action de la puromycine et d'une substance analogue sur la ... · chromatine, chondriome...)....

/ . Embryo!. exp. Morph. Vol. 24, 1, pp. 119-138, 1970 119

Printed in Great Britain

Action de la puromycineet d'une substance analogue sur la differentiation

de cellules embryonnaires d'amphibiens,cultivees in vitro

Par A. M. DUPRAT1

Laboratoire de Biologie generale, Faculte des Sciences, Toulouse

RESUMEDes cellules embryonnaires de Pleurodeles waltlii et d'Ambystoma mexicanum (Amphibiens,

Urodeles) ont ete cultivees //; vitro en presence de diverses concentrations de puromycine,inhibiteur des syntheses proteiques, ou d'aminonucleoside de la puromycine, substanceanalogue n'agissant pas sur les syntheses proteiques. Lorsque le puromycine est introduitedans le milieu de culture (0,15 /<g/ml) avant que la differenciation morphologique des cellulesne se manifeste, on constate:

(a) L'apparition sur le vivant d'anomalies affectant divers organites cellulaires (nucleoles,chromatine, chondriome...).

(b) L'inhibition de la differenciation morphologique des cellules, bien que d'autres fonctionscellulaires continuent a se derouler.

(c) La reversibilite de ce phenomene de blocage, a condition que la duree du traitementn'excede pas trois jours, meme en presence d'actinomycine D (troisieme lot, Fig. 5).

Ces resultats sont comparables a ceux obtenus avec la cycloheximide, autre inhibiteurdes syntheses proteiques.

Une etude autoradiographique nous a permis de constater que la puromycine inhiberincorporation de [3H]uridine dans Je nucleole mais ne perturbe apparemment pas celle quise fait dans Je nucleoplasme. De plus, le passage du RNA du noyau au cytoplasme ne parattpas affecte par l'antibiotique. La puromycine (0,15/tg/ml) a une action inhibitrice plus oumoins marquee sur l'incorporation de deux acides amines selon la sensibilite de la ponteutilisee. Cette inhibition des syntheses proteiques semble en correlation avec celle de ladifferenciation morphologique. En effet, Paminonucleoside de la puromycine qui n'est pasun inhibiteur des syntheses proteiques aux concentrations utilisees, n'affecte pas la differen-ciation morphologique des cellules.

On conclut que 1'effet de la puromycine est lie a son action inhibitrice des synthesesproteiques.

INTRODUCTION

Les effets de la puromycine, antibiotique inhibiteur des syntheses proteiques,ont fait Pobjet de nombreux travaux dans un domaine de recherches tresetendu. L'action de cet antimetabolite sur l'oogenese (Ficq, 1964; DettlafF,1966) et la morphogenese d'organismes animaux (Hultin, 1961; Brachet, 1963;

1 Adresse de Vauteur: Laboratoire de Biologie generale, Faculte des Sciences, 118, route deNarbonne, 31-Toulouse, France.

120 A. M. DUPRAT

Brachet, Denis & De Vitry, 1964; Yaffe & Feldman, 1964; Malpoix & Lim-bosch, 1966; Legros & Brachet, 1965; Thomson & Biggers, 1966) et vegetaux(De Vitry, 1965*7, b\ Boloukhere-Presburg, 1966) ainsi que son action surdiverses fonctions cellulaires telles que la mitose (Legros & Brachet, 1965), larespiration (Frankel, 1966), sur les syntheses de proteines (Wheelock, 1962;Nathans, 1964, De la Haba & Holtzer, 1965), d'acides nucleiques (Tamaoki &Mueller, 1963; Estensen & Baserga, 1966; Studzinski & Jackson, 1966; Latham& Darnell, 1965) et sur certains constituants de la cellule tels que le reticulumendoplasmique (Stenram & Willen, 1967), a ete etudiee a l'aide de materiels etde techniques les plus varies.

Les resultats que nous avons precedemment obtenus par action de Pactino-mycine D sur la differenciation morphologique de cellules embryonnaires enculture in vitro, nous ont permis de constater que les myoblastes se differencienten presence d'actinomycine D sans aucun retard sur les myoblastes-temoins,contrairement a ce qui se produit pour Jes autres types cellulaires, notammentles neuroblastes. De plus, ce meme type de cellules est capable, toujours enpresence d'actinomycine D, de se marquer par la [3H]leucine — meme apresplusieurs jours de traitement. Ces recherches nous ont conduite a emettredeux hypotheses: (a) possibility d'existence de m-RNA(s) a longue duree de vieimpliques dans la differenciation morphologique des myoblastes (Duprat,Zalta & Beetschen, 1966); (b) le materiel proteique necessaire a la differencia-tion morphologique des myoblastes serait deja, en partie ou totalement, syn-thetise dans ce type cellulaire.

Afin de completer et de preciser ce premier travail sur la differenciation desmyoblastes, nous avons etudie Faction d'un inhibiteur des syntheses proteiques,la puromycine (PURO), sur ces memes cellules embryonnaires encore morpho-logiquement indifferenciees ou en cours de differenciation morphologique. Cetantimetabolite intervient, semble-t-il, au niveau meme des ribosomes; en sesubstituant au RNA-t, il forme un complexe avec les derives amino-acyl etinterrompt l'assemblage des acides amines aux polypeptides en cours desynthese (Nathans & Neidle, 1963; Nathans, 1964).

