EFECTO DEL EXTRACTO HIDROALCOHOLICO DE Terminalia catappa L. “almendro de la india” FRENTE A RADICALES LIBRES INDUCIDOS POR TETRACLORURO DE CARBONO EN CEREBRO DE Rattus rattus VARIEDAD ALBINUS.

Blgo. Abhel Calderón Docente de Fisiología y Bioquímica de la Escuela de Medicina Humana, Universidad Cesar Vallejo.

Mblgo. Patricia Torres Investigadora del Dpto. de Química Biológica y Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo.

Msc. Orlando Pretel, Docente de Fisiología Animal, Dpto. de Química Biológica y Fisiología Animal de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo.

RESUMEN

El extracto hidroalcohólico de las hojas de Terminalia catappa L.

“almendro de la india” fue ensayado in vivo para determinar su acción

antioxidante a nivel de cerebro en Rattus rattus variedad albinus tratadas con

tetracloruro de carbono. Se trabajó con dos grupos, el control conformado por

un subgrupo control positivo y un subgrupo control negativo a los cuales se les

administró tetracloruro de carbono 1ml/Kg de peso corporal y 2 ml de solución

salina fisiológica respectivamente; y, el grupo experimental conformado por dos

subgrupos tratados con el extracto hidroalcohólico de Terminalia catappa: uno

con 0.8mg/kg de peso corporal y el otro con 1.5mg/Kg de peso corporal, por

siete días. En todos los grupos se determinaron la cantidad de radicales libres en

cerebro por la técnica de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico;

obteniéndose en el control negativo una concentración promedio de 9,76ug

malondialdehído/g cerebro, en el control positivo una concentración promedio

de 26,68ug malondialdehído/g cerebro, y en el grupo experimental tratado con

Terminalia catappa a 0,8mg/Kg de peso corporal y 1,5mg/Kg de peso corporal,

se obtuvo una concentración promedio de 13,64ug malondialdehído/g cerebro y

15,80ug malondialdehído/g cerebro respectivamente. Se encontró que el grupo

tratado con el extracto hidroalcohólico de Terminalia cattappa a la

concentración de 0,8mg/Kg de peso corporal mostró una significativa inhibición

de los radicales libres comparado con el control positivo.

ABSTRACT

Hydroalcoholic extract of the leaves of Terminalia catappa L.,

"Indian Almond", was tested in vivo to determine its possible reaction to free

radicals in the brains of albino Rattus rattus.  Two groups, control and

experimental, were tested, the control group made up of a positive-control group

and a negative control group to which carbon tetrachloride was administered at 1

millilitre per kilo bodyweight plus two milliltres of physiological saline solution,

respectively.  The experimental group was made up of two subgroups treated with

the hydroalcoholic extract of Terminalia catappa for seven days, one with 0.8

milligrammes and the other with 1.5 milligrammes per kilo bodyweight.  The

quantity of free radicals in the brains was measured in all groups using

tiobarbiturate acid reactive-substances, giving in the negative-control group an

average concentration of 9.76ug cerebral mg, in the positive-control group an

average concentration of 26.68ug cerebral mg, and in the experimental groups

treated with Terminalia catappa at 0.8 milligrammes and 1.5 milligrammes per

kilo bodyweight an average concentration of 15.80ug cerebral mg respectively.  It

was found that the group treated with hydroalcoholic extract of Terminalia

catappa at 0.8 milligrammes per kilo bodyweight showed a significant free-

radicals inhibition compared to the positive-control group.  It was found that the

hydroalcoholic extract of Terminalia catappa at 0.8 milligrammes per kilo

bodyweight showed a significant free-radicals inhibition in the rats' brains.

I. INTRODUCCIÓN

Desde hace varios años se ha incrementado el uso de plantas medicinales,

con el propósito de disminuir la incidencia de enfermedades, así como también

contrarrestar en cierto grado la vejez y los efectos que esta conlleva (Pardo, 2003;

Hernández y Prieto, 2005).

