adeli 1983 plant physiol role of er in oat globulin bio synthesis

8/6/2019 Adeli 1983 Plant Physiol Role of ER in Oat Globulin Bio Synthesis

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 8 3 ) 7 3 , 9 4 9 - 9 5 50 0 3 2 - 0 8 8 9 / 8 3 / 7 3 / 0 9 4 9 / 0 7 / $ 0 0 . 5 0 / 0

R o l e o f E n d o p l a s m i c R e t i c u l u m i n B i o s y n t h e s i s o f O a t G l o b u l i nP r e c u r s o r s 'R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n May 2 5 , 1 9 8 3 a n d i n r e v i s e d f o r m A u g u s t 1 2 , 1 9 8 3

KHOSROW A D E L I AND I L L I M A R A L T O S A A RD e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o f O t t a w a , O t t a w a , O n t a r i o , C a n a d a KIN 9 B 4ABSTRACT

O a t ( A v e n a s a t i v a L . ) g r o a t s w e r e l a b e l e d w i t h r a d i o a c t i v e l e u c i n e a n ds a l t - s o l u b l e p r o t e i n s w e r e e x t r a c t e d a n d a n a l y z e d . P o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s f o l l o w e d b y f l u o r o g r a p h y i n d i c a t e d t w o r a d i o a c t i v e p o l y -p e p t i d e s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t 5 8 t o 6 2 k i l o d a l t o n s w h i c h w e r e s i m i l a ri n s i z e t o u n r e d u c e d g l o b u l i n a - , 8 d i m e r s . T h e r o l e o f e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m i n t h e s y n t h e s i s o f t h e s e g l o b u l i n p o l y p e p t i d e s w a s i n v e s t i g a t e db y i n v i v o a n d i n v i t r o p r o t e i n s y n t h e s i s s t u d i e s . L a b e l e d t i s s u e w a sf r a c t i o n a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m w a si s o l a t e d . Two p o l y p e p t i d e s w h i c h h a d m o l e c u l a r w e i g h t s o f 5 8 t o 6 2k i l o d a l t o n s a n d w e r e i m m u n o p r e c i p i t a b l e w i t h a n t i g l o b u l i n i m m u n o g l o b -u l i n G w e r e f o u n d t o b e t r a n s i e n t l y a s s o c i a t e d w i t h t h e e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m . R o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , a s w e l l a s m e m b r a n e - b o u n dp o l y s o m e s , d i r e c t e d t h e i n v i t r o s y n t h e s i s o f t w o p o l y p e p t i d e s w i t hm o l e c u l a r w e i g h t 5 8 t o 6 2 k i l o d a l t o n s c o r r e s p o n d i n g i n s i z e t o u n r e d u c e da - # d i m e r s a n d c o u l d b e i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h a n t i g l o b u l i n i m m u n o -g l o b u l i n G . T h e t r a n s l a t i o n p r o d u c t s o f f r e e p o l y s o m e s d i d n o t s h o w t h i s .I n p u l s e - l a b e l i n g , g l o b u l i n p o l y p e p t i d e s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t 5 8 t o 6 2k i l o d a l t o n s , a s w e l l a s t h e a + , s u b u n i t s , w e r e l a b e l e d i n p r o t e i n b o d i e s .T h e d a t a s u g g e s t t h a t o a t g l o b u l i n p o l y p e p t i d e s a r e s y n t h e s i z e d a sh i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t p r e c u r s o r s o n E R - a s s o c i a t e d p o l y s o m e s . T h e s ep r e c u r s o r s a r e p r o b a b l y t r a n s p o r t e d i n t o p r o t e i n b o d i e s a n d c l e a v e d i n t os m a l l e r a a n d , B s u b u n i t s .

O a t s e e d s b e g i n t o s y n t h e s i z e a g r o u p o f s a l t - s o l u b l e g l o b u l i np o l y p e p t i d e s d u r i n g d e v e l o p m e n t f r o m 9 d a f ; 2 t h e r e a f t e r , t h e s eg l o b u l i n s a r e p r e d o m i n a n t i n t h e s e e d s a m o n g t h e f o u r O s b o r n ef r a c t i o n s ( 1 8 , 2 1 ) . A t m a t u r i t y , t h e g l o b u l i n f r a c t i o n c o n s t i t u t e su p t o 7 5 % o f t o t a l o a t p r o t e i n i n t h e g r o a t ( 1 8 , 2 0 ) . T h i s i s au n i q u e c h a r a c t e r i s t i c o f o a t s i n c e o t h e r c e r e a l s s u c h a s w h e a t ,b a r l e y , r y e , a n d m a i z e c o n t a i n a l c o h o l - s o l u b l e p r o l a m i n s a s t h em a j o r s t o r a g e p r o t e i n f r a c t i o n ( 1 4 ) . O a t g l o b u l i n i s f o u n d i nm a t u r e g r a i n a s a 1 2 S m u l t i m e r i c m o l e c u l e w i t h a n a v e r a g e m o lw t o f 3 4 8 , 0 0 0 ( 1 7 ) . T h i s m o l e c u l e c o n s i s t s o f 6 d i m e r s , e a c hd i m e r c o n t a i n i n g a 3 5 ( a ) a n d a 2 2 ( 1 3 ) kD s u b u n i t ( 1 7 ) . T h e aa n d 1 s u b u n i t s a r e a p p a r e n t l y l i n k e d t h r o u g h d i s u l f i d e b o n d s t of o r m a d i m e r m o l e c u l e w i t h a v e r a g e m o l w t 5 8 , 0 0 0 ( 3 , 1 2 , 2 1 ) .O a t s e e d p o l y s o m e s , w h e n t r a n s l a t e d i n v i t r o , g i v e r i s e t o t w og l o b u l i n p o l y p e p t i d e s ( 6 0 - 6 2 k D ) w h i c h a r e i m m u n o p r e c i p i t a b l ew i t h g l o b u l i n a n t i b o d i e s ( 4 , 1 2 , 2 3 , 2 6 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t p o s t -

' T h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y a n A g r i c u l t u r e C a n a d a R e s e a r c hC o n t r a c t N o . O S U 8 1 - 0 0 4 1 1 a n d b y N a t u r a l S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n gR e s e a r c h C o u n c i l g r a n t A 6 7 1 1 .2 A b b r e v i a t i o n s : k D , k i l o d a l t o n ; I g G , i m m u n o g l o b u l i n G ; S D S - P A G E ,s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ; d a f , d a y s a f t e rf l o w e r i n g .

t r a n s l a t i o n a l p r o c e s s i n g o f 6 0 t o 6 2 kD p r e c u r s o r s o c c u r s t o y i e l dt h e a a n d , B s u b u n i t s . I n v i v o l a b e l i n g s t u d i e s h a v e a l s o s h o w nt h e a p p e a r a n c e o f 5 8 t o 6 2 kD p o l y p e p t i d e s a f t e r s h o r t - p e r i o dl a b e l i n g o f o a t c a r y o p s e s ( 4 ) .RER i s t h o u g h t t o b e t h e s i t e o f s y n t h e s i s f o r l e g u m e r e s e r v ep r o t e i n s ( 2 ) . R e c e n t e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a t p e a l e g u m i n i s s y n -t h e s i z e d o n t h e RER a n d t r a n s p o r t e d i n t o p r o t e i n b o d i e s , w h e r ei t i s p r o c e s s e d i n t o s m a l l e r a c i d i c a n d b a s i c s u b u n i t s ( 6 ) . S o y b e a ng l y c i n i n ( 2 5 ) a n d r i c e g l u t e l i n ( 2 7 ) h a v e a l s o b e e n s h o w n t o b es y n t h e s i z e d o n m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o s o m e s . I n c e r e a l s ,h o w e v e r , t h e p r o c e s s o f s t o r a g e p r o t e i n b i o s y n t h e s i s i s n o t a sc l e a r . M i f l i n e t a l . ( 1 5 ) h a v e d i s c u s s e d s e v e r a l h y p o t h e s e s a n ds u g g e s t e d t h a t t h e s t o r a g e p r o t e i n s o f s t a r c h y e n d o s p e r m a r es y n t h e s i z e d o n t h e R E R , a n d a g g r e g a t e i n t o c l u m p s w i t h i n i t ;t h e s e c l u m p s e i t h e r b r e a k a w a y f r o m t h e RER t o f o r m p r o t e i nb o d i e s ( w h e a t , b a r l e y ) o r a g g r e g a t e i n t o s p h e r i c a l d e p o s i t s w h i c ha c c u m u l a t e w i t h i n t h e RER w h i c h c o m p l e t e l y s u r r o u n d s t h e m( m a i z e ) . L i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e p a t h w a y b y w h i c h g l o b u l i np o l y p e p t i d e s a r e s y n t h e s i z e d , p r o c e s s e d , a n d d e p o s i t e d i n d e v e l -o p i n g o a t e n d o s p e r m . U s i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y , S a i g o e t a l .( 2 4 ) o b s e r v e d t h e d e v e l o p m e n t a n d f o r m a t i o n o f p r o t e i n b o d i e si n d e v e l o p i n g o a t s e e d s a n d t h e y h a v e s u g g e s t e d t h a t i n t h e c e l l so f t h e s u b a l e u r o n e l a y e r ( s t a r c h y e n d o s p e r m ) , p r o t e i n s a r e s y n -t h e s i z e d o n t h e R E R , i n s e r t e d i n t o t h e RER c i s t e r n a e , a n d l a t e rt r a n s p o r t e d i n t o v a c u o l e s . T h i s p r o c e s s w a s n o t o b s e r v e d i n t h ea l e u r o n e l a y e r . S u c h o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t t h e RER may b et h e s i t e o f s t o r a g e p r o t e i n b i o s y n t h e s i s i n d e v e l o p i n g o a t e n d o -s p e r m . We h a v e f o u n d t h a t o a t g l o b u l i n p r e c u r s o r s a r e s y n t h e -s i z e d o n R E R . O u r d a t a s u g g e s t t h a t t h e s e p r e c u r s o r s a r e l a t e rp r o c e s s e d i n p r o t e i n b o d i e s .