Si comme nous l'avons suppose, le materiel proteique necessaire a la differen-ciation des myoblastes etait deja en place dans la cellule lorsque le traitementpar l'actinomycine D debute, la PURO ne devrait pas empecher l'apparitionde la differenciation morphologique de ce type de cellules, contrairement a cequi se produirait pour les autres types cellulaires. Par contre, si la PURO bloquela differenciation morphologique des myoblastes, on pourra penser qu'elleinhibe des processus cellulaires impliquant sans doute des syntheses proteiques.Dans ce dernier cas, afin de preciser davantage le mode d'action de la PURO,nous avons etudie les effets de l'aminonucleoside de la puromycine (ANP),analogue de cet antimetabolite qui, comme plusieurs travaux l'ont deja montre,possede quelques proprietes biologiques de la PURO mais n'est pas un inhi-biteur specifique des syntheses proteiques (Nathans & Neidle, 1963; Studzinski

Puromycine et cellules embryonnaires 121& Ellem, 1966; Farnham & Dubin, 1967), excepte s'il est utilise a de fortesconcentrations (Studzinski & Ellem, 1966). Si des cellules embryonnairesencore morphologiquement indifferenciees traitees par l'ANP, se differencientalors que les cellules traitees par la PURO ne se differencient pas, nous pour-rons penser que la PURO inhibe un (ou des) mecanisme(s) cellulaire(s) particu-lier(s) lie(s) a la synthese de proteines. Par contre, si les cellules traitees parl'ANP ne se differencient pas, cela pourra signifier que le mecanisme de ladifferentiation perturbe par la PURO et par son analogue n'est pas directe-ment en relation avec des syntheses proteiques.

Notre present travail consiste done en l'etude des effets de la PURO etd'un de ses analogues, l'aminonucleoside de la puromycine, sur la differencia-tion morphologique de cellules embryonnaires d'Amphibiens. Dans un travailpreliminaire (Duprat, 1967) nous avons pu determiner 3 categories de concen-trations (c) de PURO. La premiere n'a pas d'action apparente sur le comporte-ment des cellules et les divers organites cellulaires. Elle comprend les c ^0,075 /*g/ml (1,3 x 10~7M; C tres faibles). La seconde s'est averee la plus interes-sant pour effectuer une etude sur la differenciation cellulaire. Elle englobe lesc comprises entre 0,10 et 0,25/tg/ml (2 ,7X10~ 7 M; C faibles). La troisiemecategorie, c ^ 0,25/4g/ml (4,5 x 10~7M; C elevees) agit tres rapidement sur lescellules et entraine des dommages considerables.

MATERIEL ET METHODES

Des cultures de cellules embryonnaires de neurulas de Pleurodeles waltlii (st.13 et 14) et d'Ambystoma mexicanum (st. 14) ont ete effectuees selon la tech-nique de Jones & Elsdale (1963) adaptee a notre materiel et deja utilisee pournos travaux anterieurs (Duprat, 1965; Duprat et al. 1965; Duprat et al. 1966;Duprat, 1967; Duprat, Beetschen & Zalta, 1967). Des cellules de la plaque et desbourrelets neuraux, et du feuillet mesodermique sous-jacent, sont dissocieesdans une solution de Steinberg tamponnee, sans Ca++ ni Mg++, en presence deversene (EDTA). Elles sont ensuite placees dans une chambre de culture con-stituee par une lame de verre de 4 mm d'epaisseur percee d'un orifice central de10 mm de diametre, ferme par deux lamelles de verre scellees a la paraffine.Le milieu de culture utilise est une solution minerale de Barth (Barth & Barth,1959) a laquelle on ajoute 0,1 % d'albumine bovine (Armour Lab.) ou 3 % deserum de cheval (Difco). L'albumine ou le serum ont un role protecteur vis-a-vis des cellules dont ils favorisent l'etalement; ils ne semblent pas avoir d'actionsur la differenciation cellulaire (Barth & Barth, 1959), puisque les cellules unefois etalees peuvent se differencier normalement en leur absence (observationpersonnelle). Les cultures sont maintenues a 18 °C.

Dans les cultures temoins, les cellules commencent leur differenciation mor-phologique peu apres leur etalement. Nous obtenons ainsi dans une memechambre de culture des categories cellulaires tres variees: cellules de type

122 A. M. DUPRAT

epithelial ciliees ou non, melanophores, cellules nerveuses sans axone, neu-rones, cellules musculaires lisses et striees et quelquefois cellules chordales(Duprat et al. 1966) qui evoluent progressivement en utilisant leurs reservesvitellines et restent vivantes pendant 3 semaines environ a 18 °C (Fig. 1A).Lorsqu'elles ont epuise leurs reserves deutoplasmiques, elles degenerent.

Au total nous avons effectue 1000 cultures, la moitie d'entre elles ayant etetraitee, l'autre moitie ayant servi de temoin.

C'est soit avant la mise en culture des cellules, soit immediatement apresleur etalement, soit encore apres que la differentiation morphologique adebute, que le traitement par l'antibiotique commence. Le milieu de culture estalors remplace par une meme solution de Barth a laquelle on a ajoute la puro-mycine (Nutritional Biochemical Co) a diverses concentrations (de 0,025 a100 /tg/ml). Selon les series, les durees de traitement ont varie de quelques heuresa plusieurs jours, le milieu traitant etant ensuite remplace, apres plusieurslavages, par du milieu normal.