Las plantas son fuentes de nuevos y mas eficientes antioxidantes, a los que la

farmacología puede recurrir para neutralizar los radicales libres, producidos por el

metabolismo celular y que están vinculados a diversas enfermedades

(Desmarchelier y Ciccia ,1998).

Muchas de las enfermedades del hombre como cáncer, arteriosclerosis,

artritis reumatoide, alzehimer, trauma cerebral izquémico e inclusive la vejez, son

producto del estrés oxidativo, esto ha sugerido la búsqueda de nuevas terapias

alternativas, evaluándose extractos de plantas con resultados satisfactorios (Pérez,

Sánchez y Bu, 1998; Velásquez, 2000; Carbonell, 2001; Céspedes, 2003).

En los últimos años se ha registrado gran interés por la función que cumplen

los radicales libres en el organismo. Se consideran Radicales Libres a aquellas

moléculas que en su estructura atómica presentan un electrón desapareado o impar

en el orbital externo, dándole una configuración espacial que genera una alta

inestabilidad. Es una entidad química que posee un electrón desapareado en su

orbital externo, esto lo hace muy inestable; extraordinariamente reactivo y de vida

efímera, con una enorme capacidad para combinarse inespecíficamente en la

mayoría de los casos. La formación de radical libre in vivo ocurre en la vía

catalítica de enzimas, durante los procesos de transferencia de electrones que

ocurre en el metabolismo celular, o por la exposición a factores exógenos. Con

todo, la condición de pro-oxidante a radical libre puede aumentar debido a la

mayor generación intracelular o por la deficiencia de los mecanismos

antioxidantes que resultan en la inducción de daño celular por los radicales libres,

este proceso es llamado estrés oxidativo (Desmarchelier y Ciccia, 1996; Pérez,

Sánchez y Bu, 1998; Pires y Greggi, 1999; Céspedes, 2000; Rodríguez, Menéndez

y Trujillo, 2001; Hoyl, 2001; Pardo, 2003).

Existen muchas moléculas que pueden disminuir el estrés oxidativo, y por lo

tanto sus efectos. Los tejidos vegetales son los principales sistemas biológicos que

sintetizan antioxidantes como: a-tocoferol, acido ascórbico y carotenoides, pero

además son ricos en una amplia variedad de polifenoles. Muchos alimentos de

origen vegetal son ricos en flavonoides hidroxilados y otros compuestos fenólicos

que se encuentran en estado natural en cantidades que van desde trazas hasta

gramos por kilogramo de material fresco, a los que se les ha demostrado

propiedades antioxidantes (Crozier y col. 2000; Urquiaga y Leighton, 2000;

Russo y Esperanza, 2001; Hernández y col. 2003; Miquel y Ramírez-Bosca).

La familia Combretaceae reúne numerosas especies que han sido estudiadas

por su empleo con fines medicinales, entre esta se encuentra Terminalia catappa

L. “almendro de la india”. Las hojas de T. catappa han sido utilizadas desde hace

mucho tiempo en la india y zonas tropicales y subtropicales, en medicina

tradicional para el tratamiento de dermatitis y la hepatitis. Hoy en día diversos

estudios le atribuyen propiedades hepatoprotectoras, antiinflamatorias,

bactericidas, antivirales y antiparasitarias (antidisentericas). Recientes

investigaciones le han otorgado propiedades antidiabetógenas. (Chu y col. 1998;

Fan y col.2003; Hernández y col. 2003; Nagappa y col. 2003; Babayi y col. 2004;

Tang y col. 2004; Chitmanat, Tongdonmuen y Nunsong, 2005 ).

Las sustancias que le confieren estas propiedades a T. catappa son

fundamentalmente taninos hidrolizables como punicalagina, punicalina, ácido

chebulagico, geranina , entre otros (Hernández, Rojo y Olivares, 2003).

