mM MgCl2 and 20μM

Zn(CH3COO)2.

Regression analysis was performed except for the data from

Liver (L), bone (B), placenta (P) and intesinal (I) ALPs.

y=1.09x+0.48

r=0.991

x=11.9

y=13.4

n=20

Fig. 2. (A) The effect of various choline concentrations on intestinal ALP activities with

pNPP as the substrate and its transphosphorylation activities.Activities: ●, released p-nitrophenol; ○, released phosphate; ▲, released p-nitrophenol minus

phosphate. (B) Scatchard plot of the transphosphorylation activity in intestinal ALP.

A B

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pNPP水 解活性 を測定 した. その結果, コ リン無添加 の

活性 を100と す ると, 小腸ALP活 性は容量依存的 に増

加 し, 600mMコ リン添加で125で あ った. 一方, 胎盤

ALPは 小腸ALPと はま った く対照的 に600mMコ リ

ンの場合, 75で あ った. これは胎盤ALPの コ リンに対

す る高 い親和性 による競合阻害 と思われた. なお肝 と骨

のALP活 性 の変動は ほとんど認め られ なか った.

3. ALP活 性へ の リン酸 の影響

ALPのpH 8.8に おけ る リン酸, L-フ ェニルア ラニ

ンな どの添加に よるそ れ ぞ れ の 阻害効果 について検討

し, そ の結果 を Table 2に 示 した. ア ミノ酸お よび レ

バ ミゾール 阻害 の程度 は, 従来 の報告 どお り臓器特異型

と非特異型 のグル ープで ほぼ同 じ傾 向を示 した. しか し

12mM Na2HPO4存 在下での各ALP活 性 阻害度 (%)

は, pNPPが 基質 の場合, 肝, 骨, 小腸ALPは27%

以下, 胎盤ALPは80%で あった. 一方, PCの 場合,

肝, 骨ALPは56%以 下, 胎盤, 小腸ALPは90%

以上で あった. この小腸ALPの 両 基質に対す る リン酸

競合 阻害 の大 きな違 いは, 両者 のKm値 の大 きな差に基

づ くもの と推定 され た. そして小腸ALPの 生理的基質

が もし もPCな らば, 生体 内ALP活 性 は リン酸濃度 に

依存 して調節されて い ることが考 え られ る.

4. トリオ レイ ン投与後のラ ッ ト血清 脂質 レベルと組

織ALP比 活性 の変動

トリオ レイン投与実験で得 られた ラ ッ ト血清中の トリ

グ リセ ライ ド (TG, mg/dl) と リン脂質 (PL, mg/dl) の

平均 値は, 対 照群 (n=5) で51と121で あ った. 一方,

投 与群 (n=5) のそれは628 (p<0.01) と212 (p<0.01)

であ った. また血清ALPア イソザ イムのデ ィスク電気

泳動に よる解析の結果, 投与群は対照群 に比 べ 明 らか

に小腸ALPが 増加 していた (Fig. 3). これは Young

ら10)や Day ら11)の脂質摂取 によって血清ALP活 性 が

増加す る結果 とよ く符合 した. また肝 と小腸ALPの 対

照群 の比活性 (U/mg) は0.019と21.1で あ り, 投与群

のそれ は0.024 (p<0.1) と44.2 (p<0.01) で あった.

す なわ ち, トリオ レイ ンは小腸ALPの 比活性 ばか りで

な く, 肝ALPの 比活性 も上昇 させ る傾向が認 め られ

た.

考 察

まずpH 8.8に おける各ALPア イソザ イムとPC,

PEA, PLPと の反応性 の関係につ いては, pNPPの そ

れ と比較 して検討 した. 小腸ALPのPCに 対す るKm

値, Vmax/Km値 および水解活性 は他 のALPア イソザ イ

ムとは明 らか に異 なる性状 を示 した. また小腸ALPの

コ リン存在下で の リン酸転移率 などの性状は, とくに胎

盤ALPの それ とは大 き く異な った. さらにPCあ るい

はpNPPが 基質 の と き の リン酸に よる阻害度は小 腸

ALPの 場合, 両者 に大 きな差 が認 め られた. しか し胎

盤ALPで はどち らも80%以 上の阻害度 であった. 以

上の小腸ALPの と くに胎盤ALPと 明 らかに異 な る

PCと コ リンに対 す る性 状は, コ リンが ラッ ト小腸ALP

の活性部位 に影響 を及 ぼす12)ことや, コ リンが ラッ ト刷

子縁ALPと 膜 中の リン酸基 との阻害作用に対す る保護

に関係 す る とい う報告13)と深 い関連性が あると思われ

た. そ して ヒ ト血清 コ リン濃度が100μmol/l程 度に維

Table 2. Susceptibility of ALPs to inactivation by Na2HPO4,

L-homoarginine, L-phenylalanine and levamisole.

1) Assay conditions used were 50mM barbital buffer (pH 8.8) in the

presence of 1mM MgCl2 and 20μM Zn(CH3COO)2.

2) Assay conditions used were 0.5M ethylaminoethanol buffer (pH 10.0)

in the presence of 1mM MgCl2.

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持 されてい るのは, ALP活 性 がコ リンの腸肝循環 およ

び尿 細管での再吸収 に関係 して いる もの と示 唆 された.