Ces cultures mixtes presentent l'avantage de permettre la comparaisonaisee du comportement de plusieurs categories cellulaires (myoblastes, neuro-blastes, etc.) traitees de maniere identique.

II faut aussi noter que les phenomenes observes au cours des traitements necorrespondent apparemment pas a une selection de cellules resistantes tellequ'on en observe dans les cultures de masse chez les Mammiferes. Dans l'en-semble, tandis que les cellules non etalees sont eliminees par le changement demilieu, les cellules etalees reagissent toutes de facon semblable au traitement.Pour une categorie cellulaire donnee, certaines cellules ne degenerent pas pen-dant que les autres continueraient a vivre.

Les radioelements utilises pour l'etude autoradiographique sont [3H]uridine(C. E. A. Saclay, activite specifique 21Ci/mM) comme precurseur du RNA,[3H]leucine (C. E. A. Saclay, activite specifique 15 Ci/mM), [3H]lysine (C. E. A.Saclay, activite specifique 15 Ci/mM), comme precurseurs des proteines. Lesautoradiographies sont effectuees apres fixation des cultures par le liquide deCarnoy ou par une solution aqueuse saturee d'acide picrique. Nous avonsutilise l'emulsion Ilford L4 selon la technique de Ficq (Ficq, 1961) adaptee anotre materiel. Le temps d'exposition a varie selon les series de 3 a 12 jours.Nous avons pu verifier par digestion a la RNase (Armour Lab., 0,2 mg/ml a37 °C pendant 1 h), sur des cultures temoins ayant ete incubees pendant 1 hdans la [3H]uridine, l'absence totale de tout marquage des cellules. De plus,l'incorporation de [3H]thymidine dans des cellules de neurulas est nulle, ce quisuggere que ces cellules ne synthetisent pas de DNA dans leur grande majorite.Ces resultats permettent de penser que, sur notre materiel, contrairement ace qui se produit dans des cellules plus jeunes pendant la segmentation del'oeuf (Bieliavsky & Tencer, 1960), la [3H]uridine s'incorpore uniquement dansle RNA.

Puromycine et cellules embryonnaires 123

RESULTATS

I. EfTets cytologiques de la puromycine

Quel que soit le type de cellules auquel ils appartiennent, les organites cellu-laires reagissent de la meme fagon en presence de PURO. Nous ne decrirons pasict en detail les anomalies qui apparaissent tant dans le noyau que dans lecytoplasme, qui ont deja fait l'objet d'une publication anterieure (Duprat,1967).

FIGURE 1

Photographies effectuees sur le vivant, en contraste de phase.chr, chromatine; n, nucleole; p.v., plaquettes vitellines.

(A) Cellule temoin de type epithelial presentant des nucleoles plus ou moinsovoides, d'aspect homogene.(B) Cellules traitees par la puromycine (0,25 /*g/ml). Un noyau possede des nucleolesnettement vacuolaires, 1'autre presente un aspect tres heterogene avec la chroma-tine en mottes fortement contrastees.(C) Cellule traitee par la puromycine (0,25/tg/ml). Cellule binucleee presentantegalement des noyaux tres heterogenes dans lesquels il est difficile de distinguerJes mottes de chromatine des nucleoles.

124 A. M. DUPRAT

Nous rappellerons simplement que, dans le noyau, on observe des modifi-cations des nucleoles qui prennent des formes tres variees, presentant parendroits des condensations optiquement plus foncees en contraste de phase ouqui se vesiculisent plus ou moins fortement. La chromatine se modifie egale-ment et presente un aspect heterogene, en mottes ou en filaments epaissis

* * ,-

FIGURE 2

Photographies effectuees sur le vivant, en contraste de phase.ch, chondriome; g.m., grains de melanine; N, noyau.

(A) Chondriome d'une cellule-temoin. Presence de longs filaments flexueux, mito-chondries en batonnets peu nombreuses.(B) Myoblaste traite par la puromycine (0,25 /tg/ml). Le chondriome a tendancea se fragmenter en mitochondries et a se cavuler. Absence de myofibrilles striees.

(Fig. 1B, C). La membrane nucleaire se plisse et il s'etablit des contacts beau-coup plus frequents entre nucleoles et membrane nucleaire que dans les culturestemoins. Dans le cytoplasme on note une modification tres nette du chondriome.Habituellement constitue par de longs chondriocontes flexueux (Fig. 2 A), il sefragmente sous Faction de la PURO en elements generalement punctiformes, dedimensions plus ou moins importantes (Fig. 2B). Nous avons egalementobserve une retraction cellulaire et l'apparition de vacuoles en nombre et dedimensions variables.


II. Action de la puromycine sur la differentiationmorphologique des cellules

1. Action de concentrations tres faibles (^ 0,075 /.ig/ml)

De meme qu'elles n'ont pas d'effet visible au microscope photonique sur lesdivers organites cellulaires, les concentrations tres faibles n'agissent apparem-ment pas sur la differentiation morphologique des cellules. Nous n'avons pasnote de decalage dans revolution des cultures traitees par la PURO immediate-ment apres l'etalement des cellules, ou en cours de differentiation, par rapportaux cultures temoins. Nous avons pu observer l'apparition simultanee desmyofibrilles striees dans les myoblastes temoins et traites. De la meme facon,des axones se sont formes dans les neuroblastes traites et temoins.