El presente estudio, estuvo orientado a determinar el efecto antioxidante del

extracto de T. catappa, frente a radicales libres inducidos por tetracloruro de

carbono en cerebro de rata.

2

II. MATERIAL Y MÉTODO

1. Material.

Hojas de Terminalia catappa recolectadas en el jardín botánico de “Bellas

artes”; en la Provincia de Trujillo, entre los meses de Mayo – Junio del año

2008.

Rattus rattus variedad albinus, machos, raza Holtzman adquiridas de la

Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima.

2. Procedimiento.

2.1. Obtención del extracto hidroalcohólico de Terminalia catappa L.:

Las hojas de Terminalia catappa, recolectadas fueron identificadas

en el Herbarium Truxillense de La Universidad Nacional de Trujillo.

La superficie de las hojas se lavó con agua corriente, luego con agua

destilada y se desengrasó con alcohol etílico al 70%, desecándose

completamente en estufa a 50ºC; luego se procedió a molerlas con la ayuda

de un molino y se tamizó hasta la obtención de un polvo fino.

Se tomó 200g de este polvo fino y luego se procedió a la extracción de los

compuestos activos mediante maceración, en una mezcla hidroalcohólica

de 70% de butanol y 30% de agua bidestilada, en frascos ámbar de cierre

hermético, con agitación por 5 minutos diarios por 10 días.

Luego se filtró al vació en papel filtro Watman Nº 1, evaporándose el

filtrado por ventilación hasta la obtención de un producto cristalino que fue

conservado en refrigeración hasta su utilización (Kuklinski, 2002).

2.2. Preparación y administración de la dosis del extracto hidroalcohólico

de T. catappa L.

Se preparó una solución del extracto de T. catappa de 10mg /ml en agua

bidestilada.

Dosificación: se administró vía oral mediante sonda gástrica las

concentraciones de 0,8 a un grupo y 1,5mg al otro grupo experimental del

extracto de T. catappa/Kg de peso corporal, por cuatro días consecutivos,

luego después de media hora de la última dosis 8 (cuarto día) se administró

1 ml/kg de peso corporal de tetracloruro de carbono (TTC); continuándose

con las mismas dosis de T. catappa del quinto al sétimo día

respectivamente.

Para el control positivo: se administró vía oral mediante sonda

gástrica la cantidad de 2ml de solución salina fisiológica (SSF) durante

cuatro días, al cuarto día después de media hora de la administración de

SSF se administró 1 ml/kg de peso corporal de tetracloruro de carbono,

continuándose el tratamiento con SSF del quinto al sétimo día

Para el control negativo: se administró vía oral mediante sonda

gástrica la cantidad de 2ml de SSF/ día durante siete días.

2.3. Determinación de radicales libres:

Se utilizó el método de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico

(TBARS), usándose 1g de cerebro de R. rattus variedad albinus en 5mL de

solución Krebs (NaCl: 119mM, KCl: 4.6Mm, NaHCO3: 15mM, CaCl2:

1.5mM, MgCl2: 1.2mM. NaH2PO4: 1.2mM y glucosa: 11mM), el cual se

homogenizó, en un homogenizador mecánico, luego fue llevado a

incubación por 30 minutos a 37oC, después fue desproteinizado con 1mL

de ácido tricloroacético al 20%, sometiéndose a ebullición en baño maría

por 15 minutos para luego centrifugar a 4000 rpm por 30 minutos. Se

obtuvo el sobrenadante, el cual se separó en otro tubo de ensayo al cual se

le agregó 1mL de ácido tiobarbitúrico al 1% para determinar la cantidad de

radicales libres (mediante la determinación de malondialdehído, compuesto

formado como subproducto de la peroxidación lipídica causada por los

radicales libres), sometiéndose también a ebullición en baño maría por 15

minutos, para luego centrifugar a 4000 rpm por 20 minutos; obteniéndose

un compuesto cromóforo rosado que se midió en espectrofotómetro

a 535nm. Los valores obtenidos en absorbancia, fueron procesados,

4

expresándose la concentración de malondialdehído en ug/g de cerebro

(Desmarchelier y Ciccia , 1996; Moore y Roberts, 1998; Fan y col, 2003;

Hernández y col., 2006).