MATERIALS AND M ET HODSP l a n t M a t e r i a l . O a t ( A v e n a s a t i v a L . c v H i n o a t ) p l a n t s w e r eg r o w n a t t h e O t t a w a R e s e a r c h S t a t i o n , A g r i c u l t u r e C a n a d a i nt h e summer o f 1 9 8 2 . T h e d e v e l o p i n g s p i k e l e t s w e r e h a r v e s t e d 1 8t o 2 0 d a f . F o r i n v i v o l a b e l i n g e x p e r i m e n t s a n d ER i s o l a t i o n ,g r o a t s w e r e d e h u l l e d m a n u a l l y a n d u s e d i m m e d i a t e l y . O a t g r o a t s

w e r e o b t a i n e d i n l a r g e s c a l e b y m e c h a n i c a l d e h u l l i n g a s d e s c r i b e de l s e w h e r e ( 7 ) a n d s t o r e d a t - 8 0 C f o r p o l y s o m e a n d RNAe x t r a c t i o n s .C h e m i c a l s . R a d i o c h e m i c a l s w e r e o b t a i n e d f r o m New E n g l a n dN u c l e a r , M o n t r e a l , C a n a d a . L - [ 3 H ] l e u c i n e , L [ U - ' 4 C ] l e u c i n e , a n dL - [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e h a d s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t i e s o f 1 4 3 C i / m m o l ,3 4 0 m C i / m m o l , a n d 4 0 0 m C i / m m o l , r e s p e c t i v e l y . R e a g e n t s f o rSDS-PAGE o f p o l y p e p t i d e s w e r e p u r c h a s e d f r o m B i o - R a d L a b -o r a t o r i e s , M i s s i s s a u g a , C a n a d a . O t h e r c h e m i c a l s w e r e o b t a i n e df r o m S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y .I n V i v o P r o t e i n S y n t h e s i s . D e v e l o p i n g o a t s e e d s ( 1 8 - 2 0 d a f )w e r e d e t a c h e d a n d p l a c e d o n a d r o p o f 2 0 , u l s o l u t i o n c o n t a i n i n g2 g C i [ ' 4 C ] l e u c i n e , a n d i n c u b a t e d f o r 5 0 m i n a t 2 0 C . R e p e a t e de x p e r i m e n t s w i t h d e t a c h e d s e e d s a n d t h e w h o l e s p i k e l e t s ( 2 - 3cm l o n g ) s h o w e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e n a t u r e o f t h e i n9 4 9


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ADELI AND ALTOSAARv i v o l a b e l e d p r o t e i n s . A f t e r 5 0 m i n , t h e s e e d s a b s o r b e d t h er a d i o a c t i v e s o l u t i o n . I n s o m e e x p e r i m e n t s , t h e s e e d s were i n c u -b a t e d f u r t h e r i n 1 0 0 - M l d i s t i l l e d H20 f o r v a r i o u s p e r i o d s o f t i m e .T h e l a b e l e d s e e d s were t h e n u s e d f o r t h e i s o l a t i o n o f ER a n dp r o t e i n b o d i e s a s d e s c r i b e d b e l o w . R a d i o a c t i v i t y i n c o r p o r a t e di n t o p r o t e i n w a s d e t e r m i n e d b y s p o t t i n g I 0 - ; d a l i q u o t s o f s a m p l e so n a p i e c e o f c h r o m a t o g r a p h y p a p e r , t r e a t i n g t h e p a p e r w i t h 1 0 %( w / v ) T C A , d r y i n g a n d c o u n t i n g i n a l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r .T h e e f f i c i e n c y o f [ ' 4 C ] l e u c i n e i n c o r p o r a t i o n w a s a b o u t 21%( 9 5 0 , 0 0 0 d p m / 2 , C i ) .S u b c e l l u l a r I s o l a t i o n s . D e v e l o p i n g s e e d s ( 0 . 5 g ) l a b e l e d w i t h' 4 C ] l e u c i n e were h o m o g e n i z e d i n 12 % ( w / v ) s u c r o s e c o n t a i n i n g1 0 0 mm T r i s - H C l , pH 8 . 6 , 3 0 mM K C l , 1 mm EDTA ( m e d i u mA ) . T h e h o m o g e n a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 5 0 0 g f o r 1 0 m i n . T h es u p e r n a t a n t w a s a p p l i e d t o a S e p h a r o s e 4B c o l u m n e q u i l i b r a t e di n m e d i u m A ( 2 ) t o s e p a r a t e o r g a n e l l e s f r o m t h e s o l u b l e p r o t e i n sa n d s m a l l m o l e c u l e s . T h e o r g a n e l l e s e l u t e i n t h e v o i d v o l u m e o ft h e c o l u m n . T h e m o s t l i g h t s c a t t e r i n g f r a c t i o n s were p o o l e d andl a y e r e d o n a l i n e a r 1 6 % t o 50% ( w / v ) s u c r o s e g r a d i e n t ma de upi n m e d i u m A ( 1 mm E D T A ) . C e n t r i f u g a t i o n w a s f o r 2 h a t 4 Ca t 1 5 0 , 0 0 0 g i n a SW 4 1 r o t o r o f a Beckman u l t r a c e n t r i f u g e . Theg r a d i e n t s were f r a c t i o n a t e d a n d m o n i t o r e d a t 2 8 0 nm u s i n g anI S C O f l o w c e l l i n a UA5 o p t i c a l u n i t . F r a c t i o n s were t e s t e d f o renzyme a c t i v i t i e s a n d e x a m i n e d f o r r a d i o a c t i v i t y a s d e s c r i b e db e l o w .F r a c t i o n s r i c h i n ER were i s o l a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n o n 16%a n d 35% ( w / v ) d i s c o n t i n u o u s s u c r o s e g r a d i e n t s . I n t h i s p r o c e -d u r e , m o s t o f t h e NADH-Cyt c r e d u c t a s e a c t i v i t y c o u l d b er e c o v e r e d b e t w e e n t h e 1 6 % a n d 35% ( w / v ) s u c r o s e , w h i c h w i l ls u b s e q u e n t l y b e r e f e r r e d t o a s t h e 1 6 / 3 5 i n t e r f a c e . Th e l a b e l e ds e e d s were h o m o g e n i z e d a n d p r e p a r e d f o r c e n t r i f u g a t i o n a sd e s c r i b e d a b o v e . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n a t 1 5 0 , 0 0 0 g f o r 9 0 m i n ,t h e o r g a n e l l e s v i s i b l e a t t h e 1 6 / 3 5 i n t e r f a c e were c o l l e c t e d anda n a l y z e d b y SDS-PAGE a n d f l u o r o g r a p h y e i t h e r b e f o r e or a f t e ri m m u n o c h r o m a t o g r a p h y o n g l o b u l i n - I g G - S e p h a r o s e ( s e e b e l o w ) .D i s c o n t i n u o u s a n d l i n e a r s u c r o s e g r a d i e n t s were b o t h u s e d f o rt h e i s o l a t i o n o f RER. L i n e a r g r a d i e n t s o f 16% t o 50% ( w / v ) a n ds t e p g r a d i e n t s o f 2 0 % , 3 5 % , a n d 5 0% ( w / v ) sucrose ( i n a b u f f e rc o n t a i n i n g 4 0 mM T r i s - H C l , pH 8 . 6 , 3 0 mm K C I , a n d 1 0 mmM g a c e t a t e ) were u s e d . D e v e l o p i n g s e e d s were h o m o g e n i z e d i n1 0 0 mm T r i s - H C l , pH 8 . 6 , 5 0 mM K C l , 1 0 mm M g a c e t a t e .M a g n e s i u m s a l t w a s a d d e d i n o r d e r t o r e t a i n t h e r i b o s o m e s o nER ( 1 9 ) . A f t e r a 1 0 - m i n s p i n a t 1 , 0 0 0 g , t h e s u p e r n a t a n t s werel a y e r e d o n t h e l i n e a r or s t e p g r a d i e n t s a n d c e n t r i f u g e d a t 4 C f o r9 0 m i n a t 3 2 , 0 0 0 g i n a SW 4 1 T i r o t o r o f a Beckman u l t r a c e n -t r i f u g e . L i n e a r g r a d i e n t s were f r a c t i o n a t e d a n d t h e f r a c t i o n s weret e s t e d f o r NADH-Cyt c r e d u c t a s e a c t i v i t y . Th e f r a c t i o n s w i t h t h eh i g h e s t enzyme a c t i v i t y ( d e n s i t y o f 1 . 1 5 g / c m 3 ) were c o l l e c t e d ,t r e a t e d w i t h 1% ( w / v ) T r i t o n X - 1 0 0 , a n d u s e d f o r p o l y s o m ei s o l a t i o n ( s e e b e l o w ) . I n t h e c a s e o f s t e p g r a d i e n t s , o r g a n e l l e s a tv a r i o u s i n t e r f a c e s ( s u p e m a t a n t / 2 0 , 2 0 / 3 5 , 3 5 / 5 0 ) a n d s u p e r n a -t a n t were c o l l e c t e d a n d u s e d f o r p o l y s o m e e x t r a c t i o n s .E x t r a c t i o n a n d T r a n s l a t i o n o f F r e e a n d Membrane-BoundP o l y s o m e s . P o l y r i b o s o m e s were e x t r a c t e d b y a m o d i f i c a t i o n o ft h e m e t h o d d e s c r i b e d p r e v i o u s l y f o r b a r l e y e n d o s p e r m s ( 1 4 ) .F r e e a n d m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s w e r e s u s p e n d e d i n t r a n s -l a t i o n b u f f e r ( 2 0 mm H e p e s , pH 7 . 6 , 1 0 0 mM K C l , 4 mm M ga c e t a t e , 1 mM D T T ) . B o t h p o l y s o m e p r e p a r a t i o n s w e r e t r a n s l a t e di n v i t r o i n a w h e a t germ e x t r a c t , a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 2 ) . I nv i t r o t r a n s l a t i o n p r o d u c t s were a n a l y z e d b y SDS-PAGE andf l u o r o g r a p h y ( s e e b e l o w ) .I s o l a t i o n o f P o l y - A d e n y l a t e d RNA. Membrane-bound p o l y -s o me s were d i s s o c i a t e d w i t h SDS and p o l y A ' RNA f r a c t i o n w a si s o l a t e d b y o l i g o d ( T ) - c e l l u l o s e column c h r o m a t o g r a p h y as d e -s c r i b e d b y M a t t h e w s and M i f l i n ( 1 4 ) . The y i e l d o f p o l y A ' RNAwas 4 a g / m g po ly s o me.