2. Action de concentrations elevees (^ 0,25Les concentrations elevees qui entrainent des dommages tres importants au

point de vue cytologique, provoquent un blocage immediat de la differentiationmorphologique et des autres fonctions de la cellule (mitose, utilisation desreserves...). L'action inhibitrice de la PURO s'exerce sur tous les types cellu-laires y compris les myoblastes (Fig. 2B). Les cellules meurent quelques joursapres le debut du traitement. Ce blocage de toutes les fonctions cellulaires estirreversible lorsque le traitement par l'antibiotique est interrompu et que lescellules sont replacees dans un milieu de culture normal. II faut toutefoisapporter une restriction a ceci. En effet lorsqu'on fait subir aux cellules, desleur etalement, un choc par une forte c de PURO (100 /*g/ml) pendant 1 h puisqu'on les replace dans un milieu normal, on constate l'apparition de toutes lesanomalies morphologiques precitees; mais apres quelques jours un certainnombre d'entre elles presentent une attenuation de ces anomalies et la differen-tiation morphologique s'y manifeste.

Si un tel choc est pratique lors de la mise en culture des cellules, on peutconstater qu'il n'empeche pas i'etalement, ni la differentiation et revolutionnormale de ces cellules. Ceci indique bien, comme nous l'avons deja signale,que la c utilisee et la duree du traitement par I'antimetabolite jouent un role tresimportant.

Ann de preciser quels sont les effets sur les syntheses de proteines et de RNAde ces c elevees qui entrainent des modifications irreversibles dans le metabolismecellulaire, nous avons effectue une etude autoradiographique en utilisant la[3H]uridine et la [3H]leucine. Nous nous bornerons ici a rappeler brievement lesresultats obtenus qui ont deja fait l'objet de publications anterieures (Duprat,1967; Duprat & Mathieu, 1969).

(a) L'incorporation de [3H]leucine dans les proteines est totalement inhibeepar la PURO (2 /tg/ml).

(b) L'utilisation de [3H]uridine nous a permis de constater comme d'autres

126 A. M. DUPRAT

auteurs (Studzinski & Jackson, 1966; Jackson & Studzinski, 1968) que lapresence de l'antibiotique entraine une baisse tres sensible du marquagenucleolaire dans les cellules traitees, que le marquage nucleaire extra-nucleolairen'est apparemment pas affecte et que le passage du RNA du noyau vers lecytoplasme n'est pas inhibe.

3. Action de faibles concentrations

1. Influence sur la differenciation morphologique

On a traite par une c de 0,15/*g/ml des cellules encore morphologiquementindifferenciees. Tandis que les cultures temoins presentent la differenciation detous les types cellulaires, la differenciation des cellules traitees n'apparait pas,

FIGURE 3

Photographies effectuees sur le vivant, en contraste de phase.cy, cytoplasme; my, myofibrilles striees; N, noyau; p.v., plaquettes vitellines.

(A) Myoblastes traites des leur etalement par la puromycine (0,15/tg/ml). Leurcytoplasme s'etale et s'accroit normalement mais la differenciation des myofibrillesstriees ne se manifeste pas.(B) Cellules musculaires striees temoins.(C) Cellule musculaire traitee des son etalement, par Paminonucleoside de lapuromycine (10/4g/ml). Les myofibrilles sont nettement visibles.


axones et myonbrilles striees font notamment defaut. Cependant, toutes lesfonctions de la cellule ne sont pas bloquees pour autant. Nous avons pu con-stater la presence de mitoses se deroulant normalement et aboutissant a laformation de deux cellules filles, meme au troisieme jour du traitement. Lecytoplasme des cellules s'accroit et s'etale (Fig. 3 A). Nous avons egalement puobserver la resorption de plaquettes vitellines avec apparition de globuleslipidiques. Les cellules continuent done ainsi a vivre en presence de PUROpendant 8 jours environ meme en l'absence de toute differenciation morpho-logique. Ensuite les anomalies precedemment decrites affectant le noyau et lecytoplasme deviennent importantes, les cellules degenerent plus ou moinsrapidement.

On a egalement traite par la PURO des cellules en cours de differenciationmorphologique. Contrairement a ce qui se passe dans le cas precedent, nousn'avons pas decele de difference, apres 24 h de traitement, entre les culturestemoins et traitees. C'est environ 48 h apres le debut du traitement qu'on peutobserver un arret de la differenciation, notamment de la croissance des axoneset du progres de la striation dans les myoblastes. Ici encore, toutes les fonctionsde la cellule ne sont pas bloquees.

2. Etude de la reversibilite des phenomenes

Si apres avoir inhibe la differenciation morphologique par la PURO pendant1, 2, 3, 4 et 5 jours, on remplace le milieu traitant par une solution de Barthnormale, on constate la reversibilite du blocage. La striation apparait dans lesmyoblastes pres du noyau et gagne ensuite les extremites de la cellule. Lesaxones apparaissent egalement et s'allongent tres rapidement. On peut aussinoter la formation, sur les cellules de type epithelial, d'une ciliature animee debattements rapides. La differenciation n'est pas visible immediatement dans lescellules, il s'ecoule environ 48 h apres le retour en milieu normal avant qu'ellene se produise. D'autre part la reversibilite a lieu aussi bien dans les cellulestiaitees des leur etalement que dans celles qui avaient deja commence leur dif-ferenciation morphologique avant le debut du traitement, a condition que laduree de ce dernier rfexcede pas trois jours. Au-dela de ce delai, les cellulesreplacees en milieu normal degenerent tres rapidement.

