NEW ADVANCES ON THE BIOCHEMICAL PATHWAYS IN THE RENIN­ANGIOTENSIN SYSTEM IN HYPERTENSION AND THEIR ROLE IN CARDIAC 

STRUCTURE AND FUNCTION   BY   

AARON J. TRASK   

A Dissertation Submitted to the Graduate Faculty of  

WAKE FOREST UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF ARTS AND SCIENCES  

in Partial Fulfillment of the Requirements  

for the Degree of  

DOCTOR OF PHILOSOPHY  

Physiology & Pharmacology  

December 2008  

Winston­Salem, North Carolina  

Copyright Aaron J. Trask 2008   Approved by:  Carlos M. Ferrario, M.D., Advisor                 Examining Committee:  James E. Jordan, Ph.D., Chairman                 Mark C. Chappell, Ph.D.                    Leanne Groban, M.D.                    E. Ann Tallant, Ph.D.                    Jasmina Varagic, M.D., Ph.D.                 

ACKNOWLEDGEMENTS 

 

  First  and  foremost,  I  want  to  thank  Dr.  Nancy  Woodley  at  Ohio  Northern 

University for encouraging me to attend graduate school.  She saw in me a curiosity 

that needed an outlet, and graduate school has indeed provided me with a suitable 

outlet.  Thank you, Nancy.  I am forever grateful. 

Next,  I would  like to  thank my advisor, Dr. Carlos M. Ferrario  for providing 

me the opportunities to explore things on my own, for never hovering over me, and 

for providing guidance whenever or where ever needed.  Your scientific prowess is 

a  rarity  that  I  hope  I  can  someday  acquire.    In  addition,  I would  like  to  thank my 

thesis committee without which I would have gone completely crazy in my tenure as 

a graduate student.  To Jim Jordan – thank you for your insightfulness and guidance 

with my experiments when needed.  To Mark Chappell – I truly appreciate all of the 

help you have been to not only to my thesis experiments, but also as a good scientist.  

To Leanne Groban – thank you for helping me understand the intricacies involved in 

echocardiography and for our discussions on cardiac diastology.   To Ann Tallant – 

When  I was applying  to graduate schools,  I  came across a  school  that  I had heard 

good  things  about,  and  then  I  found  your  information  on  the  Physiology  & 

Pharmacology website.  I came to Wake Forest because you pushed to get me here.  I 

am  forever  grateful.    Thank  you  for  all  that  you  and  Dr.  Gallagher  have  done  for 

Channie  and  I.    And  last,  but  not  least,  to  Jasmina  Varagic  –  thank  you  for  your 

continued  guidance  during  my  time  here  as  a  student.    Our  discussions  about 

ii

science  and  life  have  made  me  a  better  person.    I  truly  appreciate  our  fruitful 

discussions!   

I would also like to thank the National Institutes of Health and the American 

Heart Association for funding these studies. 

Next, I would like to acknowledge the great training environment of both the 

Department  of  Physiology  &  Pharmacology  and  the  Hypertension  &  Vascular 

Research Center.    The  faculty,  staff,  and  students have made  a  concerted effort  to 

make  this  the  best  possible  place  for  scientific  training.    I  also want  to  thank  the 

Graduate School staff for all of their help throughout my graduate career.  They are 

truly a superb asset to the Graduate School.   

As a  first‐generation college graduate,  the husband,  son, grandson, brother, 

and cousin of the hardest‐working people I know, I am truly grateful to my family to 

an end at which no words can express.  The blue‐collar work ethic instilled in me in 

my small hometown of Arcanum, Ohio from a young age has served me well, and I 

owe it to my family.  To my grandparents, aunts, uncles, cousins – you have always 

supported everything that I have wished to do.  For that, I am truly appreciative.  To 

my  Dad  and  Mom,  Mark  &  Peggy  –  words  cannot  express  how  grateful  I  am  for 

everything  that  you  have  done  for me.    You  have  nurtured my  curiosity  from  the 

time I was crawling out of my crib at 6 months of age!  I hope you will always know 

that my curiosity will never die, and I owe it to you.   Last, but certainly not least, I 

want  to  thank my wife of  five years, Channie.   Your constant support  through this 

beginning of our life together was a driving force in my – our  success.    I could not 

have done it without you.   

