aberrant neurogenesis after strokestroke.ahajournals.org/content/strokeaha/43/9/2468.full.pdf ·...

Aberrant Neurogenesis After StrokeA Retroviral Cell Labeling Study

Fanny Niv, MD; Silke Keiner, PhD; Krishna-K, PhD; Otto W. Witte, MD;Dieter Chichung Lie, MD; Christoph Redecker, MD

Background and Purpose—Adult neurogenesis in the dentate gyrus is a unique form of brain plasticity that is stronglystimulated after stroke. We investigate the morphological properties of new granule cells, which are born and developafter the ischemic insult, and query whether these adult-born neurons properly integrate into the pre-existinghippocampal circuitries.

Methods—Two well-established models were used to induce either small cortical infarcts (photothrombosis model) orlarge territorial infarcts (transient middle cerebral artery occlusion model). New granule cells were labeled 4 days afterthe initial insult by intrahippocampal injection of a retroviral vector encoding green fluorescent protein and newbornneurons were morphologically analyzed using a semiautomatic Neurolucida system and confocal laser scanningmicroscopy at 6 weeks.

Results—Approximately 5% to 10% of newborn granule cells displayed significant morphological abnormalitiescomprising additional basal dendrites and, after middle cerebral artery occlusion, also ectopic cell position. The extentof morphological abnormalities was higher after large territorial infarcts and seems to depend on the severity of ischemicdamage. An increased portion of mushroom spines in aberrant neurons suggests stable synaptic integration. However,poststroke generated granule cells with regular appearance also demonstrate alterations in dendritic complexity andspine morphology.

Conclusions—The remarkable stimulation of dentate neurogenesis after stroke coincides with an increased rate ofaberrantly integrated neurons, which may contribute to functional impairments and, hypothetically, favor pathogenesisof adjustment disorders, cognitive deficits, or epilepsy often seen in stroke patients. (Stroke. 2012;43:2468-2475.)

Key Words: adult neurogenesis � dentate gyrus � photothrombosis � plasticity � retroviral vectors

Neurogenesis in the adult hippocampus is a unique formof structural brain plasticity modified not only by

physiological stimuli, but also by brain insults such as stroke,epilepsy, and traumatic brain injury. Within the dentate gyrus,the generation, migration, differentiation, and maturation ofnewborn neurons appear to be precisely regulated therebyallowing proper integration of the neurons into the pre-existing hippocampal network.1–3 After brain ischemia, pro-liferation and differentiation of neuronal progenitors in thesubgranular zone of the dentate gyrus (DG) is stronglystimulated, leading to a significant increase in neurogen-esis.4–6 To date, it is unclear whether the abundance ofnewborn neurons generated after stroke properly integratesinto the hippocampal network. Experimental status epilepti-cus is also a powerful stimulator of adult neurogenesis in theDG7,8; however, it disrupts integration of these new granule

cells within the hippocampal network.9–11 Jessberger et al10

described a significant number of newborn neurons showingan aberrant morphology comprising additional basal den-drites directed into the hilus and, in some cases, an ectopicpositioning of the newborn cells. These morphologicalchanges are known to give rise to increased recurrent excit-atory circuitry12,13 and may represent a pivotal component ofthe epileptic disease process.

In this study, we investigated the fine morphology ofnewborn neurons generated after stroke as an indicator ofstructural integration into the pre-existing network. For thispurpose, we used retroviral cell labeling, which allows a detailedmorphological reconstruction of dendrites and spines of new-born neurons to investigate poststroke neurogenesis in smallcircumscribed cortical infarcts and large ischemic infarcts in themiddle cerebral artery territory. Our results indicate that stroke

Received April 14, 2012; accepted May 18, 2012.From the Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital, Jena, Germany (F.N., S.K., K.K., O.W.W., C.R.); Research Group Adult

Neurogenesis and Neural Stem Cells, Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum Munchen, German Research Center for EnvironmentalHealth, Neuherberg, Germany (C.D.L.); and the Institute of Biochemistry, Emil Fischer Center, University Erlangen-Nurnberg, Erlangen, Germany(C.D.L.).

The online-only Data Supplement is available with this article at http://stroke.ahajournals.org/lookup/suppl/doi:10.1161/STROKEAHA.112.660977/-/DC1.

Correspondence to Christoph Redecker, MD, Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital, Erlanger Allee 101, 07747 Jena,Germany. E-mail [email protected]

© 2012 American Heart Association, Inc.

Stroke is available at http://stroke.ahajournals.org DOI: 10.1161/STROKEAHA.112.660977

2468

by guest on June 11, 2018http://stroke.ahajournals.org/

Dow

nloaded from


Dow

nloaded from


Dow

nloaded from


Dow

nloaded from


Dow

nloaded from


Dow

nloaded from


Dow

nloaded from


Dow

nloaded from


Dow

nloaded from


Dow

nloaded from

http://stroke.ahajournals.org/lookup/suppl/doi:10.1161/STROKEAHA.112.660977/-/DC1

http://stroke.ahajournals.org/lookup/suppl/doi:10.1161/STROKEAHA.112.660977/-/DC1

http://stroke.ahajournals.org/










leads to a morphologically aberrant integration of adult newborncells in the DG, in which the extent of abnormalities increasedwith the size of ischemic damage.

Materials and MethodsInfarct InductionThe study was performed on a total number of 43 male Wistar rats.Animals were held under standard housing conditions in ordinary cages(4 animals/cage). Food and water were provided ad libitum. Allexperimental procedures were approved by the German Animal Careand Use Committee in accordance with the European Directives.

Photothrombosis ModelAfter anesthesia using 2.5% to 3.5% isoflurane in a mixture ofO2/N2O, animals were placed in a stereotactic frame, the scalp wasincised, and an optic fiber bundle (2.4 mm diameter) connected to acold light source (Schott KL 1500, Mainz, Germany) was positionedon the skull 0.5 mm anterior to bregma and 3.7 mm lateral to themidline above the forelimb sensorimotor cortex. Immediately afteronset of illumination (duration, 20 minutes), Rose Bengal (1.3mg/100 mg body weight in 0.9% NaCl) was injected through afemoral vein catheter. Throughout surgery, body temperature waskept constant at 36.5°C. Sham-operated animals received the sametreatment without illumination of the brain.

Middle Cerebral Artery Occlusion ModelAfter anesthesia, as described previously, the common carotid,external carotid, and pterygopalatine arteries were exposed andligated on the right side. The right internal carotid artery wasoccluded with a microsurgical clip and subsequently an arteriotomywas performed in the common carotid artery. A 3.0-monofilamentsuture (Doccol) with a rounded tip was inserted into the commoncarotid artery and advanced through the internal carotid artery tothe ostium to occlude the middle cerebral artery. After 60minutes, the suture was removed, the wound was closed, and therats were allowed to recover. Sham-operated animals (�control)received the same treatment without occlusion of the rightinternal carotid artery.

Retroviral VectorsWe used the retroviral vectors CAG-green fluorescent protein (GFP)and CAG-red fluorescent protein (RFP) to label newly generatedgranule neurons in the right DG.14 Viral vectors were produced bycotransfecting HEK 293 T cells with pCAG-GFP/pCAG-RFP andthe packing constructs pCMV VSVg and pCMVpg15 at a final titerof approximately 1�107colony-forming units/mL.

Experimental DesignIn a first set of experiments, we investigated the morphology ofnewborn granule cells generated after experimental ischemic in-farcts: rats (n�28, weight 250–270 g) were randomly divided into 4experimental groups and either underwent photothrombosis (PT;n�6), PT sham surgery (n�6, PT control), middle cerebral arteryocclusion (MCAO; n�10), or MCAO sham surgery (n�6, MCAOcontrol) in the right hemisphere on day P90. Four days later (P94),the animals received a stereotaxic injection of the CAG-GFPretrovirus into the dentate gyrus (1 �L virus, x�3.1 mm; y�1.5 mm;z�4.0 mm according to bregma) and were allowed to recover for 6weeks. In a second series of experiments, we further analyzedwhether resident neurons born weeks before the infarct show similarmorphological properties compared with adult newborn neuronsgenerated after stroke. For this purpose, P14 rats (n�15, weight20–25 g) received a first stereotaxic injection of CAG-RFP retroviralvector in the right dentate gyrus (1 �L virus, x�2.7 mm; y�1.0 mm;z�3.4 mm according to bregma). Four days after either PT (n�7) orMCAO (n�8) procedures, on P94, a second CAG-GFP retroviralvector injection was given as described previously. On day P132, allrats were anesthetized with diethylether and perfused transcardially

with 4% phosphate-buffered paraformaldehyde. No animals wereexcluded from further analysis.