Nous avons note dans les cultures replacees en milieu normal Fapparitionde cellules 'geantes' generalement de type epithelial, possedant une tres im-portante plage cytoplasmique et presentant un chondriome tres fourni. Leurnoyau de dimensions superieures a la moyenne renferme souvent de grosnucleoles. Le phenomene de fusion nucleolaire est assez frequent dans cescellules.

128 A. M. DUPRAT

3. Etude autoradiographique

Dans ce cas encore et afin de preciser quelle est l'action de ces faibles con-centrations de PURO sur les syntheses de proteines et de RNA, nous avons eurecours a la methode autoradiographique.

Action sur le RNA. Nous avons effectue deux series d'experiences avec la[3H]uridine. Dans un premier cas, la [3H]uridine et la PURO sont introduites

Tableau 1. Inhibition de Vincorporation de [3H]leucine par uneconcentration de puromycine de 0,

CulturesA

Moyennes des obser-vations effectuees

par unite desurface sur chaque

culture temoin(*i, 0

61,3366,0362,2846,9754,42

50,3461,3360,1240,6649,39

temoins

Nombre d'obser-vations effectueessur chaque culture

temoin(«i, 0

Cultures



culture traitee(*2, 0

Cytoplasme2333333333

51,5449,1742,2050,3738,77

Noyau2333333333

43,3243,9533,2550,3344,24

traitees


traiteeO2, 0

3322333332

3322333333

L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour un seuil efficacede 5 % (a = 0,05), les limites etant t et = 17 et t' a = 38, nous avons:

(a) Premier cas (cytoplasme):tx = 18; t2 = 37; ta < tx < t2 < t'a; 17 < 18 < 37 < 38.

(b) Deuxieme cas (noyau):tx = 20; t2 = 35; to. < tx < t2 < t'a; 17 < 20 < 35 < 38.

La difference entre tx et t2 n'est pas suffisamment grande pour qu'il faille raisonnablement1'imputer a une difference entre les fonctions de repartition de xx et x2 (cf. Duprat & Mathieu,1969).

11 semble done que le traitement n'a pas eu d'effet sur les cellules.

ensemble dans le milieu de culture; la duree d'incubation a ete de 1 h. Dansun deuxieme cas, nous avons commence le traitement par l'antibiotique 24 henviron avant l'introduction de [3H]uridine. Pendant la duree d'incubationdans le precurseur marque (1 h), la PURO est toujours presente.

Dans ces deux series d'experiences nous n'avons pas note de difference dansle marquage des cultures traitees et des cultures temoins (Duprat, 1967, 1969 c).

Pur omy cine et cellules embryonnaires 129

II semble done qu'a cette faible concentration, la PURO n'a pas d'actiondecelable par autoradiographie, sur les syntheses de RNA.

Action sur les proteines. Dans un premier temps, on a egalement fait lesdeux memes series d'experiences avec la [3H]leucine. Dans une serie, [3H]leucineet la PURO sont introduites ensemble dans le milieu de culture, dans unedeuxieme serie le traitement par la PURO debute avant Introduction de

Tableau 2. Inhibition de Vincorporation de [sH]lysine par uneconcentration de puromycine de 0,15

Cultures temoins



culture temoin

77,9290,4655,34

104,40107,3685,14

78,4286,3044,32

107,66106,1492,54

CulturesA

•V f

Moyennes des obser-Nombre d'obser- vations effectueesvations effectuees par unite desur chaque culture surface sur chaque

temoin culture traiteeC*2. 0


505050505050

2,045,86

10,985,341,986,12

Noyau2,646,91

13,246,023,308,34

traitees


traitee("2, ')

505050505050

505050505050

L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour un seuil de5%, les limites etant toe = 26 et t'ct = 52, nous avons pour les 2 cas:

tx = 21; /2 = 57; tx < tot < t'ot < t2; 21 < 26 < 52 < 57.

Le test est tres significatif.Le traitement a done une action inhibitrice significative sur le cytoplasme et sur le noyau.

la [3H]leucine. Nous avons constate que, contrairement a ce qui se produit avecune concentration elevee de PURO, les syntheses proteiques ne sont pastotalement inhibees. Elles continuent a avoir lieu dans le cytoplasme commedans le noyau des cellules. Les resultats numeriques obtenus apres comptagedes grains d'argent reduit par unite de surface tant dans le cytoplasme que dansle noyau sont consignee dans le Tableau 1.

Dans un deuxieme temps, nous avons repris ces experiences en utilisant la[3H]lysine. Dans ce cas nous avons constate une tres forte baisse dans le mar-quage cytoplasmique et nucleaire des cellules traitees (Tableau 2).

11 n'etait pas interdit de penser, d'apres ces deux series d'experiences, que les9 EM B 24

130 A. M. DUPRAT

syntheses de certaines proteines jouant un role important dans la differenciationmorphologique des cellules, pourraient etre plus sensibles a la PURO qued'autres. Une nouvelle serie experimental a ete effectuee; 1'incorporation de[3H]lysine est encore fortement inhibee, tandis qu'une nouvelle experienced'incorporation de [3H]leucine dans des conditions identiques a la premiere, amontre que le marquage des cellules traitees par la PURO (0,15/tg/ml) etaitcette fois-ci fortement inhibe (Tableau 3).