A n a l y s i s o f P r o t e i n s b y SDS-PAGE. SDS-PAGE w a s p e r -

f o r m e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f L a e m m l i ( 8 ) . G e l s w e r ec o m p o s e d o f 5% ( w / v ) s t a c k i n g a n d 1 2 % o r 1 4 % ( w / v ) r e s o l v i n gg e l s . E l e c t r o p h o r e s i s w a s a t 6 0 v f o r 1 6 h . T h e g e l s w e r e f i x e da n d s t a i n e d w i t h 0 . 2 % C o o m a s s i e B l u e G - 2 5 0 , i n 1 0 % ( w / v )T C A , 4 0 % ( v / v ) m e t h a n o l . A f t e r d e s t a i n i n g i n 1 0 % a c e t i c a c i d ,4 0 % ( v / v ) m e t h a n o l , t h e g e l s w e r e t r e a t e d w i t h E n h a n c e ( N e wE n g l a n d N u c l e a r ) , d r i e d , a n d e x p o s e d t o K o d a k X - O m a t AR 5f i l m . P h o s p h o r y l a s e b ( 9 4 0 0 0 ) , a l b u m i n ( 6 7 0 0 0 ) , o v a l b u m i n( 4 3 0 0 0 ) , c a r b o n i c a n h y d r a s e ( 3 0 0 0 0 ) , t r y p s i n i n h i b i t o r ( 2 0 1 0 0 ) ,a n d a - l a c t a l b u m i n ( 1 4 4 0 0 ) w e r e u s e d a s m o l w t s t a n d a r d s .I s o l a t i o n o f P r o t e i n B o d i e s . P r o t e i n b o d i e s w e r e i s o l a t e d a sd e s c r i b e d b y C h r i s p e e l s e t a l . ( 6 ) . P u l s e - l a b e l e d s e e d s w e r ec h o p p e d f i n e l y w i t h a r a z o r b l a d e i n a P e t r i d i s h w i t h 2 m l o f1 2 % s u c r o s e , 2 m M M g C l 2 , a n d t h e e x t r a c t w a s f i l t e r e d t h r o u g hM i r a c l o t h . T h e f i l t r a t e w a s l o a d e d o n a 2 m l c u s h i o n o f 1 6 %s u c r o s e , 2 m M M g C l 2 , a n d s p u n a t 1 , 0 0 0 g f o r 1 0 m i n i n aB e c k m a n SW 6 0 T i r o t o r . T h e p e l l e t c o n t a i n e d more t h a n 8 0 %o f t h e t o t a l s e e d p r o t e i n a s d e t e r m i n e d b y t h e d y e - b i n d i n g a s s a y( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s ) .I m m u n o l o g i c a l T e c h n i q u e s . T h e p r e p a r a t i o n o f o a t g l o b u l i na n t i b o d i e s w a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 1 2 ) . T h e i m m u n o p r e c i p i t a -t i o n o f i n v i t r o s y n t h e s i z e d p r o d u c t s w a s c o n d u c t e d a c c o r d i n g t oR o b e r t s a n d L o r d ( 2 2 ) . A d i f f e r e n t t e c h n i q u e w a s u s e d t o e x -a m i n e t h e i n v i v o l a b e l e d p o l y p e p t i d e s f o u n d i n t h e E R . A n t i -b o d i e s r a i s e d a g a i n s t m a t u r e g l o b u l i n w e r e c o v a l e n t l y c o u p l e d t oC N B r - a c t i v a t e d S e p h a r o s e 4 B a s r e c o m m e n d e d b y P h a r m a c i a .ER f r a c t i o n s i s o l a t e d w i t h d i s c o n t i n u o u s s u c r o s e g r a d i e n t s w e r et r e a t e d w i t h 1 % T r i t o n X - 1 0 0 a n d a p p l i e d t o a g l o b u l i n I g G -S e p h a r o s e c o l u m n . T h e c o l u m n w a s w a s h e d e x t e n s i v e l y w i t h 2 0m M N a H 2 P O 4 - N a 2 H P O 4 , pH 7 . 4 , 0 . 1 5 M N a C l , 2% ( v / v ) T r i t o nX - 1 0 0 . B o u n d p o l y p e p t i d e s w e r e e l u t e d w i t h 5% SDS a t 3 7 C .T h e e l u a n t w a s l y o p h i l i z e d a n d e x t r a c t e d w i t h a c e t o n e , t r i e t h y l -a m i n e , a c e t i c a c i d , H 2 0 ( 8 5 : 5 : 5 : 5 ) , t o remove t h e e x c e s s S D Sb e f o r e a n a l y z i n g i t b y S D S - P A G E .E n z y m e A s s a y s . N A D H - C y t c r e d u c t a s e w a s a s s a y e d a s d e -s c r i b e d b y B o l l i n i a n d C h r i s p e e l s ( 1 ) . S u c c i n a t e d e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y w a s t e s t e d u s i n g t h e m e t h o d o f P e n n i n g t o n ( 1 6 ) .E x t r a c t i o n o f T o t a l G l o b u l i n F r a c t i o n . S a l t - s o l u b l e g l o b u l i nw a s e x t r a c t e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y b y R o b e r t e t a l . ( 2 1 ) .