iii

Four weeks short of my dissertation defense, my maternal grandfather  lost 

his 20‐year battle with heart disease.  His first heart attack at the age of 52, when I 

was 8 years old, sparked  in me an  interest  in how the heart works.    “What causes 

heart attacks?  How can they be prevented?,” I remember asking myself.  Herman R. 

Miller was a hard‐working family man with whom I spent a considerable amount of 

time during the course of my childhood and beyond.  He taught me many things in 

life — how to fish and how to be a craftsman, and more importantly, he taught me 

that there was nothing more important in life than family.  In short, he helped teach 

me how to be a man.  After his first heart attack in 1988, he had several other heart 

attacks  and  strokes,  was  diabetic,  hypertensive,  hypercholesterolemic  —  the 

epitome of the metabolic syndrome.   It was perhaps a medical miracle that he was 

able to live quite well for most of his 20 years following his initial heart attack, but I 

know that the pharmacy of medications he was taking gave us 20 more years with 

him that we would not have had otherwise.  It is in that spirit that I hope to be able 

to repay what was given to me, more time with a man whom I already dearly miss.  I 

hope to be able to make further strides in heart research so that other people can be 

afforded more time with their loved ones.   

With all of that said, I dedicate this entire dissertation to my family without 

which I would not be where I am today.  Isaac Newton is quoted as once saying, “If I 

have seen further, it is by standing on the shoulders of giants.”  While quite literally 

my generally short‐statured family may not be “giants,” that quote is very befitting 

this occasion because they are giants in my life.

iv

TABLE OF CONTENTS 

 List of Figures                                                                                                                                   ix  List of Tables                                                                                                                                     xi  List of Abbreviations                         xii 

bstract                                                                                                                                            xvi  A  

CHAPTER I  

GENERAL INTRODUCTION: THE RENIN­ANGIOTENSIN SYSTEM  AND THE HEART 

 (This chapter was published in the Textbook of Nephro‐Endocrinology, Ed. Singh A. 

& Williams G.  San Diego: Elsevier, 2009. 181‐188.)  I.1  Abstract                           2  I.2  Introduction                           3  I.3  Cardiac RAS: Local vs. Endocrine Origin                   4  I.4  RAS Actions at the Cellular Level                     7  I.5  RAS and the Coronary Circulation                    10  I.6  Significance of the RAS on Cardiac Function                12  I.7  Conclusions                          14    References                          16 

Figures                          33     

CHAPTER II  

GENERAL INTRODUCTION: ANGIOTENSIN­(1­7): PHARMACOLOGY AND NEW  CARDIOVASCULAR TREATMPERSPECTIVES IN ENTS 

(This chapter was published in Cardiovascular Drug Reviews 2007; 25:162‐174.)  

v

 

II.1  Abstract                          38  II.2  Introduction                          39  II.3  Angiotensin‐(1‐7)‐Forming Enzymes                  40  II.4  Pharmacokinetics                        42  II.5  Pharmacodynamics                        44  II.6  Conclusions                          52    Acknowledgements                        53    References                          54 

Figures                          68     

CHAPTER III  

GENERAL INTRODUCTION: FURTHER EXPANSION OF THE RENIN­­12) ANGIOTENSIN SYSTEM: ANGIOTENSIN­(1

 (This chapter is an excerpt from an artice published in the Journal of Molecular 

Medicine 2008; 86: 663‐671.) 

II.1  I 

Angiotensin‐(1‐12)                        75 

References                          77  igures                          78 F

  

CHAPTER IV  

 RATIONALE AND AIMS 

IV.1  Rationale and Aims                        82 

References                          85     

CHAPTER V  

vi

PRIMARY ROLE OF ANGIOTENSIN CONVERTING ENZYME 2 IN CARDIAC PRODUCTION OF ANGIOTENSIN­(1­7) IN TRANSGENIC REN­2 HYPERTENSIVE 

RATS  

(This chapter was published in the American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology 2007; 292:H3019‐H3024.) 