Tableau 3. Inhibition de I'incorporation de [3B]leucine par uneconcentration de puromycine de 0,15 ptgjml (deuxieme serie)

Culturesi

Moyennes obser-vations effectuees


culture temoin

30,9652,1045,6062,12

51,0467,7061,1472,44

temoins


temoin

CulturesA



culture traiteeCY2, i)

Cytoplasme50505050

3,603,140,600,780,54

Noyau50

505050

3,942,941,721,340,98

traitees


traitee

5050505050

5050505050

L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour un seuil de5%, les limites etant toe = 11 et t'a = 29, nous avons pour les 2 cas:

/x = 10; t2 = 35; tx < tx < t'a < t2; JO < 11 < 29 < 35.Le test dans les 2 cas est tres significatif.

Le traitement a done une action inhibitrice significative sur le marquage du cytoplasme et dunoyau.

4. Etude autoradiographique effectuee au cours de la phase de reversibilite

Nous avons vu precedemment que, utilisee a la c de 0,15/tg/ml, la PUROempeche l'apparition de la differenciation morphologique des cellules mais nebloque pas certaines autres fonctions cellulaires. Lorsque le milieu traitant estremplace par une solution de Barth normale, la cellule est capable d'assurertoutes ses fonctions, notamment celles qui lui permettent de se differencier, acondition que la duree du traitement n'ait pas depasse un certain delai. Afin deconnaitre ce qui se passe pendant la periode de reversibilite des phenomenes,nous avons encore une fois eu recours a la technique autoradiographique.


Apres avoir traite les cultures par 0,15 ^g/ml de PURO pendant 2 jours, on aremplace le milieu traitant par du milieu normal dans lequel les cellules sontrestees pendant 24 h. Les cultures ont ensuite ete incubees pendant 1 h avecde la [3H]leucine afin de deceler, le cas echeant, une modification dans le tauxde synthese de proteines.

Tableau 4. Incorporation de [*H]leucine apres traitement par uneconcentration de puromycine de 0,15 /-ig/ml, puts une duree

de re'versibilite de 24 h

CulturesA.

r



culture temoin(*,/)

40,2430,6446,1038,2242,30

35,0632,5038,5834,0638,02

temoins


temoin("i, ')

Cultures



culture traiteeCv2, 0


56,7849,4446,9461,4457,98

Noyau5050505050

54,5447,6246,4254,2656,14

traitees


traitee

5050505050

5050505050

L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour un seuil de5%, les limites etant ta = 17 et t'oc = 38, nous avons pour les 2 cas:

tv = 40; t, = 15; t2 < ta < t'a < tx; 15 < 17 < 38 < 40.Le test dans les 2 cas est tres significatif.

Vaugmentation du taux d'incorporation de [3H]leucine dans les cellules traitees est donesignificative.

Apres une duree de reversibilite de 24 h., nous avons constate une augmenta-tion de l'incorporation de [3H]leucine dans les cellules traitees (Tableau 4). Cetaccroissement du marquage cellulaire pourrait expliquer la formation decellules 'geantes' dans des cultures traitees.

III. Action d'un analogue de la puromycine, l'aminonucleosidede la puromycine

1. Effets cytologiques

L'ANP a ete utilisee a une c molaire equivalente a celle utilisee avec la PUROsoit 0,1/tg/ml (2 ,5X10~ 7 M) et a diverses autres concentrations c: 0,01-1 etJ0/<g/ml.

9-2

132 A. M. DUPRAT

Les anomalies nucleaires qui apparaissent affectent principalement les nucle-oles. Ces organites cellulaires se determent parfois et deviennent plus ou moinsvesiculeux ou contrastes (Fig. 4B). La chromatine generalement peu visible encontraste de phase s'epaissit en mottes ou filaments egalement assez contrastes.

FIGURE 4

Photographies effectives sur le vivant, en contraste de phase.ch, chondriome; n, nucleole.

(A) Cellule temoin presentant 4 nucleoles arrondis d'aspect homogene, unechromatine diffuse peu visible, et un chondriome filamenteux.(B) Cellule traitee par Faminonucleoside de la puromycine (1 /<g/ml). Les nucleolespresentent des zones tres contrastees, la chromatine a tendance a former des amascontrastes, le chondriome est fragmente en petites mitochondries.

Dans le cytoplasme, sous Faction de cette substance, le chondriome habituelle-ment constitue de filaments flexueux dans les cellules temoins, se gonfle endonnant parfois des images de cavulation ou au contraire se fragmente commeil le fait sous l'action de la PURO (Fig. 4B). On note egalement une retractioncellulaire de plus ou moins grande importance accompagnee quelquefois del'apparition de ' vacuoles' cytoplasmiques. Nous avons pu observer des mitosesdans des cultures traitees par l'analogue de la PURO, meme apres que letraitement a debute depuis plusieurs jours. L'utilisation des reserves deuto-plasmiques ne semble pas inhibee par le traitement.


2. Action de I'ANP sur la differentiation cellulaire

Nous avons traite par cet analogue de la PURO des cellules encore morpho-logiquement indifferenciees, immediatement apres que leur etalement se soitproduit. Nous n'avons pas observe d'action inhibitrice sur la differenciationmorphologique. Des myofibrilles striees sont apparues et se sont developpeesdans les myoblastes (Fig. 3C). De meme nous avons pu suivre l'apparition et lacroissance d'axones dans des neurones ou la formation d'une ciliature animeede battements sur des cellules de type epithelial.

Ces resultats appuient done l'hypothese precedemment formulee et per-mettent de penser que la PURO (0,15/tg/ml) qui empeche l'apparition de Jadifferenciation morphologique, inhibe pour ce faire des mecanismes lies a lasynthese proteique.