RESULTSI n V i v o S y n t h e s i s o f O a t G l o b u l i n P o l y p e p t i d e s . To i n v e s t i g a t et h e b i o s y n t h e s i s o f o a t g l o b u l i n i n d e v e l o p i n g o a t g r o a t s , a n i nv i v o r a d i o a c t i v e l a b e l i n g e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d ( F i g . 1 ) .D e v e l o p i n g g r o a t s w e r e l a b e l e d w i t h [ ' 4 C ] l e u c i n e f o r 1 5 0 m i n .T h e s a l t - s o l u b l e g l o b u l i n w a s e x t r a c t e d a n d a n a l y z e d b y S D S -PAGE u n d e r r e d u c i n g c o n d i t i o n s , a n d c o m p a r e d w i t h a u t h e n t i cg l o b u l i n ( l a n e A ) . T h e s t a i n e d g e l s h o w e d t h e a a n d j 3 g l o b u l i ns u b u n i t s w i t h a v e r a g e m o l w t o f 3 8 kD a n d 2 1 k D , r e s p e c t i v e l y( F i g . 1 , l a n e B ) . S o m e p o l y p e p t i d e s w i t h 5 8 kD w e r e a l s o p r e s e n tw h i c h a r e t h e u n r e d u c e d d i m e r f o r m o f t h e a a n d , B s u b u n i t s .T h e f l u o r o g r a p h o f t h e s a m e g e l ( F i g . 1 , l a n e C ) s h o w e d t h a t t w o

p o l y p e p t i d e s w i t h m o l w t o f 5 8 t o 6 2 kD w e r e b e i n g s y n t h e s i z e dd u r i n g t h e p u l s e p e r i o d . T h o s e p o l y p e p t i d e s c o r r e s p o n d e d i n s i z et o t h e u n r e d u c e d a - ( 3 d i m e r . P o l y p e p t i d e s c o m i g r a t i n g w i t h t h er e d u c e d a a n d , s p e c i e s w e r e n o t a p p a r e n t l y l a b e l e d d u r i n g t h e1 5 0 - m i n l a b e l i n g p e r i o d . H o w e v e r , t h r e e p o l y p e p t i d e s w i t h m o lw t o f 3 4 t o 3 7 kD w e r e l a b e l e d . T h e s e p o l y p e p t i d e s may b e l o n gt o a s e p a r a t e c l a s s o f s a l t - s o l u b l e g l o b u l i n s ( v i c i l i n - l i k e p r o t e i n s ) .T h e s e m i n o r p r o t e i n f r a c t i o n s a r e c u r r e n t l y u n d e r i n v e s t i g a t i o n( K . A d e l i a n d I . A l t o s a a r , u n p u b l i s h e d d a t a ) .T h e d a t a s u g g e s t t h a t o a t g l o b u l i n i s s y n t h e s i z e d i n v i v o p r i -m a r i l y a s h i g h m o l w t p r e c u r s o r s ( 5 8 - 6 2 k D ) w h i c h c a n n o t b er e d u c e d b y 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . E a c h p o l y p e p t i d e i s p r o b a b l yc o m p o s e d o f t h e a a n d , B s p e c i e s w h i c h a r e l i n k e d t o g e t h e rt h r o u g h a p e p t i d e b o n d . T h e s e o b s e r v a t i o n s c o m p a r e w e l l w i t hp r e v i o u s s t u d i e s ( 4 , 1 2 , 2 3 , 2 6 ) .

9 5 0 P l a n t P h y s i o l . V o l . 7 3 , 1 9 8 3


3/7


4/7

M r 1 0 - 367 ;

43

ADELI AND ALTOSAAR

-310

P l a n t P h y s i o l . V o l . 7 3 , 1 9 8 3

( a )

67

43--

30

30

A B ( :F I G . 3 . A n a l y s i s o f r a d i o a c t i v e p o l y p e p t i d e s a s s o c i a t e d w i t h E R . F i v ed e v e l o p i n g g r o a t s ( 1 8 d a f ) were l a b e l e d w i t h 2 MC i [ ' 4 C ] l e u c i n e f o r 5 0m i n . ER f r a c t i o n w a s i s o l a t e d o n a s t e p sucrose g r a d i e n t , c h a l l e n g e d w i t hg l o b u l i n - I g G S e p h a r o s e , a n d a n a l y z e d b y SDS-PAGE a n d f l u o r o g r a p h y .

L a n e A s h o w s t h e t o t a l r a d i o a c t i v e p o l y p e p t i d e s a s s o c i a t e d w i t h E R .L a n e B r e p r e s e n t s t h e l a b e l e d p o l y p e p t i d e s w h i c h b o u n d t o t h e g l o b u l i n -I g G S e p h a r o s e a f t e r 5 0 m i n p u l s e . L a n e C s h o w s t h e ER f r a c t i o n b o u n dt o t h e g l o b u l i n - I g G S e p h a r o s e f r o m g r o a t s l a b e l e d f o r 5 0 m i n a n di n c u b a t e d f o r 1 2 0 m i n .s c r i b e d i n " M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . " T h e p o l y s o m e s were t r a n s -l a t e d i n a w h e a t ge r m e x t r a c t . T h e t r a n s l a t i o n p r o d u c t s a r e s h o w ni n F i g u r e 4 A . L a n e A i s t h e b l a n k ( n o t e m p l a t e a d d e d ) . A ss t a n d a r d s , t h e p r o d u c t s o f m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s ( l a n e B )a n d a p o l y A ' RNA p r e p a r a t i o n ( l a n e C) were a n a l y z e d o n t h es a m e g e l . T h e E R - a s s o c i a t e d p o l y s o m e s d i r e c t e d t h e s y n t h e s i s o ft w o p o l y p e p t i d e s w i t h m o l w t 5 8 t o 6 2 kD ( l a n e D ) w h i c hc o m i g r a t e d w i t h t h e p r o d u c t s made b y m e m b r a n e - b o u n d p o l y -s o me s ( l a n e B ) a n d p o l y A ' RNA ( l a n e C ). Th e d a t a s u g g e s t t h a tE R - a s s o c i a t e d p o l y s o m e s ( R E R ) s y n t h e s i z e p o l y p e p t i d e s c o r r e -s p o n d i n g i n s i z e t o g l o b u l i n d i m e r s i n v i t r o .D i s c o n t i n u o u s sucrose g r a d i e n t s were a l s o u s e d t o i s o l a t e RERa s d e s c r i b e d b y B o l l i n i a n d C h r i s p e e l s ( 1 ) . An e x t r a c t o f d e v e l -o p i n g g r o a t s w a s f r a c t i o n a t e d o n a s t e p g r a d i e n t o f 2 0 %, 3 5 % ,a n d 50% ( w / v ) s u c r o s e . T h e h o m o g e n i z a t i o n b u f f e r a n d t h eg r a d i e n t c o n t a i n e d 1 0 mm M g a c e t a t e . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ,m o s t o f t h e NADH-Cyt c r e d u c t a s e a c t i v i t y w a s l o c a t e d a t t h e2 0 / 3 5 i n t e r f a c e ( 6 2 % o f t o t a l a c t i v i t y ) . T h e m e m b r a n e s a t t h es u p e r n a t a n t / 2 0 i n t e r f a c e a l s o h a d some enzyme a c t i v i t y b u t t o al e s s e r e x t e n t ( 1 5 % o f t o t a l a c t i v i t y ) . B a s e d o n t h e s e r e s u l t s a n de l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s , t h e m e m b r a n e s a t t h e 2 0 / 3 5i n t e r f a c e w e r e a s s u m e d t o b e RER. A f t e r t r e a t m e n t w i t h 1%T r i t o n X - 1 0 0 , p o l y s o m e s w e r e i s o l a t e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t a n dt h e i n t e r f a c e f r a c t i o n s o f s u p e r n a t a n t / 2 0 a n d 2 0 / 3 5 , a n d t r a n s -l a t e d i n a w h e a t germ e x t r a c t . P o l y s o m e s f r o m t h e 2 0 / 3 5 i n t e r f a c e( R E R ) d i r e c t e d t h e s y n t h e s i s o f p o l y p e p t i d e s w i t h mol wt o f 5 8t o 6 2 kD ( F i g . 4 B , l a n e F ) w h i c h c o m i g r a t e d w i t h p o l y p e p t i d e sm a d e b y m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s ( l a n e B ) a n d p o l y A 'RNA ( l a n e C). T h e p o l y p e p t i d e s w h i c h were t h e t r a n s l a t i o np r o d u c t s o f RER p o l y s o m e s ( l a n e F ) were i m m u n o p r e c i p i t a t e dw i t h a n t i g l o b u l i n I g G ( l a n e G ) . P o l y s o m e s i s o l a t e d f r o m s u p e r -