ImmunohistochemistryAfter transcardial perfusion, brains were postfixed in paraformalde-hyde and 40-�m thick sections were sliced. Immunocytochemistrywas performed using a standard peroxidase technique and double-labeling immunofluorescence methods as described previously.16

The following primary antibodies were used: goat anti-GFP antibody(1:500; Acris, Herford, Germany), chicken anti-GFP antibody(1:1000; Aves Labs), rabbit anti-RFP antibody (1:500; Abcam,Cambridge, UK), mouse antineuronal nuclei antigen (1:500; Chemi-con, Temecula, CA), and goat antisynapsin I antibody (1:500; SantaCruz, Santa Cruz, CA). Secondary antibodies: Cy5 antimouse andCY3 antirabbit (1:250; Dianova, Hamburg, Germany), Alexa Fluor488 antigoat, and Alexa Fluor 488 antimouse (1:250; MolecularProbes, Leiden, The Netherlands) and fluorescein isothiocyanateantichicken (1:250; Chemicon). Standard peroxidase stained cellswere evaluated by light microscopy, whereas double-labeled cellswere analyzed by confocal laser scanning microscopy.

Quantification and Morphological Analyses

VolumetryInfarct and hippocampal volumes were measured in every eighth cresylviolet-stained section (40 �m). Volumes were calculated by multiplyingthe appropriate region with the section interval thickness.

QuantificationPeroxidase-stained GFP-positive cells were counted in every sixthsection of the complete ipsilateral DG. Phenotypes of GFP-positivecells were determined by light microscopy and percentages of cellswith morphological abnormalities (aberrant newborn neurons) werequantified. Two different types of aberrant morphologies of newbornneurons were defined: (1) bipolar cells in the granule layer of the DG

Figure 1. Morphology of experimental stroke. A, Photothrom-botic cortical infarcts (PT). B, Stroke induced by transient mid-dle cerebral artery occlusion (MCAO). C, Infarct and hippocam-pal volumetry 6 weeks after infarct induction. Bars representmean�SEM.

Niv et al Aberrant Neurogenesis After Stroke 2469


Dow

nloaded from


with basal dendritic processes directed toward the hilus; and (2)ectopically positioned cells located either beneath the subgranularzone in the hilus or in the extension of the adjacent CA region.

Dendrite AnalysisFor analysis of dendritic complexity of newborn neurons, a subset ofrandomly selected GFP-positive cells (10–17 cells per group) fromthe different experimental groups (control, PT, MCAO) were mor-phologically reconstructed using a semiautomatic Neurolucida sys-tem (MicroBrightfield, Colchester, VT) under a 63� oil lens magnifi-cation. In addition, we analyzed a subset of RFP-positive neurons

retrovirally labeled at P14 to compare resident granule cells withnewborn neurons (17 cells). Parameters evaluated included branchorder, number of apical dendrites, and apical dendritic length. Axonalprocesses could be easily distinguished from dendrites because of theirsmaller diameter and lack of dendritic spines.

Spine AnalysisSpinal analysis was performed using confocal laser scanning micros-copy (LSM 710; Carl Zeiss, Jena, Germany) as described previ-ously.9,17 Here, a dendritic segment (second branch order) measuring50 �m was analyzed and the total number of spines per 50 �m was

Figure 2. Retrovirally labeled newbornneurons generated after stroke. A, Exam-ples of newborn GFP-positive neuronswith regular gross morphology (A1–A2).Double-labeling of GFP (green) andNeuN (blue). B–C, Examples of newbornneurons with aberrant morphology com-prising additional basal dendrites towardthe hilus (bipolar cells, B) or ectopicposition within the extension of cornuammonis (CA, C1). C2, Magnification ofan ectopic neuron. C3, Schematic illus-tration of the distribution of ectopic neu-rons. D, Percentage of neurons withaberrant morphology in the differentexperimental groups (right diagram) andpercentage of ectopic and bipolar neu-rons in the MCAO group (left diagram).Bars represent mean�SEM. Asterisksindicate significant differences (P�0.05).GFP indicates green fluorescent protein;GCL, granule cell layer; MCAO, middlecerebral artery occlusion; ML, molecularlayer; NeuN, neuronal nuclei; PT, photo-thrombotic infarcts.

2470 Stroke September 2012


Dow

nloaded from


quantified. According to their tip diameter, further differentiationinto thin (0.25–0.6 �m) and mushroom spines (�0.6 �m) wasundertaken.

Statistical AnalysisStatistical analysis of cell counts was performed using one-wayanalysis of variance followed by the Tukey-Kramer post hoc analysisfor multiple comparisons. Data are presented as mean�SEM.

ResultsMorphology of Newborn Neurons GeneratedAfter StrokeAll animals with photothrombotic stroke had typical corticalinfarcts located in the forelimb sensorimotor cortex accordingto Paxinos and Watson.18 Correspondingly, animals thatunderwent transient MCAO showed infarcts covering theright middle cerebral artery territory including cortex andbasal ganglia, except the hippocampus formation (Figure1A). Infarct volumetry revealed significantly smaller infarctsafter PT (4.85�0.59 mm3) compared with MCAO(68.17�15.16 mm3; Figure 1B). Additional volumetry of thehippocampal formation revealed no differences between theexperimental groups (Figure 1C).

Six weeks after CAG-GFP injection, the majority ofnewborn neurons generated after stroke demonstrated typicalgross morphological properties of granule cells (approxi-mately 90%–95%) analogous to control animals. Namely, thedendrites of these newborn neurons showed a highly polar-ized morphology and apical dendritic processes with abun-dant spines extending into the molecular layer. Furthermore,axons reached their target area, CA3, through the mossy fiberpathway, indicating a regular integration into the hippocam-pal circuitry.2,19 However, a small fraction of newbornneurons (5%–10%) displayed notable differences in neuronalmorphology. In addition to the apical dendrites, a basaldendrite or even dendritic arborization was observed, whichresulted in bipolar morphology. These morphological aberra-tions were detected after both PT (4.97%�1.62%; P�0,04)as well as MCAO (10.05%�0.34%; P�0,007) and weremostly absent in control animals (0.27�0.1%), where onlyone single bipolar neuron was identified (Figure 2; online-only Data Supplement Table I) as found in the physiologicalstate and described in the literature.20 The number of aberrantnewborn neurons appeared to be higher in animals with largeterritorial infarcts (MCAO) compared with those with smallcortical infarcts (PT), but this difference did not reachsignificance. Furthermore, we detected newborn neuronsectopically located in the extension of the cornu ammonisadjacent to the hilus (Figure 2C). These ectopic neurons wereexclusively found in MCAO animals, possibly indicating anaberrant migration or even ectopic neurogenesis (Figure2C–D).

Dendritic MorphologyAlthough the majority of newborn cells after cerebral ische-mia appear to form regular morphological characteristics,detailed analyses of dendritic complexity revealed severaldisparities in newborn neurons generated after MCAO (Fig-ure 3; online-only Data Supplement Table I). Specifically,

newborn neurons with regular polarity and location within theDG displayed an increase in number of apical dendrites andthe dendritic length (Figure 3). These morphological differ-ences were only observed in animals that had undergoneMCAO. Newborn granule cells in PT animals and evenaberrant neurons from PT or MCAO animals did not showany differences in number of apical dendrites and dendriticlength compared with sham-operated controls (Figure 3).Further analysis of the highest branch order did not reveal anysignificant difference between the groups. Taking together,new neurons born after MCAO showed a significant in-creased complexity.