2.4. Análisis Estadístico de datos:

Los datos fueron analizados utilizando el ANAVA (análisis de

varianza), además, se utilizaron intervalos confidenciales simultáneos para

efectos de tratamientos.

5

III. RESULTADOS

En las tablas se aprecia que en el control positivo se obtuvo la mayor

concentración promedio de malondialdehído (radicales libres) en cerebro de

Rattus rattus que fue de 26,68ug/g de cerebro; en aquellos individuos que no

recibieron tratamiento, por el contrario, la menor concentración promedio es de

9,56ug/g de cerebro y en los grupos experimentales, en los individuos a los cuales

se les administro tetracloruro de carbono y que fueron tratadas con una

concentración del extracto de T. catappa de 0,8mg/Kg y 1.5mg/Kg de peso

corporal respectivamente.

Tabla 1: Concentración promedio de malondialdehído (radicales libres) en cerebro de

Rattus rattus var. albinus, en el grupo control negativo, tratado con solución

salina fisiológica (SSF); control positivo, tratado con tetracloruro de carbono

(TCC); y grupo experimental tratado con extracto hidroalcoholico de T.

catappa a las concentraciones de 0,8mg/Kg de peso corporal y 1,5mg/Kg de

peso corporal más tetracloruro de carbono (TCC).

Malondialdehído (ug/g de cerebro)

Grupo Control Grupo Experimental

T. catappa T. catappa SSF TCC (0.8mg) (1.6mg) + + TCC TCC

9.56 26.68 13.56 15.82

p<0.05

Figura 1: Gráfico de barras que muestra la cantidad de malondialdehído (radicales

libres) producido en los cuatro grupos de experimentación.

11

IV. DISCUSIÓN

Cuando una dosis de tetracloruro de carbono (TCC) vía oral entra al

organismo, en un tiempo de tres horas alcanza niveles máximos en sangre,

hígado, riñón, cerebro y músculo. Un número de sustancias aumentan la

biotransformación de TCC y refuerzan su intoxicación; entre éstas sustancias se

encuentran la dieta de alto grado en grasas y el etanol, particularmente se piensa

que éste último es responsable de la inducción del isoenzima Citocromo P450

implicado en la bioconversión del TCC a los metabolitos que, en el tejido

inician la lipoperoxidación (Obi y col. 2001).

El citocromo P450 participa en el metabolismo de sustratos endógenos de

importancia biológica como el colesterol, ácidos biliares, hormonas esteroidales

y ácidos grasos. Además participa en el metabolismo de sustratos de naturaleza

exógena como drogas, pesticidas, procarcinógenos, anestésicos, solventes

orgánicos entre muchos otros. El TCC se metaboliza por el citocromo P450, el

cual transfiere un electrón al compuesto, produciéndose radicales altamente

reactivos. Este proceso de transformación se realiza en el hígado (Chilo, 1999;

Orellana y Guajardo, 2004).

En el organismo el TCC se disocia en radical triclorometilo (CCL3) y

radical triclorometil peróxido (CClO); la unión covalente de estos radicales con

las proteínas y lípidos celulares son considerados como el paso inicial de una

cadena de eventos que conducen a la lipoperoxidación de la membrana y

finalmente a la necrosis celular. Durante el estrés oxidativo o desequilibrio redox

la producción de radicales libres y los daños que estos pueden generar,

sobrepasan la capacidad de las células para eliminarlos y promover una eficiente

reparación de sus principales moléculas: ADN, proteínas y lípidos. La relación

de este fenómeno con los procesos neurodegenerativos puede estar asociado con

las propias características del cerebro; un órgano que presenta altos niveles de

ácidos grasos fácilmente peroxidables, consume el 20% del oxigeno incorporado

en el torrente sanguíneo y, no está específicamente enriquecido con enzimas

antioxidantes (Chilo, 1999; Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de

Enfermedades, 2005; Almaguer y Almaguer, 2006).