ラッ トに トリオ レイ ンを投与 した とき, 小腸ALPの

比活性ばか りで な く肝ALPの 比活性 も上昇 し, しか も

血清TG値 に加えて血清PL値 も増加 した. この傾向

は レシチ ン投与で も認 められた (デー タ未発表). 従来,

コ リン欠乏 が脂肪肝 を引 き 起 こす こ と14), 肝ALP活

性 の上昇 と胆汁中 へ の コ リンと リン脂質の 排 出量 の上

昇15), あ るいは脂肪食 にPLを 加え ると小腸 における

TG吸 収が増加す る16)ことが報告 されてい る. さらに脂

肪食後 の血清小腸ALP活 性 の上昇10,11), 胆管結紮後の

肝 と小腸ALP比 活性 の上昇9), TG代 謝 と小腸ALP

とPLを 含む surfactant-like particle の分泌 との関連

性17)が報 告 されてい る.

以上, 本 研究 の成績 とコ リンが腸肝循環 を行 って いる

可能 性などを加 味す ると, 小腸 と肝 のALPは 互 いに協

調 してPC/コ リンの体 内プール とこれ が 関与す る脂質

代 謝に関係 して い る可能性が高 いもの と思 われ る.

稿 を終 え るにあた り, 抗 ラッ トALP抗 体 の提供 およ

び貴重な ご助言 をいただ きま した埼玉 医科大学第一生化

学教 室の坂岸良克教授 と菰 田二一助教授 に深 謝いた しま

す.

Fig. 3. (A) ALP isozyme patterns in the serum from rat fed with triolein 0.5ml/100g bodyweight.

(B) Antigenicities of rat serum ALPs treated with anti-rat ALP antibodies and/or levamisole.

文 献

1) Alpers DH, Eliakim R, DeSchryver-KecskemetiK. Secretion of hepatic and intestinal alkaline

phosphatases: similarities and differences.

Clin Chim Acts. 1990; 186: 211-23.2) Whyte MP. Alkaline phosphatase: physical

role explored in hypophosphatasia. In: Wil-liam AP, editor. Bone and mineral research.Amsterdam: Elsevier Science Publishers,1989: 175-218.

3) Henthorn PS, Raducha M, Kadesch T, WeissMJ, Harris H. Sequence and characterizationof the human intestinal alkaline phosphatase

gene. J Biol Chem 1988; 263: 12011-9.4) Whyte MP. Alkaline phosphatase and the

measurement of bone formation. In: FrameB, Potts JT, editors. Clinical disorders ofbone and mineral metabolism. Amsterdam:Jr. Excerpta Medica, 1983: 120-124.

5) Makiya R, Stigbrand T. Placental alkaline

phosphatase is related to human IgG inter-nalization in HEp 2 cells. Biochem BiophyRes Commun 1992; 182: 624-30.

6) Koyama I, Miura M, Matsuzaki H, SakagishiY, Komoda T. Sugar chain heterogeneity ofhuman alkaline phosphatase: Difference be-tween normal and tumor-associated isozymes.J Chromatogr 1987; 413: 64-78.

7) Irino T, Matsushita M, Komoda T, SakagishiY. Apparent alkaline phosphatase activity inserum measured with phosphorylcholine assubstrate. Clin Chem 1991; 37: 479.

8) Stinson RA, McPhee JL, Collier HB. Phos-

photransferase activity of human alkaline phos-phatases and the role of enzyme Zn2+. Bio-chim Biophy Acta 1987; 913: 272-8.

9) Seetharam S, Sussman NL, Komoda T, AlpersDH. The mechanism of elevated alkaline phos-

-17-

生 物 物 理 化 学 1994; 38: 138

phatase activity after bile duct ligation in therat. Hepatology 1986; 6: 374-80.

10) Young GP, Friedman S, Yedlin ST, AlpersDH. Effect of fat feeding on intestinal alka-line phosphatase activity in tissue and serum.Am J Physiol 1981; 241: G 461-8.

11) Day AP, Feher MD, Chopra R, Mayne PD.Triglyceride fatty acid chain length influencesthe post prandial rise in serum intestinal alka-line phosphatase activity. Ann Clin Biochem1992; 29: 287-91.

12) Seetharam B, Tiruppathi C, Alpers DH. Mem-brane interaction of rat intestinal alkaline

phosphatase: Role of polar head groups. Bio-chemistry 1985; 24: 6603-8.

13) Tiruppathi C, Alpers DH, Seetharam B. Therole of choline on the activity-temperature re-

lationship of brush-border alkaline phospatase.Biochim Biophy Acta 1987; 898: 283-92.

14) Haubrich DR, Wang PEL, Chippendale T,Proctor E. Choline and acetylcholine in rat:Effect of dietary choline. J Neurochem 1976;27: 1305-13.

15) Pekarthy JM, Short J, Lansing AI, LiebermanI. Function and control of liver alkaline phos-

phatase. J Biol Chem 1972; 247: 1767-74.16) Parlier RD, Frase S, Mansbach CM II. Intra-

enterocyte distribution of absorbed lipid andeffects of phosphatidylcholine. Am J Physiol1989; 256: G 349-55.

17) Eliakim R, Becich MJ, Green K, Alpers DH.Developmental expression of intestinal surfac-tant-like particles in rats. Am J Physiol 1991;261: G 269-79.

-18-