Figure 3. Dendritic morphology of newborn neurons generatedin the DG after stroke. A, Neurolucida reconstruction of GFP-positive neurons in the different experimental groups. Neuronswith bipolar morphology were observed after PT and MCAO,whereas ectopic neurons were exclusively found after MCAO. B,Peroxidase-stained sections demonstrating GFP-positive new-born neurons with regular and aberrant morphology in situ. C,Quantification of apical dendrites, dendritic length, and branchorder in the different groups of neurons showing a significantdifference in dendritic complexity between PT and MCAO. Barsrepresent mean�SEM. Asterisks indicate significant differences(P�0.05). DG indicates dentate gyrus; GFP, green fluorescentprotein; PT, photothrombosis; MCAO, middle cerebral arteryocclusion.



Dow

nloaded from


Spine MorphologyA detailed characterization of spine morphology additionallydemonstrated that the density of spines was significantlyincreased in newborn neurons generated after MCAO (Figure4A–B). This difference was absent in newborn granule cellsfrom PT animals and also in aberrantly integrated neuronsfrom PT or MCAO animals (Figure 4A). Further analysis ofspine morphology showed a significant majority of thinspines (64.1%–71.5%) compared with mushroom spines(28.4%–35.9%) on newly generated neurons from PT,MCAO as well as control animals (Figure 4B). In contrast,aberrant neurons showed a balanced ratio of thin (53.2%)

and mushroom spines (46.8%). Taking into account thatmushroom spines reflect established synaptic contacts, ourfindings suggest that not only new neurons with regulargross morphology, but also aberrant neurons were stablyintegrated. Additional immunocytochemical staining withantibodies against the presynaptic marker protein synapsinconfirmed this observation (Figure 4C–D). Dendriticspines in the molecular layer of control granule cellswere commonly juxtaposed to synapsin punctate (Figure4C). The same was true for spines on basal dendritesarising from aberrant bipolar neurons born after stroke(Figure 4D).

Figure 4. Spine density and synaptic integration ofnewborn neurons generated in the DG after stroke.A, Quantification of spine numbers in regularlyformed neurons from CTRL, PT, and MCAO ani-mals and aberrant neurons from PT and MCAOanimals (see online-only Data Supplement Table I).B, Numbers of dendritic thin and mushroom spinesin the different groups of neurons. High-resolutionconfocal images of a mushroom spine (tip diame-ter �0.6 �m) and a thin spine. Pie charts displaythe ratio between thin and mushroom spines. Barsrepresent mean�SEM. Asterisks indicate signifi-cant differences (P�0.05). C, Confocal images ofdendrites of regular newborn granule neurons gen-erated after MCAO. Inset, Spiny processes ondendrites extending from this neuron were often inclose proximity (arrowheads) to the presynapticprotein synapsin (red). D, Basal dendritic spinesfrom aberrant neurons were also commonly juxta-posed to synapsin punctate (arrowheads, Z-stack).DG indicates dentate gyrus; CTRL, control; PT,photothrombosis; MCAO, middle cerebral arteryocclusion.



Dow

nloaded from


Comparison With Resident Granule CellsGenerated Before StrokeIn an additional set of experiments, we addressed the questionwhether newborn neurons generated after stroke displaymorphological disparities compared with resident granulecells born weeks before the ischemic insult at P14 (Figure5A). The early injection of the CAG-RFP retroviral vector atP14 labeled a huge population of granule cells, making themossy fiber path and axonal endings in the CA3 regioneffortless visible. Aberrant RFP-positive neurons were notdetected. A detailed morphological comparison of theseresident granule cells with new poststroke and adult controlneurons revealed no differences in branch order, number ofapical dendrites, and dendritic length (online-only Data Sup-plement Table I). However, resident neurons exhibited sig-nificantly less dendritic spines compared with newly gener-ated neurons in PT or MCAO animals (Figure 5B) butdisplayed no difference in spine density compared with

adult-born control neurons. The highest percentage of mush-room spines and generally thicker dendrites (Figure 5C–D)further indicates that these early-born neurons possess well-established synaptic connections within the hippocampalcircuitry.

DiscussionThe present study clearly demonstrates that focal brainischemia impairs correct morphological integration of newlygenerated neurons in the DG. A certain fraction of newbornneurons displayed aberrant features involving bipolar den-dritic arborizations and ectopic location. Bipolar neuronswere detected after photothrombotic cortical infarcts as wellas after large territorial stroke in the middle cerebral arteryterritory, whereas a small number of ectopic new neuronswere exclusively found after MCAO. Detailed spine analysisfurther demonstrated a significant portion of mushroomspines in aberrant neurons as an indicator of stable synaptic

Figure 5. Comparison of newborn neurons gener-ated after MCAO with resident neurons born atpostnatal Day 14 (P14). A, Confocal image of DGshowing resident neurons (green) generated at P14and newborn neurons born 4 days after MCAO atP94 (red, dotted frame). B, Quantification of spinenumbers. C, Numbers of dendritic thin and mush-room spines on resident neurons. Pie charts dis-play the ratio between thin and mushroom spines.Bars represent mean�SEM. Asterisks indicate sig-nificant differences (P�0.05). D, Comparison ofdendrite morphology in the ML between resident(green) and poststroke generated (red) neurons.MCAO indicates middle cerebral artery occlusion;DG, dentate gyrus; ML, molecular layer.



Dow

nloaded from


integration. However, poststroke-generated granule cells withregular appearance also demonstrate considerable alterationsin dendritic complexity and spine morphology after MCAO.

In the physiological state, newborn neurons in the adult DGundergo a complex series of events before fully integrating inthe pre-existing network and, thus, becoming seeminglyindistinguishable from neurons born during embryogenesis.20

Several days after cell division, newborn neurons start ex-tending axonal and dendritic processes and receiving theirfirst GABAergic inputs.21 Thereafter, newborn neurons ob-tain their first glutamatergic input and form their first gluta-matergic output on CA3 pyramidal cells. This period isfollowed by maximal dendritic spine growth and motility aswell as enhanced synaptic plasticity until the new granulecells develop relatively stable synaptic contacts between thefourth and sixth week after birth. This delicately regulatedintegration of new neurons into the pre-existing hippocampalnetwork functions well in the intact brain demonstrating�1% of new neurons with aberrant connections.22

Using 2 different models of experimental stroke, we showthat a fraction of newborn neurons generated after theischemic insult develops aberrant dendritic connections. Afew of these abnormal neurons form dendrites toward thehilus, and others become positioned ectopically. Although thelatter process only occurs after large cortical and subcorticalinfarcts (MCAO), bipolar neurons were observed after smallcortical infarcts (PT) as well as after MCAO. Regular as wellas aberrant neurons display a high ratio of mushroom spinesclosely positioned to synapsin-positive punctate. Even in theabsence of electrophysiological data, these morphologicalfindings suggest functional integration. Comparison of thequantitative and qualitative alterations in neuronal morphol-ogy between the stroke models further implies that the extentof aberrant neurogenesis depends on the size of ischemicdamage. Photochemically induced cortical infarcts induce anaverage increase in dentate neurogenesis of approximately50% in different experimental settings, whereas large corti-cal/subcortical infarcts in the middle cerebral artery territoryduplicate or even triplicate the number of newborn neurons. Itcan be hypothesized that the DG is not capable of integratingthis abundance of newborn neurons leading to aberrantdendritic sprouting and incorrect connections. Our data pos-sibly underline this premise, but further evidence for thishypothesis can be derived from hippocampal epilepsy mod-els. After status epilepticus, dentate neurogenesis is mas-sively boosted leading to a roughly 20% increase of bipolarand ectopic granule cells and to additional changes in mossyfiber sprouting.8–10

Notably, newborn neurons with regular gross morphologyalso display significant changes in dendritic complexity(raised number and length of apical dendrites) after MCAOand—compared with resident neurons—increased spine den-sity in both models. These morphological alterations mightreflect functional changes on afferent synapses and, at least inpart, also display different developmental stages. How newlygenerated granule cells in the DG develop after focal strokeand functionally modulate the existing hippocampal circuit-ries depends not only on morphological connections, but alsoon the functional properties of the new neurons. Evidence

from different epilepsy models suggests that new neuronsborn in a pathological environment exhibit a high degree ofplasticity at their afferent synapses.23 Granule cells born afterelectrically induced status epilepticus show more inhibitoryand less excitatory drive,23 whereas granule cells generatedafter an epileptic insult and exposed to repeated seizuresduring their differentiation exhibit increased synaptic excit-ability.24 The present electrophysiological data in epilepsymodels suggest that adult-born neurons have mechanisms tocounteract or adapt to pathologies at their afferent synapticinputs. To shed more light on the putative complex functionalproperties of adult-born postischemic granule cells, furtherelectrophysiological investigations are needed.