 V.1  Abstract                          88  V.2  Introduction                          89  V.3  Materials and Methods                      90  V.4  Results                          93  V.5  Discussion                          95    Acknowledgements                      100    References                        101    Figures                        107 

    

CHAPTER VI 

DISRUPTION OF CARDIAC ANGIOTENSIN PEPTIDES BY ANGIOTENSIN CONVERTING ENZYME 2 INHIBITION EXACERBATES CARDIAC HYPERTROPHY 

HYPERTENSAND FIBROSIS IN REN­2  IVE RATS  

(This chapter will be submitted to Hypertension, December, 2008)  VI.1  Abstract                        118  VI.2  Introduction                        120  VI.3  Materials and Methods                    121  VI.4  Results                        127  VI.5  Discussion                        128    Acknowledgements                      132 

References                        134 

vii

   

  Tables                         144 

Figures                        148    

  VII 

CHAPTER  

ANGIOTENSIN­(1­12) IS AN ALTERNATE SUBSTRATE FOR THE PRODUCTION PEPTIDES IN THE HEART OF ANGIOTENSIN 

 (This chapter was published in the American Journal of Physiology – Heart and 

Circulatory Physiology 2008; 294: H2242‐H2247.)  VII.1  Abstract                        159  VII.2  Introduction                        160  VII.3  Materials and Methods                    161  VII.4  Results                        164  VII.5  Discussion                        167    Acknowledgements                      172    References                        174    Tables                         178 

Figures                        184    

 V 

CHAPTER  III 

SUMMARY AND GENERAL DISCUSSION  VIII.1  Summary and General Discussion                  190    References                        200 

Figures                        208    

  

APPENDIX                          212  

viii

LIST OF FIGURES   CHAPTER I  Figure I.1  Current View of the Cardiac Renin‐Angiotensin System            34 

igure I.2  The Two Sources of the Cardiac Renin‐Angiotensin System          36  F  CHAPTER II  Figure II.1  The Chemical Structure of Ang‐(1‐7)                69  Figure II.2  Current View of the Renin‐Angiotensin System              71 

igure II.3  Plasma Clearance of Ang‐(1‐7)                  73  F  CHAPTER III  Figure III.1  Ang‐(1‐12) Concentrations in Rat Tissue                79 

igure III.2  Immunohistochemical Localization of Ang‐(1‐12)            81  F  CHAPTER V  Figure V.1  Ang II Degradation in Isolated Rat Hearts              108  Figure V.2  Ang‐(1‐7) Formation in Isolated Rat Hearts            110 

erfus te  Figure V.3  Immunoreactive Ang‐(1‐7) in Heart P a           112  Figure V.4  Chromatograph of Cardiac Perfusate               114 

igure V.5  Angiotensin Converting Enzyme 2 Immunoblots            116  F  CHAPTER V

Rate in Ren‐2 Rats 

I  Figure VI.1  Radiotelemetric Blood Pressure and Heart          149  

ix

Figure VI.2  Plasma and Cardiac Angiotensin Peptides              151  Figure VI.3  Brightfield and Polarized Photomicrographs of Collagen Staining   153 

 Figure VI.4  Photomicrographs Showing Cardiomyocyte Cross‐Sectional Area   155 

igure VI.5  Pressure‐Volume Loops in Ren‐2 Rats Treated ± MLN‐4760        157  F  CHAPTER V  II Figure VII.1  Ang Peptide Production in SD Hearts              185 

earts  Figure VII.2  Ang Peptide Production in Lewis and Congenic H         187 

igure VII.3  Ang Peptide Production in WKY and SHR Hearts            189  F  CHAPTER VIII 

elin           Figure VIII.1  Illustration of the Increasing Role of ACE2 in Cardiac Remod g  209 

