BIOT 2016251st National ACS Meeting, San Diego, CA

Liquid Hot Water Pretreatment InhibitorsEduardo Ximenes1, Youngmi Kim2, Cristiane Farinas3 

Michael R. Ladisch1

1Laboratory of Renewable Resources EngineeringPurdue University

2Agricultural Engineering TechnologyU. Wisconsin, River Falls

3Embrapa InstrumentacaoSao Carlos, Brazil

March 14, 2016

BIOT 153:  Biofuel and Biobased Chemical Production:  Biomass Pretreatment and Hydrolysis Presiding:  Marcus Foston and Michael Resch

Acknowledgements

Purdue University Colleges of Agriculture and Engineering    Agricultural and Biological EngineeringHatch Act Projects 10646 and 10677

US Department of Energy Cooperative Agreement GO18103, GO17059‐16649, 0012846; DE‐SC0000997

Embrapa:  Dr. Cristiane Farinas (U. Sao Carlos, Brazil)

Types and Sources of Biomass

a. Agricultural residuesGlobal, US Midwest, China, Brazil

b. WoodUpper Midwest US, Canada (hardwoods)Southeast US (softwoods)Europe (softwoods, hardwoods)

c. Purposely grown energy crops (in the future)Brazil (energy cane and sugar cane)US (switchgrass, poplar)Africa (grasses, energy crops)

Composition of Lignocellulosic Biomass

Glucan44%

Xylan17%

Lignin32%

Acetyl groups3%

Ash2%

Extractive2%

Hardwoods Similar Compositions:

Corn residueSugar Cane BagasseSwitch grass

Lignin a big factor

Pretreatment and Cost Effective Enzymes are KeyPretreatment

makes substrate susceptibleincreases yield of fermentable sugars (and ethanol)in theory, reduces required enzyme dose for hydrolysis 

Mosier et al, 2005

Liquid Hot Water Pretreatment vs Steam Explosion

Both use water (liquid or steam)Steam explosion

- may add acid (to hydrolyze xylan)- releases pressure through explosive decompression

Liquid hot water (LHW) cooking- carried out under pressure (heat up to cool down)- conditions keep water in liquid phase- pH at 4 to 7; lignocelluloses self-buffer to this pH- no chemicals added- temperatures between 120 and 215 C

Pretreatment also releases or forms inhibitors

Released: xylo‐oligosaccharides,  phenols, tannic & acetic acids            Formed: aldehydes (furfural, hydroxy‐methyl furfural)

Degree

 of Inh

ibition

Pretreatment Type

Acid Neutral AlkalineNovo, 2009

16

00 6 12

8g/L Ethanol

Fermentation Time

Hydrolyzed XO only

Hydrolyzed xylo‐oligosaccharides (XO)and bio‐abatement

Control –no treatment

Bio‐abatement only

Bioabatement removes acetic acid, furfural, hydroxymethylfurfural and phenolicsHydrolysis with Bio‐mimetic removes xylo‐oligomers (XO) 

Fermentation of glucose to ethanol by yeast

Cao et al., 2013; 2015; Nichols, Kim et al., 2016

Enzyme Inhibitors Correlate to Color

Wash Liquid from Liquid Hot Water Pretreated Hardwood

Methanol and Acetone Samples for LC analysis

Retention Time

AU at 2

80 nm

Reverse Phase  Chromatography of Compounds Recovered by XAD‐7 and Back‐extracted into Methanol

Kim et al, 2013

Retention Time

AU at 2

80 nm

RPC of Compounds dissolved in Acetone

Kim et al, 2013

Tannic acid

O

OCH3

OH

VanillinO

OH

H3CO OCH3

Syringaldehyde

OH

OH

O

4-hydroxybenzoic acid

O

OH

Transcinnamic acidO

OH

HO

ρ-coumaric acidO

OH

HO

CH3O

Ferulic acid

Phenolic molecules inhibit enzyme hydrolysis of cellulose

Mechanisms of inhibition by phenols

Oligomeric phenolics may inactivate cellulases by reversibly complexing with them;

Enzyme‐tannic acid interactions show distinct specificity even in the same family of cellulases;

Kinetic analysis : inhibition  of a GH11 endo‐β‐1,4‐xylanase from Thermobacillusxylanilyticus followed a “multi‐site,” non‐competitive inhibition mechanism, indicating that more than one aromatic molecule interacts with the enzyme molecule to induce its complete inactivation

Boukari et al. J. Mol. Catal. B: Enzym., 72, 130–138 (2011)Tejirian and Xu. Enzyme Microb. Technol., 48, 239–247 (2011)Olsen et al. Enzyme Microb. Technol., 49, 353–359 (2011)

0

20

40

60

80

100

Dea

ctiv

atio

n (%

)

p-NPGase activity

Cellobiase activity

Tannic acid

Gallic acid

Cinnamicacid

Ferulicacid

ρ-Coumaricacid Sinapic

acid

VanillinSyringaldehyde

4-Hydroxybenzoicacid

0

20

40

60

80

100

Dea

ctiv

atio

n (%

) p-NPGase activity

Cellobiase activity

Tannic acid

Gallicacid

Cinnamicacid

Ferulicacid

ρ-Coumaricacid

Sinapicacid

VanillinSyringaldehyde

4-Hydroxybenzoicacid

β‐glucosidase in A. niger (Novozyme 188)