IV. Action combinee de l'actinomycine D et de la puromycinesur la differenciation morphologique des cellules

Compte tenu des connaissances acquises en etudiant les effets de la PUROsur la differenciation cellulaire, nous avons associe l'action de ces deux inhibi-teurs afin de preciser la possibility d'existence dans les myoblastes de m-RNA avie longue. Pour ce faire, on a traite les cellules indifferenciees par une solutioncontenant a la fois de la PURO (0,15/*g/ml) et de l'actinomycine (0,25 /^g/ml)pendant des durees de 24, 48, 72 et 96 h, afin de bloquer la differenciationmorphologique des cellules et la synthese de RNA. Ces cultures ont ensuite etereparties en trois lots (Fig. 5).

Dans le premier lot, les cultures sont maintenues en presence de PURO seuleet aucune differenciation ne s'y manifeste; dans le second, elles sont remisesen contact avec un milieu normal sans actinomycine ni PURO, et les myo-blastes seuls s'y differencient et y survivent, ce qui confirme nos resultatsprecedents concernant Faction a long terme de l'actinomycine D (Duprat et al.1966). Dans le troisieme lot, le milieu traitant (actinomycine + puromycine) aete remplace par une solution contenant de l'actinomycine seule, a la memec (0,25 /Ag/ml) afin de permettre la reprise eventuelle des syntheses proteiquesspecifiques de la differenciation des myofibrilles tout en maintenant le blocagedes syntheses de RNA. La differenciation des myoblastes en fibres striees estalors intervenue apres 48 h de delai, quand le traitement prealable en presencede PURO n'avait pas depasse 72 h. L'actinomycine n'a done pas d'effet inhibi-teur sur cette differenciation, ce qui confirme nos precedents resultats (Dupratet al. 1966).

La differenciation des myofibrilles intervient done alors que les syntheses deRNA ont ete bloquees depuis 5 jours par l'actinomycine. Ceci renforce l'hypo-these que nous avions formulee sur la presence de RNA(s) de type messager alongue duree de vie, dans les myoblastes d'Amphibiens Urodeles. En effet,

134 A. M. DUPRAT

l'information genetique presente dans le cytoplasme de ces cellules n'a puaboutir au debut de la formation des myofibrilles qu'apres un delai de 5 joursdu a Faction inhibitrice de la PURO, et alors que les autoradiographies mon-trent que la [3H]uridine n'est pas incorporee dans le RNA, pendant cette memeperiode, sous Faction de l'actinomycine. Des recherches biochimiques ont

Mise en culture Etalementi,1°jour 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

I I I I I I I I I I I *A (tous les types cellulaires)

TemoinsX A.

\ I I I Y///Y///X///A77/A///A///A'/AActinomycine D (0,25-5 Ag/ml) ' • * ' • * (myofibrilles seulement)

Premier f r-lot \ I .

Pas de differenciation morphologique

Deuxieme J ' ^ P. ' A (tous les types cellulaires)

lot

I I I k\\\T\\\H\\\Puromycine (0,15/<g/ml) I P- A (tous les

•y types cellulaires)

T r o i s i e m e •.*•: Hu A (myofibrilles seulement)

lot P. + A.

Puromycine+actinomycine D ^ W- A(myofibrillesseulement)

A Apparition de la differenciation morphologique

| A. Introduction de l'actinomycine D, Y//\

| P. Introduction ou retrait de la puromycine, [ \ \ j

f i.i. Apparition d'inclusions intranucleaires sous faction de l'actinomycine D

Fig. 5. Action combinee de l'actinomycine D et de la puromycine.

certes etabli que de tres faibles syntheses de RNA peuvent persister en presenced'actinomycine et elles pourraient ne pas etre decelees par autoradiographie. 11faudrait alors supposer que de telles syntheses persisteraient uniquenient dansles myoblastes en depit des alterations intranucleaires (Duprat et al. 1965, 1966),et y conduiraient a la formation de m-RNA(s) specifiques des syntheses pro-teiques intervenant dans la structuration des myofibrilles.

Si Ton admet done la presence dans les myoblastes de m-RNA(s) a vielongue gouvernant la mise en place des structures myofibrillaires, le fait que salongevite puisse depasser de plusieurs jours le delai normal de cette mise enplace apparait comme particulierement significatif.


DISCUSSION

Nous venons de voir que selon la concentration a laquelle elle est utilisee et laduree du traitement, la PURO a une action inhibitrice ou non sur la differen-ciation morphologique de cellules embryonnaires d'Urodeles cultivees in vitro.Des concentrations elevees entrainent un blocage irreversible de la differencia-tion des cellules, accompagne d'une inhibition des syntheses proteiques et duRNA nucleolaire. Studzinski & Love (1964) ont observe dans le cytoplasme decellules HeLa traitees par de fortes c de PURO la formation d'inclusions richesen ribonucleoproteines semblables a des nucleoles. L'auteur suggere que 1'appa-rition de ces inclusions cytoplasmiques resulterait de ^interruption des synthesesproteiques. Nous n'avons pas note un tel phenomene dans nos cultures. Lesconcentrations tres faibles ne semblent pas affecter le metabolisme cellulaire.Des concentrations faibles bloquent la differenciation morphologique descellules sans toutefois inhiber toutes les fonctions cellulaires. Quand les cellulessont replacees en milieu normal apres une duree de traitement variable, onpeut observer la reversibilite du phenomene de blocage a condition que letraitement ne depasse pas trois jours a 18 °C. La technique autoradiographiquene decele pas de difference dans le marquage par la [3H]uridine des cellulestemoins et traitees. II semble done que ces concentrations de PURO ne per-turbent pas les syntheses de RNA. L'incorporation de deux acides aminesmarques, neutre et basique, est plus ou moins fortement inhibee selon lesseries de cultures. Des resultats analogues ont ete obtenus par action de lacycloheximide, autre inhibiteur des syntheses proteiques (Duprat, 1969a). Unanalogue de la PURO, l'aminonucleoside de la puromycine, qui n'est pas uninhibiteur specifique des syntheses proteiques, n'empeche pas l'apparition, nirevolution de la differenciation morphologique des cellules.