igure VIII.2  Illustration Relating the Current Studies to the Cardiac RAS       211  F  APPENDIX  Figure A.1  Ang‐(1‐7) Formation  by POP in Isolated Hearts            213  Figure A.2  Ang‐(1‐7) Formation by Serine Proteases in Isolated Hearts        215 

x

LIST OF TABLES   CHAPTER VI  Table VI.1  24‐Hour Radiotelemetric Blood Pressures and Heart Rates        145 

able VI.2  Cardiac Functional Parameters                147  T  CHAPTER V  II Table VII.1  Time Course of Heart Rates in All Strains Studied           179 

  trains Studied  Table VII.2  Time Course of Perfusion Pressures in All S       181  Table VII.3  Pooled Angiotensin Peptide Correlations              183 

xi

LIST OF ABBREVIATIONS  

2K1C          2 kidney, 1 clip hypertension  AALAC        nt  nd Accreditation of  A Association for Assessme a

Laboratory Animal Care    ACE          angiotensin converting enzyme   ACE2          angiotensin converting enzyme 2  ADAM17        tumor necrosis factor α convertase 

enzenesulfonyl fluoride  AEBSF         4‐(2‐Aminoethyl)b Ang          angiotensin  ANOVA        analysis of variance  Aogen         angiotensinogen 

B r  AR           angiotensin II type 1 receptor blocke

1

 AT           angiotensin II type 1 receptor 

2

 AT           angiotensin II type 2 receptor  AT(1‐7)          angiotensin‐(1‐7) receptor  AVE 0991        angiotensin‐(1‐7) analog 

uring diastole  AWTd         anterior wall thickness d BPM          beats per minute  COX‐2          cyclooxygenase‐2 

ker  CV‐11974        candesartan, angiotensin receptor bloc D‐Ala7 ng‐(1‐7)      angiotensin‐(1‐7) receptor antagonist  P/dt          rate of change in left ventricular  

‐A

d maximummaxpressure 

 dP/dtmin         rate of change in left ventricular  

xii

minimumpressure 

e′          early mitral annular descent 

  E/e′          index of left ventricular filling pressures

DT E A          ethylenediaminetetraacetic acid 

flow velocity      Emax          maximal early mitral in Eps          endopeptidases 

g diastole  EDDd          end‐diastolic dimension durin EDP          end‐diastolic pressure 

e relationship  EDPVR        end‐diastolic pressure‐volum EDV          end‐diastolic volume 

ng diastole  ESDd          end‐systolic dimenstion duri ESP          end‐systolic pressure 

e relationship  ESPVR         end‐systolic pressure‐volum

e  ESV          end‐systolic volum fmol          femtomole 

ortening  FS          fractional sh g          gram  GFR          glomerular filtration rate  EPES         N Hydroxyethyl)piperazine‐N'‐ethanesulfonic  H ‐(2‐

Acid  HFBA          heptaflurorobutyric acid 

 liquid chromatography  HPLC          high performance HR          heart rate 

Da          kilodalton  k 

xiii

kg          kilogram 

  L‐NAME        nitric oxide synthase inhibitor LTP          long‐term potentiation  LVH          left ventricular hypertrophy  MAP kinase        mitogen activated protein kinase 

) receptor  mas          angiotensin‐(1‐7 MeOH          methanol  mg          milligram  μM, μmol/L        micromolar  mM, mmol/L        millimolar  mL          milliliter 

e 2 inhibitor  MLN‐4760        angiotensin converting enzym mm Hg        millimeters of mercury 

genic rat  mRen2.Lewis       mRen2.Lewis con ng          nanogram  nM, nmol/L        nanomolar  NO          nitric oxide  iNOS          inducible nitric oxide synthase  PCP          lysosomal Pro‐X carboxypeptidase 

    pg          picogram    pM, pmol/L        picomolar  POP          prolyl oligopeptidase 