c b )67

43

30..As ..F I G . 4 . I s o l a t i o n a n d c e l l - f r e e t r a n s l a t i o n o f R E R . ( a ) , RER w a si s o l a t e d o n a 1 5 % t o 50% l i n e a r sucrose g r a d i e n t f r o m d e v e l o p i n g g r o a t s( 2 0 d a f ) . T h e p o l y s o m e s b o u n d t o t h e RER f r a c t i o n were s e p a r a t e d a n dt r a n s l a t e d i n a w h e a t germ e x t r a c t . A , b l a n k ( n o t e m p l a t e a d d e d ) ; B ,

p r o d u c t s f o r m e d b y m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s i s o l a t e d a s d e s c r i b e di n F i g . 6 ; C , p o l y p e p t i d e s f o r m e d b y p o l y A ' RNA ( i s o l a t e d f r o mp o l y s o m e p r e p a r a t i o n s ) ; D , t r a n s l a t i o n p r o d u c t s o f p o l y s o m e s i s o l a t e df r o m RER f r a c t i o n . E q u a l c o u n t s ( 2 0 0 , 0 0 0 c p m ) were l o a d e d o n e a c hl a n e . A r r o w s i n d i c a t e tw o p o l y p e p t i d e s c o r r e s p o n d i n g i n s i z e t o g l o b u l i nd i m e r s . ( b ) , S t e p sucrose d e n s i t y g r a d i e n t s ( 2 0 % , 3 5 % , a n d 50% w / v )were a l s o u s e d t o i s o l a t e RER m e m b r a n e s . T h e o r g a n e l l e s a t t h e tw oi n t e r f a c e s o f s u p e r n a t a n t / 2 0 a n d 2 0 / 3 5 , a n d t h e s u p e r n a t a n t were t r e a t e dw i t h T r i t o n X - 1 0 0 a n d p o l y s o m e s were i s o l a t e d a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e .A , B , a n d C , t r a n s l a t i o n p r o d u c t s o f b l a n k , m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s ,a n d p o l y A ' RNA, r e s p e c t i v e l y ; D , p r o d u c t s f o r m e d b y p o l y s o m e si s o l a t e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t ; E a n d F , p r o d u c t s o f p o l y s o m e s a t t a c h e dt o t h e m e m b r a n e s a t t h e s u p e r n a t a n t / 2 0 a n d 2 0 / 3 5 i n t e r f a c e s , r e s p e c -t i v e l y ; G , i m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f t r a n s l a t i o n p r o d u c t s f r o m 2 0 / 3 5 i n -t e r f a c e w i t h a n t i g l o b u l i n I g G . A p p r o x i m a t e l y e q u a l number o f c o u n t s( 1 5 0 , 0 0 0 c p m ) were a n a l y z e d o n l a n e s B t o F . L a n e G c o n t a i n e d 3 5 , 0 0 0cpm. A r r o w s i n d i c a t e p o l y p e p t i d e s i m m u n o p r e c i p i t a b l e w i t h a n t i g l o b u -l i n I g G .

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OAT GLOBULIN BIOSYNTHESISn a t a n t ( f r e e p o l y s o m e s ) d i d n o t d i r e c t t h e s y n t h e s i s o f t h e g l o b -u l i n p r e c u r s o r s ( l a n e D ) ; h o w e v e r , t h e s u p e r n a t a n t / 2 0 p o l y s o m e sc o u l d f o r m t h e g l o b u l i n p o l y p e p t i d e s ( 5 8 - 6 2 k D ) b u t t o a l e s s e re x t e n t ( l a n e E ) . T h i s m i g h t b e t h e r e s u l t o f i n c o m p l e t e f r a c t i o n -a t i o n o f o r g a n e l l e s d u e t o t h e s h o r t t i m e o f c e n t r i f u g a t i o n . T h e s er e s u l t s a l s o i n d i c a t e t h a t E R - a s s o c i a t e d p o l y s o m e s ( R E R ) c a nd i r e c t t h e s y n t h e s i s o f o a t g l o b u l i n p r e c u r s o r s i n v i t r o .C h a r a c t e r i z a t i o n o f F r e e a n d M e m b r a n e - B o u n d P o l y s o m e s .F r e e a n d m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s w e r e f r a c t i o n a t e d b y d i f -f e r e n t i a l c e n t r i f u g a t i o n b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o fM a t t h e w s a n d M i f l i n ( 1 4 ) . T h e y i e l d o f m e m b r a n e - b o u n d p o l y -s o m e s ( 8 o . d . u n i t s / g g r o a t s ) w a s h i g h e r t h a n f r e e p o l y s o m e s ( 6 . 4o . d . u n i t s / g g r o a t s ) . C e n t r i f u g a t i o n o n s u c r o s e g r a d i e n t s s h o w e dn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p r o f i l e s o f m e m b r a n e -b o u n d a n d f r e e p o l y s o m e s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e p r o f i l e sc o n f i r m e d t h e i n t e g r i t y o f b o t h p o l y s o m e p r e p a r a t i o n s .When t r a n s l a t e d i n v i t r o i n a w h e a t g e r m e x t r a c t , b o t h f r e ea n d m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s d i r e c t e d e f f i c i e n t i n c o r p o r a -t i o n o f [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e i n t o o a t s e e d p o l y p e p t i d e s . T o t a l i n c o r -p o r a t i o n o f r a d i o a c t i v i t y b y m e m b r a n e - b o u n d a n d f r e e p o l y -s o m e s w a s 5 1 0 , 0 0 0 a n d 3 7 0 , 0 0 0 c p m / o . d . u n i t , r e s p e c t i v e l y .H o w e v e r , w h e n e q u a l n u m b e r s o f c o u n t s f r o m t h e t r a n s l a t i o np r o d u c t s o f f r e e a n d m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s w e r e a n a l y z e db y SDS-PAGE a n d f l u o r o g r a p h y , t h e p a t t e r n o f t h e i n v i t r os y n t h e s i z e d p o l y p e p t i d e s w a s d i f f e r e n t b e t w e e n t h e t w o p r e p a -r a t i o n s ( F i g . 5 ) . M e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s d i r e c t e d t h e s y n -t h e s i s o f t w o p o l y p e p t i d e s w i t h m o l w t o f 5 8 t o 6 2 kD w h i c hc o r r e s p o n d e d i n s i z e t o u n r e d u c e d a - f 3 g l o b u l i n d i m e r s ( l a n e A )a n d w e r e i m m u n o p r e c i p i t a b l e w i t h a n t i g l o b u l i n I g G ( l a n e B ) .T h e s e p o l y p e p t i d e s w e r e n o t m a d e b y f r e e p o l y s o m e s ( l a n e C )a n d w e r e n o t d e t e c t a b l e b y a n t i g l o b u l i n I g G ( l a n e D ) . I t s h o u l d

M # r X I O "67-. t

43-

30-

A B C DF I G . 5 . C o m p a r i s o n o f p o l y p e p t i d e s made b y f r e e a n d m e m b r a n e -b o u n d p o l y s o m e s . P o l y s o m e s w e r e t r a n s l a t e d i n a w h e a t ge rm e x t r a c t .L a n e A s h o w s t h e t r a n s l a t i o n p r o d u c t s f o r m e d b y m e m b r a n e - b o u n d

p o l y s o m e s . L a n e B i s t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f l a n e A w i t h a n t i g l o b -u l i n I g G . L a n e C r e p r e s e n t s t h e p o l y p e p t i d e s s y n t h e s i z e d b y f r e e p o l y -somes; l a n e D i s t h e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f t h e l a n e C p r o d u c t s .A p p r o x i m a t e l y e q u a l amounts o f r a d i o a c t i v e p r o t e i n s ( 2 0 0 , 0 0 0 c p m )w e r e l o a d e d on l a n e s A a n d C .