Our findings of aberrant neurogenesis and subtle morpho-logical differences of regular granule cells in 2 models ofischemic stroke support the assumption that massive in-creases in neurogenesis do not necessarily result in betterhippocampal performance. This is in line with very hetero-geneous behavioral assessments of hippocampal function indifferent stroke and stroke-related models in which strongenhancement of neurogenesis has been reported. Aberrantneurogenesis may contribute to functional impairments and,hypothetically, play a role in the pathogenesis of adjustmentdisorders, cognitive deficits, or epilepsy often seen in clinicalpatients with stroke. Experimental data only demonstrated betterfunctional outcomes in animals with increased levels of neuro-genesis after photothrombotic stroke25 or MCAO26 when differ-ent types of rehabilitative training were applied. Whether thesetherapeutic interventions prevent or diminish aberrant neurogen-esis should be a matter of further investigations.

AcknowledgmentsWe thank Katrin Wassmer, Svetlana Tausch, Diana Freitag, ClaudiaSommer, and Julia Oberland for excellent technical assistance. Wethank Nasim Kroegel for editing the manuscript.

Sources of FundingThis work was supported by Interdisciplinary Center for ClinicalResearch (IZKF) Jena and German Ministry of Education andResearch (BMBF program “Cell-based, regenerative therapies,”01GN0977).

DisclosuresNone.

References1. Zhao C, Deng W, Gage FH. Mechanisms and functional implications of

adult neurogenesis. Cell. 2008;132:645–660.2. van Praag H, Schinder AF, Christie BR, Toni N, Palmer TD, Gage FH.

Functional neurogenesis in the adult hippocampus. Nature. 2002;415:1030–1034.

3. Laplagne DA, Esposito MS, Piatti VC, Morgenstern NA, Zhao C, vanPraag H, et al. Functional convergence of neurons generated in thedeveloping and adult hippocampus. PloS Biol. 2006;4:2349–2360.

4. Liu J, Solway K, Messing RO, Sharp FR. Increased neurogenesis in thedentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. J Neurosci.1998;18:7768–7778.

5. Kernie SG, Parent JM. Forebrain neurogenesis after focal ischemic andtraumatic brain injury. Neurol Biol Dis. 2010;37:267–274.

6. Arvidsson A, Kokaia Z, Lindvall O. N-methyl-D-aspartate receptor-mediated increase of neurogenesis in adult rat dentate gyrus followingstroke. Eur J Neurosci. 2001;14:10–18.

7. Parent JM, Yu TW, Leibowitz RT, Geschwind DH, Sloviter RS, Low-enstein DH. Dentate granule cell neurogenesis is increased by seizures



Dow

nloaded from


and contributes to aberrant network reorganization in the adult rat hip-pocampus. J Neurosci. 1997;17:3727–3738.

8. Jessberger S, Nakashima K, Clemenson GD Jr, Mejia E, Mathews E, UreK, et al. Epigenetic modulation of seizure-induced neurogenesis andcognitive decline. J Neurosci. 2007;27:5967–5975.

9. Walter C, Murphy BL, Pun RY, Spieles-Engemann AL, Danzer SC.Pilocarpine-induced seizures cause selective time-dependent changes toadult-generated hippocampal dentate granule cells. J Neurosci. 2007;27:7541–7552.

10. Jessberger S, Zhao C, Toni N, Clemenson GD Jr, Li Y Gage FH.Seizure-associated, aberrant neurogenesis in adult rats characterized withretrovirus-mediated cell labeling. J Neurosci. 2007;27:9400–9407.

11. Kron MM, Zhang H, Parent JM. The developmental stage of dentategranule cells dictates their contribution to seizure-induced plasticity.J Neurosci. 2010;30:2051–2059.

12. Ribak CE, Tran PH, Spigelman I, Okazaki MM, Nadler JV. Statusepilepticus-induced hilar basal dendrites on rodent granule cells con-tribute to recurrent excitatory circuitry. J Comp Neurol. 2000;428:240–253.

13. Thind KK, Ribak CE, Buckmaster PS. Synaptic input to dentate granulecell basal dendrites in a rat model of temporal lobe epilepsy. J CompNeurol. 2008;509:190–202.

14. Jagasia R, Steib K, Englberger E, Herold S, Faus-Kessler T, Saxe M, etal. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulatesmaturation and survival of newly generated neurons in the adult hip-pocampus. J Neurosci. 2009;29:7966–7977.

15. Tashiro A, Zhao C, Gage FH. Retrovirus-mediated single-cell geneknockout technique in adult newborn neurons in vivo. Nat Protocols.2006;1:3049–3055.

16. Kluska MM, Witte OW, Bolz J, Redecker C. Neurogenesis in the adultdentate gyrus after cortical infarcts: effects of infarct location, NMDA

receptor blockade and anti-inflammatory treatment. Neuroscience. 2005;135:723–735.

17. Toni N, Teng EM, Bushong EA, Aimone JB, Zhao C, Consiglio A, et al.Synapse formation on neurons born in the adult hippocampus. NatNeurosci. 2007;10:727–734.

18. Paxinos G, Watson C. The Rats in the Stereotaxic Coordinates. NewYork, NY: Academic Press; 1986.

19. Zhao C, Teng EM, Summers RG Jr, Ming GL, Gage FH. Distinctmorphological stages of dentate granule neuron maturation in the adultmouse hippocampus. J Neurosci. 2006;26:3–11.

20. Toni N, Sultan S. Synapse formation on adult-born hippocampal neurons.Eur J Neurosci. 2011;33:1062–1068.

21. Ge S, Goh EL, Sailor KA, Kitabatake Y, Ming GL, Song H. GABAregulates synaptic integration of newly generated neurons in the adultbrain. Nature. 2006;439:589–593.

22. Shapiro LA, Ribak CE, Jessberger S. Structural changes for adult-borndentate granule cells after status epilepticus. Epilepsia. 2008;49(suppl 5):13–18.

23. Jakubs K, Nanobashvili A, Bonde S, Ekdahl CT, Kokaia Z, Kokaia M, etal. Environment matters: synaptic properties of neurons born in theepileptic adult brain develep to reduce excitability. Neuron. 2006;52:1047–1059.

24. Wood JC, Jackson JS, Jakubs K, Chapman KZ, Ekdahl CT, et al. Func-tional integration of new hippocampal neurons following insults to theadult brain is determined by characteristics of pathological environment.Exp Neurol. 2011;229:484–493.

25. Wurm F, Keiner S, Kunze A, Witte OW, Redecker C. Effects of skilledforelimb training on hippocampal neurogenesis and spatial learning afterfocal cortical infarcts in the adult rat brain. Stroke. 2007;38:2833–2840.

26. Zhao C, Wang J, Zhao S, Nie Y. Constraint-induced movement therapyenhanced neurogenesis and behavioral recovery after stroke in adult rats.Tohoku J Exp Med. 2009;218:301–308.