P          perfusion pressure 

xiv

 P 

Pro(R)R        (pro)renin receptor 

iastole  PWTd          posterior wall thickness during d NEP          neprilysin, enkephalinase  RAS          renin‐angiotensin system  RIA          radioimmunoassay 

rting enzyme 2  sACE2         secreted angiotensin conve SD          Sprague‐Dawley rat  SEM          standard error of the mean 

ensive rat  SHR          spontaneously hypert

V  S         stroke volume  t1/2          half‐life 

 ( tau τ)         time constant of relaxation 

(+ Tg )          [mRen2]27 transgenic rat  Tg(‐)          non‐transgenic Sprague‐Dawley rat  TGF‐β          transforming growth factor β  TNF‐α         tumor necrosis factor α 

  TOP          thimet oligopeptidase 

eia unit    USP unit        United States Pharmacop WFML‐1        rat renin inhibitor  WKY          wistar‐kyoto rat  ZPP          z‐pro‐prolinal 

xv

ABSTRACT 

Aaron J. Trask  

 NEW ADVANCES ON THE BIOCHEMICAL PATHWAYS IN THE RENIN­

ANGIOTENSIN SYSTEM IN HYPERTENSION AND THEIR ROLE IN CARDIAC 

 STRUCTURE AND FUNCTION 

Dissertation under the direction of Carlos M. Ferrario, M.D.  Director, Hypertension and Vascular Research Center 

Professor of Surgical Sciences and Physiology & Pharmacology    

Cardiovascular  disease,  including  heart  failure,  remains  a  leading  cause  of 

mortality  both  in  the United  States,  and worldwide.    Two  of  the most  recognized 

contributing  risk  factors  to  the  progression  of  cardiovascular  disease  and  heart 

failure are hypertension and cardiac hypertrophy.   Although the incidence of heart 

disease has been declining since 1999, it is still the number one killer accounting for 

27% of  all  deaths  in  the United  States  in  2005,  the  latest  year  for which data  are 

available.    Moreover,  hypertension  is  a  critical  risk  factor  contributing  to  cardiac 

hypertrophy  and  heart  disease,  and  only  about  one  out  of  every  three  patients 

afflicted with hypertension are actually controlled.   

Because the renin‐angiotensin system (RAS) plays a major contributing role 

to  the  pathophysiology  of  hypertension  and  heart  disease,  the  studies  outlined  in 

this dissertation  traverse  the complexities of  the biochemical pathways within  the 

cardiac  renin‐angiotensin  system  in  normal  and  hypertensive  rats.    My  research 

showed  first  that  angiotensin  converting  enzyme  2  (ACE2)  directly  converts 

angiotensin  (Ang)  II  into  Ang‐(1‐7)  only  in  hypertrophic  hearts  isolated  from 

hypertensive  rats.    Moreover,  chronic  in  vivo  pharmacological  blockade  of  ACE2 

xvi

resulted in a disruption of the balance of cardiac Ang II and Ang‐(1‐7), the result of 

which was increased cardiac fibrosis and hypertrophy in the absence of  functional 

changes  in  the  heart.    In  addition,  we  showed  that  a  new  peptide  within  the 

biochemical  cascade  of  the  RAS  —  called  Ang‐(1‐12)  —  serves  as  an  alternate 

substrate for the production of downstream bioactive angiotensin peptides in hearts 

isolated from normal and hypertensive rats.  Collectively, the studies outlined in this 

dissertation  provide  newer  insights  into  the  complexities  that  exist  within  the 

cardiac  RAS.    Our  data  suggest  that  ACE2 may  be  a  compensatory  mechanism  in 

cardiac hypertrophy attempting to overcome for the deleterious effects of increased 

cardiac Ang II activity on cardiac remodeling.   Furthermore, our data showing that 

both  Ang  II  and  Ang‐(1‐7)  are  produced  from  Ang‐(1‐12)  in  a  renin‐independent 

manner  paves  the way  for  the  discovery  of  alternate  enzymatic  pathways  that,  in 

accounting  for  the  generation  of  angiotensins,  may  lead  to  new  therapeutic 

approaches for the treatment of hypertension and heart disease.