N o 3M r x 1 0

4 7_

43-

0OA s&W i i . . . . . . . . , , "' "W . . . - ... 1 . 4 . . . . . . . M

F I G . 6 . I n v i v o l a b e l i n g o f g l o b u l i n p o l y p e p t i d e s i n p r o t e i n b o d i e s .T w e l v e g r o a t s ( 2 0 d a f ) w e r e e a c h l a b e l e d f o r 1 . 5 h w i t h 2 t i C i o f [ 1 4 C ]l e u c i n e , t h e n t r a n s f e r r e d t o n o n r a d i o a c t i v e d i s t i l l e d H 2 0 s o l u t i o n , a n df o u r g r o a t s w e r e h a r v e s t e d a t t i m e s i n d i c a t e d ( 0 , 1 , 4 h ) . P r o t e i n b o d i e sw e r e i s o l a t e d f r o m t h e g r o a t s a n d a n a l y z e d b y SDS-PAGE a n d f l u o r o g -r a p h y . L a n e M s h o w s t h e SDS-PAGE p a t t e r n o f o a t g l o b u l i n p o l y p e p t i d e se x t r a c t e d f r o m m a t u r e g r a i n p r o t e i n b o d i e s . A p p r o x i m a t e l y e q u a la m o u n t s o f p r o t e i n w e r e l o a d e d o n e a c h l a n e .b e m e n t i o n e d t h a t a n t i g l o b u l i n I g G d i d c r o s s r e a c t w i t h s o m es m a l l e r p r o d u c t s o f m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s w h i c h may b ed u e t o s o m e p r o t e o l y t i c c l e a v a g e i n t h e w h e a t g e r m s y s t e m o rt h e r e s u l t o f p r e m a t u r e t e r m i n a t i o n . T h u s , o a t g l o b u l i n p o l y p e p -t i d e s a r e p r i m a r i l y s y n t h e s i z e d o n m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s .A p p e a r a n c e o f N e w l y S y n t h e s i z e d G l o b u l i n P o l y p e p t i d e s i nP r o t e i n B o d i e s . O a t g r o a t s ( 2 0 d a t ) w e r e i n c u b a t e d w i t h [ 1 4 C ]l e u c i n e f o r 1 . 5 h , t r a n s f e r r e d i n t o d i s t i l l e d H 2 0 , a n d i n c u b a t e df u r t h e r f o r 0 , 1 , a n d 4 h . P r o t e i n b o d i e s w e r e i s o l a t e d a n d u s e dt o e x t r a c t s a l t - s o l u b l e g l o b u l i n s . T h e p r o t e i n b o d y p r e p a r a t i o n sw e r e f a i r l y p u r e a s j u d g e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p i c i n v e s t i g a t i o na n d c o n t a i n e d m o r e t h a n 8 5 % p r o t e i n , a l t h o u g h s t a r c h c o n t a m -i n a t i o n s o c c u r r e d . T h e a n a l y s i s o f SDS-PAGE a n d f l u o r o g r a p h y( F i g . 6 ) s h o w e d t h a t s e v e r a l p o l y p e p t i d e s w i t h m o l w t o f 5 8 t o6 2 kD w e r e l a b e l e d a f t e r 1 h i n c u b a t i o n t i m e . When t h e g r o a t sw e r e i n c u b a t e d f u r t h e r ( 4 h ) , t h e i n t e n s i t y o f t h e s e p o l y p e p t i d e si n c r e a s e d m a r k e d l y . T h i s i n d i c a t e d t h e c o n t i n u o u s i n c o r p o r a t i o no f [ 1 4 C ] l e u c i n e i n t o h i g h m o l w t p o l y p e p t i d e s e v e n a f t e r t h eg r o a t s w e r e r e m o v e d f r o m t h e l a b e l a n d i n c u b a t e d i n d i s t i l l e dH 2 0 . A f t e r 4 h i n c u b a t i o n , s m a l l e r p o l y p e p t i d e s w i t h a v e r a g em o l w t 3 8 kD a n d 2 1 kD a l s o a p p e a r e d ( F i g . 6 , l a n e 4 ) . T h e s ep o l y p e p t i d e s c o m i g r a t e d w i t h m a t u r e g l o b u l i n a a n d , B s u b u n i t s( l a n e M ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s may i n d i c a t e t h a t g l o b u l i n p r e c u r -s o r s a r e p o s t t r a n s l a t i o n a l l y c l e a v e d i n p r o t e i n b o d i e s i n t o t h e aa n d , B s u b u n i t s .

DISCUSSIONT h e s y n t h e s i s o f o a t g l o b u l i n p o l y p e p t i d e s a s h i g h m o l w tp r e c u r s o r s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d b y b o t h i n v i t r o a n d i n v i v o