Dow

nloaded from


RedeckerFanny Niv, Silke Keiner, -K Krishna, Otto W. Witte, Dieter Chichung Lie and Christoph

Aberrant Neurogenesis After Stroke: A Retroviral Cell Labeling Study

Print ISSN: 0039-2499. Online ISSN: 1524-4628 Copyright © 2012 American Heart Association, Inc. All rights reserved.

is published by the American Heart Association, 7272 Greenville Avenue, Dallas, TX 75231Stroke doi: 10.1161/STROKEAHA.112.660977

2012;43:2468-2475; originally published online June 26, 2012;Stroke.

http://stroke.ahajournals.org/content/43/9/2468World Wide Web at:

The online version of this article, along with updated information and services, is located on the

http://stroke.ahajournals.org/content/suppl/2013/10/08/STROKEAHA.112.660977.DC2 http://stroke.ahajournals.org/content/suppl/2012/06/26/STROKEAHA.112.660977.DC1

Data Supplement (unedited) at:

http://stroke.ahajournals.org//subscriptions/

is online at: Stroke Information about subscribing to Subscriptions:

http://www.lww.com/reprints Information about reprints can be found online at: Reprints:

document. Permissions and Rights Question and Answer process is available in the

Request Permissions in the middle column of the Web page under Services. Further information about thisOnce the online version of the published article for which permission is being requested is located, click

can be obtained via RightsLink, a service of the Copyright Clearance Center, not the Editorial Office.Strokein Requests for permissions to reproduce figures, tables, or portions of articles originally publishedPermissions:


Dow

nloaded from

http://stroke.ahajournals.org/content/43/9/2468

http://stroke.ahajournals.org/content/suppl/2012/06/26/STROKEAHA.112.660977.DC1

http://stroke.ahajournals.org/content/suppl/2013/10/08/STROKEAHA.112.660977.DC2

http://www.ahajournals.org/site/rights/

http://www.lww.com/reprints

http://stroke.ahajournals.org//subscriptions/


Niv et al. – Aberrant neurogenesis after stroke: a retroviral cell labeling study

Supplemental Table: Morphometric characteristics of newborn neurons

CTRL (n=13)

PT (n=17)

MCAO (n=16)

aberrant (n=10)

resident (n=7)

dendritic morphology highest branch order 6 ± 0,2 5,4 ± 0,2 6,5 ± 0,3 4,9 ± 0,4 5,1 ± 0,1

number of apical dendrites 18,2 ± 0,6 16,4 ± 0,7 23,7 ± 3,1 13,9 ± 2,2 17,3 ± 0,8

apical dendritic length (µm) 1028,6 ± 24,7 915,9 ± 42,0 1275,1 ± 120,5 914,7 ± 105,5 1014,9 ± 32,6

spine morphology (per 50µm)

total number of spines 14,7 ± 0,4 17,6 ± 0,8 22,7 ± 1,3 13,4 ± 0,8 13,1 ± 0,6

number of thin spines 9,6 ± 0,6 12,7 ± 0,8 16,4 ± 1,8 8,1 ± 1,0 4,3 ± 0,4

number of mushroom spines 4,7 ± 0,3 4,8 ± 0,5 6,3 ± 0,7 5,3 ± 0,3 8,8 ± 0,9

59

4(28)’2012

Аберрантный нейрогенез после инсульта. Исследование Retroviral Cell LabelingИсточник. F. Niv, S. Keiner, Krishna-K, O.W. Witte, D.C. Lie, C. Redecker. Aberrant neurogenesis after stroke. A retroviral cell labeling study. Stroke. 2012;43:9:2468–2475

Дополнительные данные доступны on-line по адресу: http://stroke.ahajournals.org/lookup/suppl/doi:10.1161/STROKEAHA.112.660977/-/DC1 Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital, Jena, Germany; Research Group Adult Neurogenesis and Neural Stem Cells, Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, Neuherberg, Germany; and the Institute of Biochemistry, Emil Fischer Center, University Erlangen-Nürnberg, Erlangen, Germany

Предпосылки и цель исследования. Нейрогенез в зубчатой извилине у взрослых является уникальной формой пластичности головного мозга, стимуляция которой происходит после инсульта. Исследовали морфологические свойства новых клеток зернистого слоя, образую-щихся и развивавшихся после ишемического инсульта, и изучили способность этих вновь образованных нейронов правильно интегриро-ваться в существующие гиппокампальные сети. Методы. Использовали две известные модели индукции развития небольших кортикаль-ных инфарктов (модель фототромбоза) или крупных полушарных инфарктов (модель транзиторной окклюзии средней мозговой артерии). Новые клетки зернистого слоя метили через 4 дня после инсульта путем интрагиппокампальной инъекции ретровирусного вектора, коди-рующего зеленый флуоресцентный белок, а морфологию вновь образованных нейронов анализировали с помощью полуавтоматической системы Neurolucida и конфокального лазерного сканирующего микроскопа через 6 недель. Результаты. Приблизительно в 5–10% вновь образованных клетках зернистого слоя обнаружили выраженные морфологические аномалии, включающие дополнительные базальные дендриты, а после окклюзии средней мозговой артерии еще и эктопическое расположение клеток. Степень морфологических изменений была выше после крупных инфарктов и, по всей вероятности, зависела от тяжести ишемического повреждения. Повышенное количество грибовидных шипов на поверхности аберрантных нейронов позволяет предположить наличие стабильной синаптической интеграции. Тем не менее во вновь образованных нейронах после инсульта с регулярным постоянством также выявляли изменения в ветвлении дендри-тов и морфологии шипов. Выводы. Выраженная стимуляция нейрогенеза после инсульта в зубчатой извилине совпадает с повышением скорости интеграции нейронов, которые могут способствовать развитию функциональных нарушений и гипотетически участвовать в пато-генезе адаптационных нарушений, когнитивных дефицитов или эпилепсии, часто наблюдаемых у пациентов, перенесших инсульт.

Ключевые слова: нейрогенез у взрослых (adult neurogenesis), зубчатая извилина (dentate gyrus), фототромбоз (photothrombosis), плас-тичность (plasticity), ретровирусные векторы (retroviral vectors)

Нейрогенез в гиппокампе взрослых является уникаль-ной формой структурной пластичности мозга, которая играет особую роль не только под воздействием физио-логических стимулов, но и при повреждениях головного мозга, таких как инсульт, эпилепсия или черепно-моз-говая травма. По всей видимости, регуляция образова-ния, миграции, дифференцировки и созревания вновь образованных нейронов в зубчатой извилине проис-ходит таким образом, что позволяет нейронам четко интегрироваться в существующие гиппокампальные сети [1–3]. После ишемии головного мозга происходит выраженная стимуляция пролиферации и дифферен-цировки клеток-предшественников нейронов в субгра-нулярной зоне зубчатой извилины (ЗИ), что приводит к значительному увеличению скорости нейрогенеза [4–6]. На сегодняшний день неизвестно, происходит ли полная интеграция большего числа вновь образованных после инсульта нейронов в гиппокампальную сеть? В экспе-риментальных исследованиях было показано, что эпи-лептический статус также является мощным стимуля-тором нейрогенеза в ЗИ у взрослых [7, 8], тем не менее это сопровождается нарушением интеграции этих новых клеток зернистого слоя в гиппокампальную сеть [9–11]. S. Jessberger и соавт. [10] описали наличие аберрантных морфологических изменений в виде дополнительных

базальных дендритов, направленных к хилусу у значи-тельного числа вновь образованных нейронов, а в неко-торых случаях эктопическое расположение вновь обра-зованных клеток. Эти морфологические изменения, как известно, приводят к увеличению частоты повторного возбуждения в сети [12, 13] и могут являться ключевым компонентом развития эпилепсии.

В настоящем исследовании изучили тонкую морфо-логию вновь образованных после инсульта нейронов в качестве индикатора структурной интеграции в сущес-твующие сети. С этой целью использовали ретрови-русное мечение клеток, позволяющее детализировать морфологическую реконструкцию дендритов и шипов вновь образованных нейронов для изучения постинсуль-тного нейрогенеза при небольших ограниченных корти-кальных инфарктах и крупных ишемических инфарк-тах в бассейне средней мозговой артерии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что инсульт приводит к морфологически аберрантной интеграции вновь обра-зованных клеток в ЗИ у взрослых, при этом степень нарушений напрямую зависит от размера ишемического повреждения.

■ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Модель инфарктаИсследование провели на 43 самцах крыс линии

Wistar. Животных содержали в стандартных условиях проживания в обычных клетках (по 4 особи в клетке).

© American Heart Association Inc., 2012 Адрес для корреспонденции: Christoph Redecker, MD, Hans Berger Department of Neurology, Jena University Hospital, Erlanger Allee 101, 07747 Jena, Germany. E-mail: [email protected]

60

4(28)’2012 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

Предоставляли достаточное количество пищи и воды. Все эксперименты были одобрены немецким комитетом по использованию и уходу за лабораторными животны-ми в соответствии с европейскими директивами.

Модель фототромбоза После анестезии с использованием 2,5–3,5% изофлу-

рана в смеси O2/N2O животных помещали в стереотак-сическую рамку, надрезали кожу головы и размещали волоконный световод (2,4 мм в диаметре), подклю-ченный к источнику холодного света (Schott KL 1500, Майнц, Германия), на черепе на 0,5 мм кпереди от брег-мы и на 3,7 мм латеральнее средней линии над сенсо-моторной корой передних конечностей. Сразу же после начала освещения (продолжительностью 20 минут) в бедренную вену через катетер вводили краситель бен-гальский розовый (1,3 мг/100 мг массы тела в 0,9% NaCl). Во время вмешательства постоянно поддерживали тем-пературу тела на уровне 36,5 °C. Ложнооперированным животным проводили аналогичное вмешательство за исключением светового воздействия на головной мозг.

Модель окклюзии средней мозговой артерииПосле описанной выше анестезии с правой стороны

выделяли общую сонную, наружную сонную и крыло-небную артерии и лигировали их. Правую внутреннюю сонную артерию окклюзировали с помощью микрохи-рургической клипсы и впоследствии проводили арте-риотомию общей сонной артерии. В общую сонную артерию вводили 3,0-монофиламентную нить (Doccol) с закругленным кончиком и продвигали ее вперед через внутреннюю сонную артерию до устья для окклюзии средней мозговой артерии. Через 60 минут нить удаляли, рану закрывали, затем крысы восстанавливались после вмешательства. Ложнооперированным животным (кон-трольная группа) провели аналогичное вмешательство за исключением окклюзии правой внутренней сонной артерии.

Ретровирусные векторыДля мечения вновь образованных зернистых нейронов

в правой ЗИ использовали ретровирусные векторы CAG-зеленого флуоресцентного белка (GFP) и CAG-красного флуоресцентного белка (RFP) [14]. Вирусные векторы были образованы котрансфектированными НЕК 293 Т-клетками с pCAG-GFP/pCAG-RFP и конструкциями pCMV VSVg и pCMVpg [15] при заключительном титре около 1×107 колониеобразующих единиц/мл.

Дизайн эксперимента В первой серии экспериментов исследовали морфо-

логию вновь образованных после экспериментального ишемического инфаркта клеток зернистого слоя: крыс (n=28, массой 250–270 г) случайным образом разде-лили на 4 экспериментальные группы и подвергли фототромбозу (ФТ; n=6), псевдо-ФТ (n=6, контроль-ная группа ФТ), окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА, n=10), или псевдо-ОСМА (n=6, контрольная группа ОСМА) в правом полушарии на 90-й день. Четыре дня спустя (P94) животным выполнили сте-

реотаксическую инъекцию CAG-GFP ретровируса в зубчатую извилину (1 мкл вируса, х=3,1 мм; у=1,5 мм; z=4,0 мм по отношению к брегме), и затем в течение 6 недель крысы восстанавливались после вмешательст-ва. Во второй серии экспериментов провели дальней-ший анализ соответствия морфологических свойств резидентных нейронов, образованных до развития инфаркта, и нейронов, вновь образованных после инсульта. С этой целью на 14-й день крысам (n=15, масса тела 20–25 г) выполнили первую стереотакси-ческую инъекцию CAG-RFP ретровирусного вектора в правую зубчатую извилину (1 мкл вируса, х=2,7 мм; у=1,0 мм; z=3,4 мм относительно брегмы). Через четы-ре дня после ФТ (n=7) или ОСМА (n=8), на 94-й день, выполнили вторую инъекцию CAG-GFP ретровирус-ного вектора, как описывали ранее. На 132-й день всем крысам под анестезией диэтиловым эфиром про-вели транскардиальную перфузию 4%-ного фосфатно-буферного параформальдегида. Ни одно животное не исключили из дальнейшего анализа.

Иммуногистохимический анализПосле транскардиальной перфузии головной мозг

животных фиксировали в параформальдегиде и делали срезы толщиной 40 мкм. Иммуноцитохимический ана-лиз проводили с помощью стандартного пероксидазно-го метода и методов иммунофлуоресценции с двойным мечением, описанных ранее [16]. Использовали сле-дующие первичные антитела: козьи анти-GFP анти-тела (1:500; Acris, Херфорд, Германия), куриные анти-GFP антитела (1:1000; Aves Labs), кроличьи анти-RFP антитела (1:500; Abcam, Кэмбридж, Великобритания), мышиный антинейрональный ядерный антиген (1:500; Chemicon, Темекула, Калифорния), и козий антиси-напсин I (1:500; Santa Cruz, Санта-Круз, Калифорния). Вторичные антитела: Cy5 антимышиное и CY3 анти-кроличье (1:250; Дианова, Гамбург, Германия), Alexa Fluor 488 антикозье, и Alexa Fluor 488 антимышиное (1:250; Molecular Probes, Лейден, Нидерланды) и флуо-ресцеина изотиоцианат антикуриный (1:250; Chemicon). Окрашенные стандартным пероксидазным методом клетки изучали с помощью световой микроскопии, в то время как клетки с двойным мечением анализировали с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Количественный и морфологический анализ Волюметрия Объем очага инфаркта и объем гиппокампа изме-

ряли в каждом восьмом срезе, окрашенном крезило-вым фиолетовым (40 мкм). Объем рассчитывали путем умножения размера соответствующей зоны поражения на толщину среза, учитывая интервал между срезами.

Количественный анализGFP-положительные клетки, окрашенные перокси-

дазным методом, подсчитывали в каждом шестом срезе, выполненном на протяжении ипсилатеральной ЗИ. Фенотипы GFP-положительных клеток определяли с помощью световой микроскопии и подсчитывали долю клеток с морфологическими аномалиями (аберрантные

61

4(28)’2012

вновь образованные нейроны). Выделили два разных типа аберрантной морфологии вновь образованных ней-ронов: (1) биполярные клетки в зернистом слое ЗИ с базальными дендритными отростками, направленными к хилусу, (2) эктопически расположенные клетки, лока-лизующиеся под субгранулярной зоной в хилусе или в близлежащей области аммонова рога.

Анализ дендритов Для анализа ветвления дендритов вновь образован-

ных нейронов выполнили морфологическую реконс-трукцию подмножества произвольно выбранных GFP-положительных клеток (10–17 клеток на группу) из различных экспериментальных групп (контрольная, ФТ, ОСМА) с использованием полуавтоматической систе-мы Neurolucida (MicroBrightfield, Колчестер, Вермонт) при увеличении с иммерсионной линзой в 63 раза. Кроме того, на 14-й день проанализировали подмножес-тво RFP-положительных, меченых ретровирусом ней-ронов для сравнения резидентных клеток зернистого слоя с вновь образованными нейронами (17 клеток). Оценивали такие параметры, как характер ветвления, число и длина апикальных дендритов. Аксональные отростки можно легко отличить от дендритов в связи с их меньшим диаметром и отсутствием дендритных шипов.

Анализ шиповАнализ шипов выполняли с использованием конфо-

кального лазерного сканирующего микроскопа (LSM 710; Carl Zeiss, Jena, Германия), как описано ранее [9, 17]. Анализировали сегмент дендрита (ветвление второго порядка) размером 50 мкм и подсчитывали общее коли-чество шипов на 50 мкм. В соответствии с диаметром их конечной части выполнили дальнейшую их диффе-ренцировку на тонкие (0,25–0,6 мкм) и грибовидные (>0,6 мкм) шипы.