 

 

              

xvii

CHAPTER I  

THE REN  HEART IN­ANGIOTENSIN SYSTEM AND THE 

Aaron J. Trask and Carlos M. Ferrario   

H  D  ypertension and Vascular Research Centerepart cologyWake icine 

 

ment of Physiology and Pharma Forest Universi y School of MedWinston‐Salem, North Carolina 

t

  

 [This  chapter was  published  in  the  Textbook  of Nephro­Endocrinology  (Ed. Singh A. & Williams G.   San Diego: Elsevier, 2009. 181­188.) and  is reprinted with  permission.   Differences  in  formatting  reflect  the  requirements  of  the publisher.    Aaron  J.  Trask  prepared  the  manuscript,  while  Dr.  Carlos  M. Ferrario acted in an editorial and advisory capacity.]                  

1

I.1    ABSTRACT 

The existence and physiological importance of the cardiac renin‐angiotensin 

system has shaped the ways in which cardiovascular diseases are currently treated.  

The actions of two bioactive peptides of the RAS – angiotensin II and angiotensin‐(1‐

7) – on the heart are generally opposing, which provides the system with a counter‐

balancing  mechanism  that  may  be  altered  in  pathological  states  such  as 

hypertension  and  heart  disease.    The  current  pharmacologic  therapies  for 

hypertension  and  heart  failure,  which  include  angiotensin  converting  enzyme 

inhibitors  and  angiotensin  receptor  blockers,  may  act  not  only  in  the  systemic 

circulation, but they may also act at local tissue sites, including the heart, to correct 

the  imbalance of  the  two angiotensin peptides.   This  chapter  encompasses  a brief 

review  of  current  literature  as  it  pertains  to  the  renin‐angiotensin  system  in  the 

heart,  and  incorporates  how  current  therapies  are  working  toward  treatment  of 

cardiac disorders and heart failure.   

 

Key  Words:  angiotensin  I,  angiotensin  II,  angiotensin‐(1‐7),  ACE  inhibitor, angiotensin receptor blocker, heart, cardiac RAS 

2

I.2  INTRODUCTION  

For  many  years,  the  renin‐angiotensin  system  (RAS)  was  thought  to  be 

mainly  a  traditional  circulating  hormonal  system whereby  renal  renin‐dependent 

production of angiotensin II (Ang II) occurred in response to a fall in macula densa 

sodium  concentration,  low  arterial  pressure,  or  a  decrease  in  circulating  blood 

volume.    Renin  could  then  act  upon  its  circulating  substrate,  angiotensinogen — 

primarily produced  in  the  liver —  to produce  the  inactive precursor decapeptide, 

angiotensin I (Ang I).  This process served as the starting point for the RAS cascade 

in  that  Ang  I  could  be  acted  upon  by  several  different  enzymes  to  produce  the 

biologically  active  peptide  hormones, Ang  II  and  angiotensin‐(1‐7)  [Ang‐(1‐7)].    A 

diagrammatic  figure  of  the  current  expanded  view  of  the  RAS  as  primarily 

characterized by our laboratories (Ferrario et al., 2005) is shown in Figure I.1.   

Recent  advances  over  the  last  several  decades  showed  that  the  RAS  is  not 

merely an endocrine system — body tissues harbor local renin‐angiotensin systems, 

which  can  alter  physiologic  processes  by  exerting  autocrine/paracrine  actions.  

Local renin‐angiotensin systems (Lee et al., 1993;Paul et al., 2006) have been found 

to  date  in  the  brain,  kidney,  vasculature,  pancreas,  uterus,  placenta,  the  intestine, 

and  the  focus of  this  chapter,  the heart.   These  local  systems  are  thought  to  exert 

effects  on  the  tissues  in  which  they  reside,  independent  of  blood  pressure 

alterations (Lee et al., 1993;Paul et al., 2006).  The local cardiac RAS is no exception.  