On peut done d'ores et deja conclure que la differenciation morphologique detous les types de cellules cultivees implique des systemes cellulaires qui sont enrelation etroite avec des syntheses proteiques.

Faut-il exclure la possibilite que le materiel proteique fondamental soit dejaen place dans la cellule? Ce serait admettre qu'il devrait pouvoir se structurermeme en l'absence de toute synthese proteique nouvelle. Or, des enzymesspecifiques, e'est-a-dire d'autres proteines, doivent etre indispensables a cettestructuration et e'est leur formation qui pourrait etre inhibee selectivement,empechant l'organisation des proteines eventuellement pre-existantes.

Deux hypotheses peuvent etre avancees pour essayer d'expliquer les effets deconcentrations faibles de puromycine (ou de cycloheximide), qui bien quen'inhibant pas totalement l'incorporation de divers acides amines, entrainentun blocage reversible de la differenciation morphologique des cellules. On peutsupposer:

(a) Soit que Pantimetabolite inhibe qualitativement ou quantitativement lasynthese de certaines proteines specifiques structurales ou enzymatiques impli-

136 A. M. DUPRAT

quees dans la differentiation morphologique (formation des myofibrilles,formation et croissance des axones, par exemple).

(b) Soit que l'antimetabolite, tout en n'inhibant pas completement les syn-theses proteiques fondamentales, perturbe des constituants ou organites cellu-laires precis intervenant dans l'organisation structurale de ce materiel proteique.Ces constituants alteres pourraient ne plus remplir eux-memes leur role, cequi entrainerait indirectement l'arret des syntheses proteiques concernant ladifferentiation morphologique.

Dans le cadre de cette derniere hypothese nous avons ete amenee a envisagerle role actif que pourrait jouer le chondriome dans la structuration des myo-fibrilles par exemple, etant donne d'une part les contacts etroits que Ton observeentre eux et d'autre part le fait qu'il existe des syntheses proteiques mitochon-driales. On a vu que le chondriome presente des alterations morphologiquessous l'action de la puromycine (ou de la cycloheximide).

Mais les resultats obtenus apres action de l'actinomycine D sur les myo-blastes, de l'aminonucleoside de la puromycine et de temperatures supra-normales sur toutes les cellules (Duprat, 19696), montrent que la differentiationcellulaire survient malgre la presence d'alterations souvent importantes duchondriome, ce qui parait exclure la necessite d'une integrite absolue deschondriosomes au cours de cette phase ultime de la differentiation. 11 sem-blerait done que contrairement a ce que nous avions suppose le chondriome nejouerait pas un role direct dans les mecanismes de la differentiation morpho-logique des cellules.

II est done vraisemblable que le processus de la differentiation morpho-logique des cellules implique un ensemble de mecanismes lies a des synthesesproteiques specifiques, inegalement sensibles a l'action de la PURO ou d'autresinhibiteurs des syntheses proteiques comme la cycloheximide.

SUMMARY

Action of puromycin and an analogous substance on the differentiation ofamphibian embryonic cells cultured in vitro

Embryonic cells of Pleurodeles waltlii and Ambystoma mexicanum neurulae were culti-vated in vitro in the presence of various concentrations of puromycin and of puromycinaminonucleoside. When puromycin, an inhibitor of protein synthesis, is added to the culturemedium (0-15/*g/ml) before morphological differentiation of cultivated cells is established,the following effects are observed:

(a) Cytological damage becomes conspicuous (nucleolus, chromatin, mitochondria, etc.).(b) Cellular morphological differentiation is inhibited although other cellular functions

remain active.(c) This blockage phenomenon is reversible, but only if the duration of the treatment does

not exceed 3 days, even in presence of actinomycin D (third group, Fig. 5).These results are similar to those obtained with cycloheximide, another inhibitor of

protein synthesis.An autoradiographic study allowed us to state that puromycin inhibits [3H]uridine incor-

poration into the nucleolus but has no effect on that into the nucleoplasm. Similarly, theRNA migration from nucleus to cytoplasm does not seem to be affected by the drug. On

Puromycine et cellules embryonnaires 137the other hand, puromycin (0-15/<g/ml) has an inhibitory effect on the incorporation ofvarious amino acids which is more or less noticeable according to the sensitivity of the batchesof spawn. Inhibition of protein synthesis is therefore correlated with inhibition of morpho-logical differentiation. Indeed, puromycin aminonucleoside, which is not an inhibitor ofprotein synthesis, does not affect morphological differentiation of cells.

It is concluded that the effect of puromycin is related to its inhibitory action on proteinsynthesis.

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action de la puromycine et d'une substance analogue sur la ... · chromatine, chondriome...)....

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