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A D E L I AND ALTOSAARp r o t e i n s y n t h e s i s s t u d i e s ( 4 , 1 2 , 2 3 , 2 6 ) . O u r p r e s e n t r e s u l t s f r o mt h e i n v i v o l a b e l i n g s t u d y o f t o t a l g l o b u l i n i n d e v e l o p i n g o a tg r o a t s s u p p o r t t h e p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s . O a t g l o b u l i n s a p p e a rt o b e s y n t h e s i z e d a s p o l y p e p t i d e s w i t h m o l w t 5 8 t o 6 2 kDc o r r e s p o n d i n g i n s i z e t o u n r e d u c e d a a n d f 3 g l o b u l i n d i m e r s .B r i n e g a r a n d P e t e r s o n ( 4 ) h a v e r e c e n t l y r e p o r t e d s i m i l a r o b s e r -v a t i o n s . T h e y s u g g e s t e d t h a t t h e 5 8 t o 6 2 kD p o l y p e p t i d e s a r et h e p r e c u r s o r s o f a a n da g l o b u l i n s p e c i e s w i t h m o l w t 3 8 kDa n d 2 1 k D . R o s s i a n d L u t h e ( 2 3 ) h a v e a l s o f o u n d s i m i l a r r e s u l t sa n d s u g g e s t e d t h e p r e c u r s o r - p r o d u c t r e l a t i o n s h i p f o r o a t g l o b u l i n .S e v e r a l o t h e r s t o r a g e p r o t e i n s i n c e r e a l s a n d l e g u m e s a r e s y n t h e -s i z e d a s h i g h e r m o l w t p r e c u r s o r s s u c h a s r i c e g l u t e l i n ( 2 7 ) , p e al e g u m i n ( 6 ) , a n d s o y b e a n 1 1 S g l y c i n i n ( 2 5 ) . C h r i s p e e l s a n dc o w o r k e r s ( 6 ) h a v e s h o w n t h a t p e a l e g u m i n i s s y n t h e s i z e d a s a6 0 kD p r e c u r s o r o n m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s t r a n s p o r t e di n t o p r o t e i n b o d i e s a n d p r o c e s s e d i n t o t w o a a n d ( 3 s u b u n i t s w i t hm o l w t 4 0 a n d 2 0 k D . S i m i l a r p r o c e s s e s a r e t h o u g h t t o b ei n v o l v e d i n t h e b i o s y n t h e s i s o f s o y b e a n I l S g l y c i n i n ( 2 5 ) , a n df r e n c h b e a n p h a s e o l i n ( 2 ) . C o n s i d e r i n g t h e h o m o l o g y a m o n gg l o b u l i n s t o r a g e p r o t e i n s f r o m c e r e a l s a n d l e g u m e s ( 1 3 ) , w e m a ya s s u m e a s i m i l a r p r o c e s s f o r t h e b i o s y n t h e s i s a n d d e p o s i t i o n o fo a t g l o b u l i n i n d e v e l o p i n g o a t e n d o s p e r m . E l e c t r o n m i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n s b y S a i g o e t a l . ( 2 4 ) s u p p o r t t h i s h y p o t h e s i s . H o w -e v e r , n o b i o c h e m i c a l e v i d e n c e w a s a v a i l a b l e t o c o n f i r m t h es y n t h e s i s o f o a t g l o b u l i n o n m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s ( R E R )a n d i t s t r a n s p o r t i n t o p r o t e i n b o d i e s . We t h e r e f o r e u n d e r t o o kt h r e e a p p r o a c h e s t o e x a m i n e t h i s h y p o t h e s i s : a n a l y s i s o f E R -a s s o c i a t e d p r o t e i n s u p o n i n v i v o l a b e l i n g o f o a t g r o a t s , i s o l a t i o na n d c e l l - f r e e t r a n s l a t i o n o f R E R , a n d t h e c o m p a r i s o n o f p o l y -p e p t i d e s s y n t h e s i z e d o n f r e e a n d m e m b r a n e - b o u n d p o l y r i b o -s o m e s .U p o n l a b e l i n g o f d e v e l o p i n g g r o a t s a n d f r a c t i o n a t i o n o n l i n e a rs u c r o s e g r a d i e n t s , t h e T C A - p r e c i p i t a b l e r a d i o a c t i v i t y w a s a s s o -c i a t e d w i t h ER i n d i c a t i n g t h e a s s o c i a t i o n o f n e w l y - s y n t h e s i z e dp o l y p e p t i d e s w i t h t h i s m e m b r a n e f r a c t i o n . T h e a n a l y s i s o f t h eER f r a c t i o n f r o m g r o a t s l a b e l e d f o r 5 0 m i n s h o w e d t h e p r e s e n c eo f t w o p o l y p e p t i d e s w i t h m o l w t o f 5 8 t o 6 2 kD w h i c h c r o s s -r e a c t e d w i t h a n t i g l o b u l i n I g G . T h e s e p o l y p e p t i d e s d i s a p p e a r e df r o m t h e ER f r a c t i o n w h e n t h e p u l s e d s e e d s w e r e i n c u b a t e d f o r2 h . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t e d t h e a s s o c i a t i o n o f o a t g l o b u l i np r e c u r s o r s w i t h t h e ER i n a t r a n s i e n t s t a t e . S i m i l a r o b s e r v a t i o n sw e r e m a d e b y C h r i s p e e l s e t a l . ( 6 ) u p o n i n v i v o l a b e l i n g o f p e ac o t y l e d o n s . P e a l e g u m i n a n d v i c i l i n p o l y p e p t i d e s w e r e s h o w n t ob e t r a n s i e n t l y a s s o c i a t e d w i t h ER m e m b r a n e s a s u n p r o c e s s e dp r e c u r s o r s . B o l l i n i e t a l . ( 2 ) r e p o r t e d s i m i l a r r e s u l t s f o r f r e n c hb e a n p h a s e o l i n .I n a n o t h e r a p p r o a c h , RER w a s i s o l a t e d a n d t r a n s l a t e d i n v i t r oi n a w h e a t g e r m e x t r a c t . B o t h s t e p a n d l i n e a r g r a d i e n t s w e r es u i t a b l e f o r t h e i s o l a t i o n o f R E R . P o l y s o m e s i s o l a t e d f r o m t h eRER m e m b r a n e w e r e a b l e t o d i r e c t t h e s y n t h e s i s o f p o l y p e p t i d e sw i t h m o l w t o f 5 8 t o 6 2 k D . T h e s e p o l y p e p t i d e s w e r e i m m u n o -p r e c i p i t a b l e w i t h a n t i g l o b u l i n I g G . T h e s e r e s u l t s a g a i n s u p p o r tt h e h y p o t h e s i s t h a t ER m e m b r a n e s a r e t h e s i t e o f o a t g l o b u l i nb i o s y n t h e s i s . B o l l i n i e t a l . ( 1 ) u s e d s i m i l a r m e t h o d s t o i s o l a t eRER f r o m f r e n c h b e a n c o t y l e d o n s a n d s h o w e d t h e f o r m a t i o n o fp h a s e o l i n p o l y p e p t i d e s b y t h e p o l y s o m e s a t t a c h e d t o t h e RERm e m b r a n e s .T h e t h i r d a p p r o a c h w a s t h e c o m p a r i s o n b e t w e e n f r e e a n dm e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e t r a n s l a t i o n p r o d u c t s . M e m b r a n e -b o u n d p o l y s o m e s c o u l d d i r e c t t h e s y n t h e s i s o f o a t g l o b u l i np r e c u r s o r s ( 5 8 - 6 2 k D ) i n a w h e a t g e r m e x t r a c t a s d e m o n s t r a t e de a r l i e r ( 4 , 1 2 , 2 6 ) . G l o b u l i n a n t i b o d i e s , h o w e v e r , c o u l d n o ti m m u n o p r e c i p i t a t e a n y p o l y p e p t i d e s f r o m t h e t r a n s l a t i o n p r o d -u c t s o f f r e e p o l y s o m e s . I n a n e a r l i e r s t u d y , L u t h e a n d P e t e r s o n( 1 1 ) i s o l a t e d a n d t r a n s l a t e d b o t h f r e e a n d m e m b r a n e - b o u n dp o l y s o m e s f r o m d e v e l o p i n g o a t g r o a t s . T h e y r e p o r t e d n o q u a l i -t a t i v e d i f f e r e n c e i n t h e p r o d u c t s f o r m e d b y m e m b r a n e - b o u n d

a n d f r e e p o l y s o m e s . H o w e v e r , t h e y d i d n o t c h a l l e n g e t h e t r a n s -l a t i o n p r o d u c t s w i t h g l o b u l i n a n t i b o d i e s . Among o t h e r c e r e a ls t o r a g e p r o t e i n s , z e i n i n m a i z e i s t h o u g h t t o b e m a d e o n b o t hm e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s a t t a c h e d t o p r o t e i n b o d y m e m -b r a n e a n d o n RER ( 5 , 9 , 1 0 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , n o d e t e c t a b l eN A D H - C y t c r e d u c t a s e a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i n o a t e n d o s p e r mp r o t e i n b o d i e s s u g g e s t i n g t h a t E R - m e m b r a n e s a r e n o t c o n t i n u o u sw i t h p r o t e i n b o d y m e m b r a n e i n o a t e n d o s p e r m . T h e e l e c t r o nm i c r o s c o p i c s t u d i e s b y S a i g o e t a l . ( 2 4 ) s u p p o r t t h i s c o n c l u s i o n .T h e t r a n s l o c a t i o n o f g l o b u l i n p r e c u r s o r s f r o m t h e i r s i t e o fs y n t h e s i s i n t o p r o t e i n b o d i e s w a s i n v e s t i g a t e d . A p u l s e - l a b e l i n ge x p e r i m e n t i n d i c a t e d t h e a p p e a r a n c e o f n e w l y s y n t h e s i z e d g l o b -u l i n p r e c u r s o r s a s w e l l a s t h e s m a l l e r a a n d # s u b u n i t s i n p r o t e i nb o d i e s . T h i s s u g g e s t s t h a t u n r e d u c e d g l o b u l i n p r e c u r s o r s a r ep r o b a b l y c l e a v e d i n t o a a n d ( 3 s p e c i e s u p o n t h e i r a r r i v a l i np r o t e i n b o d i e s . A s u b s e q u e n t p u b l i c a t i o n w i l l d e a l w i t h t h i sa s p e c t o f p o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n i n m o r e d e t a i l .I n c o n c l u s i o n , s e v e r a l l i n e s o f e v i d e n c e s u g g e s t t h a t o a t g l o b -u l i n p o l y p e p t i d e s a r e s y n t h e s i z e d a s h i g h e r m o l w t p r e c u r s o r s o nm e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s ( R E R ) , s e q u e s t e r e d i n E R , a n dt r a n s p o r t e d i n t o p r o t e i n b o d i e s w h e r e t h e y a r e p r o c e s s e d i n t os m a l l e r s u b u n i t s . V e r y l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e m e c h a n i c s o ft h e t r a n s p o r t o f n e w l y s y n t h e s i z e d p r o t e i n s b e t w e e n ER a n dp r o t e i n b o d i e s . E R - d e r i v e d v e s i c l e s a n d / o r G o l g i a p p a r a t u s m a yb e i n v o l v e d i n s u c h p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n .LITERATURE CITED