This  chapter will  encompass  the  origin  of  the  cardiac RAS  and  summarize  how  it 

acts  to  regulate  cardiac  processes  and  coronary  blood  flow.    Most  of  the 

3

experimental  findings  regarding  the  cardiac  RAS  reported  in  this  chapter  are 

derived from or performed in animal models, including rodents [see Paul et al., 2006 

for review].  With the advent and wide use of angiotensin converting enzyme (ACE) 

inhibitors  and  angiotensin  receptor  blockers  (ARBs)  for  the  treatment  of 

hypertension  and  heart  failure  also  came  clinical  data  that  now  begins  to 

complement years of experimental findings.   

I.3  CARDIAC RAS: LOCAL VS. ENDOCRINE ORIGIN 

In  order  for  an  organ  to  have  a  complete  RAS,  it  must  possess  all  of  the 

necessary  components,  including  the  genes  leading  to  the  expression  of  the 

precursor  protein  angiotensinogen,  as  well  as  all  of  the  processing  enzymes  that 

determine which biologically‐active peptides will be produced.  Using these criteria, 

the heart does  indeed possess a complete RAS.   Angiotensinogen and renin, either 

synthesized locally or uptaken from the circulation, serve as the precursors to Ang I, 

which  can  be  acted  upon  by  either  angiotensin  converting  enzyme  (ACE)  or 

chymase (Urata et al., 1990) to yield the potent mitogenic vasopressor and growth‐

promoting  hormone Ang  II.    Newer  studies  (Ferrario  et  al.,  2005)  now  show  that 

Ang  II  can  then  be  hydrolyzed  by  angiotensin  converting  enzyme  2  (ACE2)  to 

produce Ang‐(1‐7)  (Trask et al., 2007),  an action  that allows ACE2  to  regulate  the 

balance of the two biologically‐active arms of the RAS.  Ang I can also be acted upon 

by  the  endopeptidases  prolyl  oligopeptidase  (POP),  neprilysin  (NEP),  and  thimet 

oligopeptidase (TOP) to produce Ang‐(1‐7) (Welches et al., 1993).  Although not all 

of these activities have been shown to produce Ang‐(1‐7) directly in the heart, all of 

4

these enzymes have been shown to hydrolyze Ang I into Ang‐(1‐7) (Chappell et al., 

2000;Yamamoto  et  al.,  1992).    Since  the  heart  contains  all  of  these  necessary 

components  to  produce  Ang‐(1‐7)  from  Ang  I  (Cicilini  et  al.,  1994;Fielitz  et  al., 

2002;Linardi  et  al.,  2004),  it  is  plausible  to  consider  that  given  the  availability  of 

substrate, Ang‐(1‐7) may also be produced from Ang I in the heart.  While this area 

of  research  still  requires  further  investigation,  early  work  from  our  laboratory 

showed  the  release  of Ang‐(1‐7)  in  canine  coronary  sinus  post  induction  of  acute 

myocardial  ischemia  (Santos  et  al.,  1990).    In  addition,  newer  studies  showed  the 

involvement  of  ACE2  in  accounting  for  the  increased  formation  of  Ang‐(1‐7)  in 

failing human heart ventricles (Zisman et al., 2003b;Zisman et al., 2003a).   

As illustrated above, the existence of a RAS that is harbored within the heart 

is without  question,  but  the  origin  of  the  local  cardiac  RAS  is  still  somewhat  of  a 

controversy.    In  support  of  local  production  are  the  following  data.    First,  cardiac 

myocytes  and  fibroblasts  have  the  ability  to  produce  the  angiotensin  precursor 

protein,  angiotensinogen,  as  well  as  the  rate‐limiting  enzyme  that  serves  as  the 

starting point of the RAS cascade, renin.   Second,  intriguing evidence suggests that 

cardiac  renin  may  be  synthesized  by  mast  cells,  while  low  in  abundance  in  the 

normal heart, may be recruited into the cardiac tissue during pathological processes 

such  as  ischemia  (Francis  and  Tang,  2006;Le  and  Coffman,  2006;Mackins  et  al., 