β‐glucosidase in T. reesei (Spezyme CP)

Phenols are also major deactivators of β‐glucosidases 

Ximenes et al, 2010, 2011

15

Loss of β‐G suppresses cellulose hydrolysis 

Cellulose Cellobiose Glucose

Cellulase(CBH, EG) β‐glucosidase

a cascade of enzyme inhibition is triggered by β‐glucosidase depletion due to its binding onto lignin

Cellobiose builds up and inhibits cellulase activity

Ladisch et al, 1976; Gong et al. (1977), Hong et al. (1981)

High Enzyme Loadings = High Yields at High Severity for Washed Pretreated Hardwoods

Ko et al, 2015

1.   Liquid hot water pretreatment modifies lignin structure and exposes it to a greater extent

2.   Lignin binds cellulase non‐productively

3.   Control of non‐productive binding enhances the enzymatic hydrolysis of cellulose

17

Hypotheses for Inhibition by solid lignin 

A

B  

C 

D  

E

F

5 µm 5 µm

4 µm

5 µm

4 µm 2 µm

Untreated log Ro = 11.56 log Ro = 12.51

Morphological changes of pretreated wood18

Syringyl‐Guaiacyl (S‐G) type hardwood lignin → G‐rich type (Softwood like)

• Increase in AIL/ASL ratio• Increase in glass transition temperature• Decrease in methoxyl (OCH3)groups

Study of modifying lignin structure through genetic engineering:• Decrease in lignin content (Chen and Dixon, 2007) • S/G ratio regulation (Chapple et al. 2007; Bonawitz et al. 2014) • Cellulose hydrolysis in LHW pretreated transgenic plant with S‐rich lignin > G‐

rich lignin (Li et al. 2010, Bonawitz et al, 2014)

19

Pretreatment modifies lignin structure

S‐lignin G‐lignin

Lignin(from Kim severity)a

EmaxMaximum capacity(mg‐protein/g‐lignin)

KAffinity 

(mL/mg‐protein)

Kp = Emax× KPartition coefficient

(mL/g‐lignin)

10.44 37.0 2.8 105.111.39 44.8 2.9 130.211.56 44.5 3.0 132.912.51 36.6 4.9 178.2

Lignin from higher severity pretreatments    adsorbs enzymes more strongly 

E ads = adsorbed enzyme (mg/g‐lignin)E free = free enzyme in supernatantE max = maximum adsorption capacityK = Affinity constant

aKim et al. (2013)

Glass transition temperature (Tg)

Lignin severity Tg (°C) Range (°C)

10.44 171.9 ± 0.1 150‐18811.39 170.8 ± 0.1 150‐18511.56 174.2 ± 0.5 155‐18812.51 179.7 ± 0.1 160‐205

Differential scanning calorimetry (DSC)

Scanning temperature range: 0‐220°C

Heating rate: 10°C/min

Tg: a mid‐point of heat capacity changes 

21

MwEnzyme control

Free protein in supernatant

SDS‐PAGE analysis of proteins in supernatant after contact with lignin 22

Shows adsorption of β‐glucosidases (78‐94 kDa)

CBH I (54 kDa)

CBH: Cellobiohydrolase, EG: Endoglucanase, XYN: Xylanase

CBH II, EG I (48‐50 kDa)EG II (44 kDa)

EG III‐V, XYN I‐III (24‐38 kDa)

Enzyme: Ctec2

Addition of BSA to Enzyme                                High Yield at Lower Enzyme Loading and High Severity

BSA Added

No BSA Added

No Pretreatment

Cellic Ctec2 of 5 FPU (8 mg protein)/g glucan, pH 4.8, in 50 mM citrate buffer, 50°C, 200 rpm for 168 hrs.   Equivalent to 3.5 mg/g total solids prior to pretreatment 

Kim et al, 2015

24Diluting Enzyme with Non Catalytic Protein Increases Yield

As specific activity decreases, conversion increases

Cellulase loading fixed at 1.8 FPU / g glucan, equivalent to 1.3 FPU / g pretreated solids

Kim et al, 2015

Summary

LHW pretreatment modifies lignin structure to be more condensed and S‐deficient form

Enzyme is lost due to non‐productive binding onto lignin

‐ More condensed lignin (higher Tg) adsorbs enzymes more strongly 

‐ Loss of β‐glucosidase from enzyme mixture triggers severe inhibition

‐ Blocking lignin surface decreases enzyme adsorption and improves 

glucose yield

‐ Enzyme required for hydrolysis is as low as 1.3 FPU / g solids

25

Conclusions

Cellulose surface area made accessible by pretreatment enhances hydrolysis yield

Lignin shields cellulose from hydrolysis and interferes with enzyme action both before and after pretreatment 

Inhibition / deactivation varies with pretreatment severity.  

Major reductions in amounts of enzyme needed for cellulose hydrolysis are possible by:

blocking enzyme adsorption by lignin and removing soluble inhibitors derived from lignin