Статистический анализСтатистический анализ числа клеток проводили с

использованием одностороннего дисперсионного ана-лиза с последующим post hoc анализом Тьюки-Крамера для множественных сравнений. Данные представлены в виде среднее значение±стандартная ошибка среднего (СОШ).

■ РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфология вновь образованных после инсульта нейронов

У всех животных с фототромботическим инсультом развились типичные кортикальные инфаркты, располо-женные в сенсомоторной коре передних конечностей по G. Paxinos и С. Watson [18]. Соответственно у животных с транзиторной ОСМА развились инфаркты в бассей-не правой средней мозговой артерии, включая кору и базальные ядра, за исключением гиппокампальной области (рис. 1А). При проведении волюметрии обна-ружили, что после ФТ размеры зоны инфаркта были значительно меньшими в группе ФТ (4,85±0,59 мм3) по

сравнению с группой ОСМА (68,17±15,16 мм3; рис. 1Б). При проведении дополнительной волюметрии гиппо-кампа различий между экспериментальными группами не выявили (рис. 1В).

Через шесть недель после инъекции CAG-GF у боль-шинства вновь образованных после инсульта нейро-нов, выявили типичные характерные морфологические свойства клеток зернистого слоя (примерно 90–95% клеток), аналогичные соответствующим параметрам у животных контрольной группы. А именно, у дендритов этих вновь образованных нейронов была четко поляри-зованная морфология, а апикальные дендритные отрос-тки с большим количеством шипов проникали в молеку-лярный слой. Кроме того, аксоны достигли своей целе-вой области CA3, через мшистые волокна, что свиде-тельствует о корректной интеграции в гиппокампальные сети [2, 19]. Тем не менее у небольшой части вновь обра-зованных нейронов (5–10% клеток) выявили заметные различия в морфологии. В дополнение к апикальным дендритам наблюдали наличие базальных дендритов или даже разветвления дендритов, что привело к фор-мированию биполярной морфологии. Эти морфологи-ческие аберрации обнаружили и после ФТ (4,97±1,62%; р=0,04) и после ОСМА (10,05±0,34%; р=0,007), но они почти не встречались у животных контрольной группы (0,27±0,1%), в которой обнаружили только один бипо-лярный нейрон (рис. 2, см. на цв. вклейке; таблица I в дополнительных данных on-line), что не является ред-костью в физиологическом состоянии и такие случаи описаны в литературе [20]. Число аберрантных, вновь

Рисунок 1. Морфологические изменения при экспериментальных инсультах А. Фототромботические кортикальные инфаркты (ФТ). Б. Инсульт, индуцированный транзиторной окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА). В. Волюметрия очага инфаркта и гиппокампа через 6 недель после начала инсульта. Столбики отражают среднее значение±СОШ.

0

20

40

60

80

100

150

200

250

100

0

В

А Б

Объ

ем о

чага

инф

аркт

а (м

м3 )

Объ

ем г

иппо

кам

па (м

м3 )

Контрольнаягруппа

ФТ ФТОСМА ОСМА

50

300

350

62


образованных нейронов оказалось выше у животных с крупными полушарными инфарктами (при ОСМА) по сравнению с животными с небольшими кортикаль-ными инфарктами (ФТ), но это различие не достигло статистической значимости. Кроме того, выявили экто-пическое расположение вновь образованных нейронов в расширении аммонова рога рядом с хилусом (рис. 2В, см. на цв. вклейке). Такие эктопически расположен-ные нейроны встречались только у животных в группе ОСМА, что указывает, возможно, на аберрантную миг-рацию или даже эктопический нейрогенез (рис. 2В–Г, см. на цв. вклейке).

Морфология дендритов Несмотря на то что, по всей видимости, у большинс-

тва вновь образованных после ишемии головного мозга клеток образуются правильные морфологические при-знаки, при тщательном анализе разветвлений дендритов выявили несколько различий во вновь образованных после ОСМА нейронах (рис. 3; таблица I в дополни-тельных данных on-line). В частности, у вновь образо-ванных нейронов с правильной полярностью и распо-ложением в пределах ЗИ было увеличено количество и длина дендритов (рис. 3). Эти морфологические отличия наблюдались только у животных, перенесших ОСМА. У вновь образованных клеток зернистого слоя у живот-ных после ФТ или в аберрантных нейронах у животных после ФТ или ОСМА не выявили различий в количестве и длине дендритов по сравнению с животными кон-трольной ложнооперированной группы (рис. 3). При проведении дальнейшего анализа разветвлений более высокого порядка, не выявили существенных различий между группами. В совокупности, полученные данные свидетельствуют о том, что вновь образованные после ОСМА нейроны имеют более сложные морфологические характеристики.

Морфология шипов При детальном изучении морфологии шипов допол-

нительно обнаружили, что плотность шипов было зна-чительно выше у вновь образованных после ОСМА нейронов (рис. 4A–Б, см. на цв. вклейке). Такого раз-личия не было у вновь образованных клеток зернистого слоя у животных в группе ФТ, а также у аберрантно интегрированных нейронов у животных в группе ФТ или ОСМА (рис. 4А, см. на цв. вклейке). При дальней-шем анализе морфологии шипов продемонстрировали гораздо большее количество тонких (64,1–71,5%) по сравнению с грибовидными шипами (28,4–35,9%) у вновь образованных нейронов в группах ФТ, ОСМА, а также у животных контрольной группы (рис. 4Б, см. на цв. вклейке). В отличие от этого у аберрантных нейро-нов обнаружили сбалансированное соотношение тонких (53,2%) и грибовидных шипов (46,8%). Учитывая, что грибовидные шипы представляют собой установленные синаптические контакты, результаты настоящего иссле-дования показывают наличие стабильной интеграции не только у новых нейронов с правильной морфологией, но и у аберрантных нейронов. Дополнительное иммуноци-тохимическое окрашивание с антителами к пресинапти-

ческому маркерному белку синапсину подтвердили это наблюдение (рис. 4В–Г, см. на цв. вклейке). Дендритные шипы в молекулярном слое зернистых клеток у конт-рольной группы обычно располагались рядом с пунк-татом синапсина (рис. 4В, см. на цв. вклейке). Это же наблюдение верно в отношении шипов на базальных дендритах аберрантных биполярных нейронов, образо-ванных после инсульта (рис. 4Г, см. на цв. вклейке).

Сравнение с резидентными клетками зернистого слоя, образованными до инсульта

В дополнительной серии экспериментов изучили воп-рос о морфологических отличиях вновь образованных после инсульта нейронов по сравнению с резидентны-ми клетками зернистого слоя, образованными до раз-вития ишемического инсульта на 14-й день (рис. 5А, см. на цв. вклейке). Раннее введение ретровирусно-го вектора CAG-RFP на 14-й день привело к мече-нию огромной популяции клеток зернистого слоя, что позволило надежно визуализировать проводящий путь мшистых волокон и окончания аксонов в области CA3. Аберрантные RFP-положительные нейроны обнаружить не удалось. Подробное морфологическое сравнение этих резидентных клеток с вновь образованными после инсульта нейронами и нейронами у животных контроль-ной группы не выявило различий в порядке ветвления, количестве и длине дендритов (таблица I в дополни-тельных данных on-line). Тем не менее у резидентных нейронов обнаружили значительно меньше дендритных шипов по сравнению с вновь образованными нейронами у животных в группах ФТ и ОСМА (рис. 5Б, см. на цв. вклейке), но не выявили различий в плотности шипов по сравнению с вновь образованными нейронами у взрос-лых особей в контрольной группе. Более высокая доля грибовидных шипов и утолщение дендритов (рис. 5В–Г, см. на цв. вклейке) указывают на то, что эти вновь обра-зованные нейроны имеют четко установленные синап-тические связи с гиппокампальной сетью.

■ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании четко показали, что при очаговой ишемии головного мозга нарушается правиль-ная морфологическая интеграции вновь образованных нейронов в ЗИ. У некоторой части вновь образован-ных нейронов появляются аберрантнтые особенности, в т.ч. биполярное ветвление дендритов и эктопичес-кая локализация. Биполярные нейроны обнаружили после фототромботических кортикальных инфарктов, а также после крупных полушарных инсультов в бассейне средней мозговой артерии, в то время как небольшое количество эктопически расположенных новых нейро-нов выявили только после ОСМА. В дальнейшем, при проведении тщательного анализа шипов, продемонс-трировали наличие значительного количества грибо-видных шипов у аберрантных нейронов как индикатора стабильной синаптической интеграции. Тем не менее у образованных после развития инсульта клеток зернис-того слоя с регулярным постоянством выявляют наличие

63

4(28)’2012

значительных изменений в ветвлении дендритов и мор-фологии шипов после ОСМА.

В физиологическом состоянии вновь образованные нейроны в ЗИ у взрослых претерпевают целый ряд слож-

ных изменений до полной интеграции в уже существую-щие сети и, таким образом, становятся почти неотличи-мыми от нейронов, образованными в период эмбриоге-неза [20]. Через несколько дней после деления клеток у

Рисунок 3. Морфология дендритов вновь образованных после инсульта нейронов в ЗИ А. Реконструкция GFP-положительных нейронов в различных экспериментальных группах с помощью Neurolucida. После ФТ и ОСМА обнаруживали биполярные нейроны, в то время как эктопические нейроны встречались только после ОСМА. Б. На окрашенных пероксидазой срезах представлены GFP-положительные вновь образованные нейроны с обычной и аберрантной морфологией in situ. В. Количественный анализ апикальных дендритов: их длина порядок ветвления в различных группах нейронов демонстрирует выраженное различие в ветвлении дендритов между группами ФТ и ОСМА. Столбики соответствуют среднему значению±СОШ. Звездочками обозначены значимые различия (р<0,05). ЗИ — зубчатая извилина; GFP — зеленый флуоресцентный белок, ФТ — фототромбоз; ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии.


ФТ ОСМА Аберрантные





15

15

20

25

30

5

5

*

биполярнаяклетка

ОСМА МСАОФТ

эктопическаяклетка

В

*

300

600

900

0

0

0

Апик

альн

ые

денд

риты

Дли

на д

ендр

итов

(мкм

)П

оряд

ок в

етвл

ения

10

10

1200

1500

А

Б

обзор

обычные зернистые клетки

экто

пиче

ская

клет

ка

бипо

лярн

аякл

етка

64


вновь образованных нейронов начинают расти аксоны и дендриты, получающие первые ГАМК-ергические сигналы [21]. После получения своего первого глута-матергического сигнала вновь образованные нейроны передают свой первый глутаматергический импульс на пирамидные клетки в СА3. Этот период сопровожда-ется последующим максимальным ростом дендритных шипов и увеличением подвижности, а также усилением синаптической пластичности, пока у новых клеток зер-нистого слоя не разовьются относительно стабильные синаптические контакты в период между 4-й и 6-й неде-лями жизни. Эта тонко регулируемая интеграция новых нейронов в уже существующие гиппокампальные сети четко функционирует и в интактном головном мозге, демонстрируя при этом >1% новых нейронов с девиант-ными контактами [22].

Используя две различные модели экспериментального инсульта, в настоящем исследовании продемонстри-ровали, что у определенного числа вновь образован-ных после ишемического инсульта нейронов развива-ются аберрантные дендритные соединения. Некоторые из этих аномальных нейронов образуют дендриты по направлению к хилусу, у других выявляют эктопическую локализацию. Несмотря на то что упомянутый послед-ним процесс развивается только после крупных корти-кальных и субкортикальных инфарктов (ОСМА), бипо-лярные нейроны также обнаруживали после небольших кортикальных инфарктов (ФТ), а также после ОСМА. У резидентных, а также аберрантных нейронов выяви-ли высокую долю грибовидных шипов, близко рас-положенных к синапсин-положительному пунктату. Даже в отсутствие электрофизиологических данных эти результаты морфологического анализа свидетельству-ют о наличии функциональной интеграции. Сравнение количественных и качественных изменений морфоло-гии нейронов в различных моделях инсульта также подразумевает, что степень аберрантного нейрогене-за зависит от размера очага ишемического поврежде-ния. Фотохимически индуцированные кортикальные инфаркты в различных экспериментальных условиях вызывают усиление нейрогенеза в зубчатой извилине в среднем на 50%, в то время как крупные кортикаль-ные/субкортикальные инфаркты в бассейне средней мозговой артерии приводят к усилению нейрогенеза в два или даже три раза. Можно предположить, что интег-рация большого числа вновь образованных нейронов в пределах ЗИ невозможна, что приводит к аномальному разрастанию дендритов и образованию неправильных связей. Данные проведенного исследования в некотором роде свидетельствуют в пользу этой гипотезы, но даль-нейшие доказательства можно будет получить из модели гиппокампальной эпилепсии. После эпилептического статуса происходит ускоренный массивный нейрогенез в ЗИ, что приводит к увеличению количества биполярных и эктопических клеток зернистого слоя приблизительно на 20%, а также к дополнительным изменениям в росте мшистых волокон [8–10].

Примечательно, что у вновь образованных нейро-нов также выявляют существенные изменения в вет-влении дендритов (увеличение количества и длины дендритов) после ОСМА и по сравнению с резиден-тными нейронами — повышение плотности шипов в обеих моделях. Эти морфологические изменения могут отражать функциональные изменения на афферент-ных синапсах, по крайней мере, частичные, а также отражать различные стадии развития клеток. Процессы развития вновь образованных после очагового инсуль-та клеток зернистого слоя в ЗИ и функционально-го модулирования существующих гиппокампальных сетей зависят не только от морфологических связей, но также от функциональных свойств новых нейронов. Данные из различных моделей эпилепсии позволяют предположить, что новые нейроны, образованные в патологических условиях, демонстрируют высокую сте-пень пластичности на их афферентных синапсах [23]. У клеток зернистого слоя, образованных после электро-индуцированного эпилептического статуса, тормозные импульсы преобладают над возбуждающими [23], в то время как клетки зернистого слоя, образованные после эпилептического повреждения головного мозга на фоне частых судорог, во время их дифференцировки обла-дают повышенной синаптической возбудимостью [24]. Существующие электрофизиологические данные, полу-ченные в моделях эпилепсии, свидетельствуют о том, что вновь образованные нейроны у взрослых обладают механизмами противодействия или адаптации к патоло-гическим изменениям на их афферентных синаптичес-ких входах. Необходимо проведение дальнейших элек-трофизиологических исследований, чтобы пролить свет на предполагаемые сложные функциональные свойства клеток зернистого слоя, образованных после ишемии головного мозга у взрослых.

Данные проведенного исследования аберрантного нейрогенеза и тонких морфологических различий нор-мальных зернистых клеток в двух моделях ишемическо-го инсульта свидетельствуют в пользу предположения, что массивное усиление нейрогенеза не обязательно приведет к улучшению функции гиппокампа. Это согла-суется с результатами использования разнообразных методов оценки функции гиппокампа в различных моделях инсульта, в котором сообщали о выраженном усилении нейрогенеза. Аберрантный нейрогенез может способствовать развитию функциональных нарушений и гипотетически играет определенную роль в патогенезе расстройств адаптации, когнитивных нарушений или эпилепсии, часто наблюдаемых в практике у пациен-тов с инсультом. Экспериментальные данные проде-монстрировали улучшение функциональных исходов у животных с усилением нейрогенеза после фототром-ботического инсульта [25] или ОСМА [26] только при применении различных видов восстановительного лече-ния. Способность таких терапевтических вмешательств предотвратить или уменьшить аберрантный нейрогенез должна стать предметом дальнейших исследований.

aberrant neurogenesis after strokestroke.ahajournals.org/content/strokeaha/43/9/2468.full.pdf ·...

Documents