1 . B O L L I N I R , MJ C H R I S P E E L S 1 9 7 9 T h e r o u gh e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m i s t h e s i t eo f r e s e r v e - p r o t e i n s y n t h e s i s i n d e v e l o p i n g P h a s e o l u s v u l g a r i s c o t y l e d o n s .P l a n t a 1 4 6 : 4 8 7 - 5 0 12 . B O L L I N I R , M V A N D E R W I L D E N , MJ C H R I S P E E L S 1 9 8 2 A p r e c u r s o r o f t h er e s e r v e - p r o t e i n , p h a s e o l i n , i s t r a n s i e n t l y a s s o c i a t e d w i t h t h e e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m o f d e v e l o p i n g P h a s e o l u s v u l g a r i s c o t y l e d o n s . P h y s i o l P l a n t 5 5 : 8 2 -9 23 . B R I N E G A R A C , DM P E T E R S O N 1 9 8 2 S e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f o a tg l o b u l i n p o l y p e p t i d e s . A r c h B i o c h e m B i o p h y s 2 1 9 : 7 1 - 7 94 . B R I N E G A R A C , DM P E T E R S O N 1 9 8 2 S y n t h e s i s o f o a t g l o b u l i n p r e c u r s o r s :A n a l o g y t o l e g u m e I I S s t o r a g e p r o t e i n s y n t h e s i s . P l a n t P h y s i o l 7 0 : 1 7 6 7 -1 7 6 95 . B U R R B , FA B U R R 1 9 7 6 Z e i n s y n t h e s i s i n m a i z e e n d o s p e r m o n p o l y r i b o s o m e sa t t a c h e d t o p r o t e i n b o d i e s . P r o c N a t l A c a d S c i US A 7 3 : 5 1 5 - 5 1 96 . C H R I S P E E L S M J , T J V H I G G I N S , S C R A I G , D S P E N C E R 1 9 8 2 R o l e o f e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m i n t h e s y n t h e s i s o f r e s e r v e p r o t e i n s a n d t h e k i n e t i c s o f t h e i rt r a n s p o r t t o p r o t e i n b o d i e s i n d e v e l o p i n g p e a c o t y l e d o n s . J C e l l B i o l 9 3 : 5 -1 47 . G A R S O N K , G J M A T L A S H E W S K I , K A D E L I , L S R O B E R T , I A L T O S A A R 1 9 8 3I s o l a t i o n o f i n t a c t p o l y s o m e s f r o m m e c h a n i c a l l y d e h u l l e d d e v e l o p i n g g r a i n .A n a l B i o c h e m I n p r e s s8 . L A E M M L I UK 1 9 7 0 C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h eh e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e ( L o n d ) 2 2 7 : 6 8 0 - 6 8 59 . L A R K I N S B A , CE B R A K E R , CY T S A I 1 9 7 6 S t o r a g e p r o t e i n s y n t h e s i s i n m a i z e .I s o l a t i o n o f z e i n - s y n t h e s i z i n g p o l y r i b o s o m e s . P l a n t P h y s i o l 5 7 : 7 4 0 - 7 4 51 0 . L A R K I N S B A , WJ HURKMAN 1 9 7 8 S y n t h e s i s a n d d e p o s i t i o n o f z e i n i n p r o t e i nb o d i e s o f m a i z e e n d o s p e r m . P l a n t P h y s i o l 6 2 : 2 5 6 - 2 6 31 1 . L U T H E D S , DM P E T E R S O N 1 9 7 7 C e l l - f r e e s y n t h e s i s o f g l o b u l i n b y d e v e l o p i n go a t ( A v e n a s a t i v a L . ) s e e d s . P l a n t P h y s i o l 5 9 : 8 3 6 - 8 4 11 2 . M A T L A S H E W S K I G J , K A D E L I , I A L T O S A A R , P R S H E W R Y , B J M I F L I N 1 9 8 2 I nv i t r o s y n t h e s i s o f o a t g l o b u l i n , FEBS L e t t 1 4 5 : 2 0 8 - 2 1 21 3 . M A T L A S H E W S K I G J , S F A B I J A N S K I , K A D E L I , L S R O B E R T , K G A R S O N , I A L T O -S A A R 1 9 8 3 O a t g l o b u l i n a n d p e a l e g u m i n a r e h o m o l o g o u s p r o t e i n s . I n WJW h e l a n , e d , M i a m i W i n t e r S y m p o s i u m 1 7 - 2 1 J a n u a r y , A d v a n c e s i n G e n eT e ch n o l o gy : M o l e c u l ar G e n e t i c s o f P l a n t s a n d A n i m a l s , V o l 2 0 . A c a d e m i cP r e s s , Ne w Y o r k I n p r e s s1 4 . M A T T H E W S J A , B J M I F L I N 1 9 8 0 I n v i t r o s y n t h e s i s o f b a r l e y s t o r a g e p r o t e i n s .P l a n t a 1 4 9 : 2 6 2 - 2 6 81 5 . M I F L I N B J , SR B U R G E S S , P R SHEWRY 1 9 8 1 T h e d e v e l o p m e n t o f p r o t e i n b o d i e si n t h e s t o r a g e t i s s u e s o f s e e d s : S u b c e l l u l a r s e p a r a t i o n s o f h o m o g e n a t e s o fb a r l e y , m a i z e a n d w h e a t e n d o s p e r m s a n d o f p e a c o t y l e d o n s . J E x p B o t 3 2 :1 9 9 - 2 1 91 6 . P E N IN G T O N R J 1 9 6 1 B i o c h e m i s t r y o f d y s t r o p h i c m u s c l e : M i t o c h o n d r i a l s u c -c i n a t e - t e t r a z o l i u m r e d u c t a s e a n d a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e . B i o c h e m J 8 0 :6 4 9 - 6 5 41 7 . P E T E R S O N DM 1 9 7 8 S u b u n i t s t r u c t u r e a n d c o m p o s i t i o n o f o a t s e e d g l o b u l i n .P l a n t P h y s i o l 6 2 : 5 0 6 - 5 0 91 8 . P E T E R S O N DM , AC B R I N E G A R 1 9 8 3 O a t s t o r a g e p r o t e i n s . I n F W e b s t e r , e d ,O a t C h e m i s t r y a n d P r o d u c t i o n , A m e r i c a n A s s o c i a t i o n o f C e r e a l C h e m i s t s ,S t . P a u l , MN I n p r e s s

9 5 4 P l a n t P h y s i o l . V o l . 7 3 , 1 9 8 3


7/7

OAT GLOBULIN B I O S Y N T H E S I S1 9 . Q U A I L P H 1 9 7 9 P l a n t c e l l f r a c t i o n a t i o n . Annu R e v P l a n t P h y s i o l 3 0 : 4 2 5 - 4 8 42 0 . R O B E R T I S , A C U D J O E , C N O Z Z O L I L L O , I A L T O S A A R 1 9 8 3 T o t a l s o l u b i l i z a t i o n

o f g r o a t p r o t e i n s i n h i g h p r o t e i n o a t ( A v e n a s a t i v a L . ) : E v i d e n c e t h a t g l u t e l i n sa r e a m i n o r c o m p o n e n t . C a n I n s t F o o d S c i T e c h n o l J 1 6 : 1 9 6 - 2 0 02 1 . R O B E R T I S , G J M A T L A S H E W S K I , K A D E L I , C N O Z Z O L I L L O , I A L T O 6 A A R 1 9 8 3E l e c t r o p h o r e t i c a n d d e v e l o p m e n t a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f o a t ( A v e n a s a t i v a L . )g l o b u l i n s i n c u l t i v a r s o f d i f f e r e n t p r o t e i n c o n t e n t . C e r e a l Chem 6 0 : 2 3 1 - 2 3 42 2 . R O B E R T s LM , J M LORD 1 9 8 1 T h e s y n t h e s i s o f R i c i n u s c o m m u n i s a g g l u t i n i n :C o t r a n s l a t i o n a l a n d p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n o f a g g l u t i n i n p o l y p e p -t i d e s . E u r J B i o c h e m 1 1 9 : 3 1 - 4 1

2 3 . R o s s i H A , DS L U T H E 1 9 8 3 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f o a t g l o b u l i nmessenger RNA. P l a n t P h y s i o l 7 2 : 5 7 8 - 5 8 22 4 . S A I G O R H , DM P E T E R S O N , J H O L L Y 1 9 8 3 D e v e l o p m e n t o f p r o t e i n b o d i e s i no a t s t a r c h y e n d o s p e r m . C a n J B o t 6 1 : 1 2 0 6 - 1 2 1 52 5 . S E N G U P T A C , V DELUCA, DS B A I L E Y , DP S VERMA 1 9 8 1 P o s t - t r a n s l a t i o n a lp r o c e s s i n g o f 7 S a n d I I S components o f s o y b e a n s t o r a g e p r o t e i n s . P l a n t M o lB i o l 1 : 1 9 - 3 42 6 . WALsURG G , BA L A R K I N S 1 9 8 3 O a t s e e d g l o b u l i n : s u b u n i t c h a r a c t e r i z a t i o na n d d e m o n s t r a t i o n o f i t s s y n t h e s i s a s a p r e c u r s o r . P l a n t P h y s i o l 7 2 : 1 6 1 - 1 6 52 7 . Y A M A G A T A H , T S U G I M O T O , K T A N A K A , Z K A SA I 1 9 8 2 B i o s y n t h e s i s o f s t o r a g ep r o t e i n s i n d e v e l o p i n g r i c e s e e d s . P l a n t P h y s i o l 7 0 : 1 0 9 4 - 1 1 0 0

9 5 5

adeli 1983 plant physiol role of er in oat globulin bio synthesis

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