En la tabla 1, se pudo observar que los animales de experimentación

tratados con TCC, presentan un incremento en la concentración de

malondialdehído (radicales libres, el cual indica un daño celular) altamente

significativo, P<0.01, con respecto al grupo control negativo. En la tabla 2, en el

grupo control negativo, tratado con SSF, se observó que no existe daño celular

aparente. También se pudo observar diferencias altamente significativas,

P<0.01, entre los grupos experimentales y el control positivo (tablas 1, 3 y 4),

esto se debe al efecto protector que poseen los flavonoides, polifenoles, taninos

y muchas especies de moléculas presentes en el extracto de T. Catappa (Mauren

y col., 2003). Los flavonoides ejercen su acción antioxidante capturando y

secuestrando a los radicales libres, es decir , se unen a ellos donándoles un

hidrógeno y proporcionándoles por lo tanto estabilidad; los flavonoides también

actúan inhibiendo los enzimas oxidasas que favorecen la peroxidación lipídica

tales como la lipooxigenasa, ciclooxigenasa, mieloperoxidasa, NADPH oxidasa

y xantinooxidasa, evitando la generación de especies reactivas de oxígeno;

también inhiben la fosfolipasa A2, mecanismo por el cual los flavonoides

ejercen acción antioxidante. Se señala además que las propiedades antioxidantes

de los flavonoides están basadas en su estructura: con un grupo o-difenólico, un

doble enlace conjugado 2-3 y grupos hidroxilos en posiciones 3 y 5 (Pérez,

2003; Gao y col. 2004; Moreno, 2004; Guija, Troncoso, Guija, 2005).

No se encontró diferencias estadísticamente significativas entre los

tratamientos con T. catappa 0,8mg/Kg de peso corporal y 1,5mg/Kg de peso

corporal (Tablas 3 y 4), pero se pudo observar mayor inhibición de la formación

de radicales libres en el grupo que recibió el tratamiento con T. catappa de

0,8mg/Kg de peso corporal, lo que nos indica que no siempre el uso de dosis

más elevadas proporciona mayor protección antioxidante; cantidades elevadas

de flavonoides pueden tener comportamiento, de cierto modo, prooxidante, ya

que pueden ocasionar una reducción temporal del Hierro y Cobre, los cuales

sufren una autooxidación y pueden incluso involucrarse en un proceso redox, así

como también pueden afectar a los componentes del sistema de defensa

antioxidante; éstos metales además generan radicales libres mediante la reacción

de Fenton al formar el complejo Fe ATP/H2O2 (Guija, Troncoso y Guija, 2005;

Torres y col., 2007). Según un trabajo realizado por Maureen y col, 2003,

demuestran que tanto la Punicalagina como la Punicalina moléculas encontradas

en hojas de T. catappa mostraron actividad antioxidante a dosis muy bajas en un

modelo de daño hepático inducido por TCC en ratas.

Terminalia catapa L. a las concentraciones de 0.8 y 1.5mg/ Kg de peso

corporal demostró tener actividad antioxidante frente a los radicales libres

inducidos por tetracloruro de carbono, por lo que se recomienda realizar más

estudios para determinar otras propiedades medicinales y descartar efectos

colaterales; de tal manera que sea usado como una alternativa para el tratamiento

de enfermedades ocasionadas por los radicales libres.

V. CONCLUSIONES

El extracto butanólico de las hojas de Terminalia catappa L., utilizado a

una concentración de 0,8mg/Kg de peso corporal, disminuye los radicales libres

inducidos por Tetracloruro de Carbono en cerebro de Rattus rattus variedad

albinus.

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