2006;Miyazaki et al., 2006;Reid et al., 2007;Xiao and Bernstein, 2005).  Third, some 

studies  have  detected  ample  amounts  of  angiotensinogen  (Kunapuli  and  Kumar, 

1987;Sawa  et  al.,  1992)  in  the  human  heart.    In  a  comparative  study  of 

angiotensinogen  and  renin,  Dzau  and  colleagues  (Dzau  et  al.,  1987)  found  that 

5

angiotensinogen  mRNA  levels  were  in  far  excess  of  renin  in  rodent  hearts, 

suggesting  the  possibility  of  excess  substrate  for  the  rate‐limiting  enzyme,  renin.  

Fourth, angiotensinogen and renin may be localized only in the atria, but not in the 

ventricles  (Chernin  et  al.,  1990).    These  studies  provide  support  that  the  heart 

contain nsin prs the machinery by which to synthesize angiote ecursors.   

However, some studies have cast doubt on the de novo production of renin in 

the heart. First, there are data that renin is uptaken from the circulation into cardiac 

tissue  for  the  processing  of  angiotensin  peptides  (Danser,  2003).    Second,  the 

finding that cardiac renin falls to undetectable levels after bilateral nephrectomy is 

indeed  compelling  (Danser  et  al.,  1994),  although  recent  identification  of  renin  in 

cardiac  mast  cells  may  provide  an  alternative  explanation  (Francis  and  Tang, 

2006;Le  and  Coffman,  2006;Mackins  et  al.,  2006;Miyazaki  et  al.,  2006;Reid  et  al., 

2007;Xiao and Bernstein, 2005).   Third, the transition from a circulating endocrine 

to  a  local  autocrine/paracrine  system  was  shown  to  be  mediated  by  several 

different receptors.  Both the Ang II AT1 receptor (de Lannoy et al., 1998;van Kats et 

al.,  1997)  and  the  (pro)renin  receptor  (Nguyen  et  al.,  2002;Nguyen  et  al., 

2004;Nguyen  and  Burckle,  2004)  have  been  reported  as  mediating  their  ligand’s 

uptake  into  the heart, respectively.   Fourth, Kalinyak et al.  (Kalinyak and Perlman, 

1987)  found  that  angiotensinogen  mRNA  was  undetectable  in  the  heart.    Fifth, 

perfused isolated rat hearts required the addition of angiotensinogen and renin into 

the  perfusate  in  order  to  detect  angiotensin  I  formation  (de  Lannoy  et  al.,  1997).  

These  data  show  that  components  of  the  renin‐angiotensin  system may  likely  be 

uptaken from the circulation for processing by cardiac proteases.   

6

In  summary,  the  origin  of  the  cardiac  RAS  is  likely  a  result  of  both  local 

production and uptake from the circulation, both compartments communicating in 

endocrine, autocrine, paracrine, and intracrine ways we do not yet understand (see 

Figure I.2).  Studies that support either the synthesis or uptake of RAS components 

in  the  heart  are  limited  in  that  both  require  the  isolation  of  the  heart  and/or  its 

components from the organism.  While there is no doubt that a wealth of knowledge 

has  stemmed  from  these  types  of  studies,  including  studies  from  our  laboratory, 

discovering ways  in which  to dissect how a particular organ and/or organ system 

operates  and  communicates  within  the  organism  is  of  the  utmost  importance.  

Additional  insights  into  this  question  may  provide  a  better  understanding  of  the 

biological physiology of  tissue RAS  in general.   As previously  suggested by Re (Re, 

2004), we  are  in  agreement  that  these  two  sources  of  the  RAS  likely  interact  via 

some mechanism by which we do not yet understand.   

I.4  RAS ACTIONS AT THE CELLULAR LEVEL  

Two  biologically‐active  peptides  of  the  RAS  exert  their  effects  on  cardiac 

dynamics  and growth at  the  cellular  level.    It  is now evident  that both Ang  II  and 

Ang‐(1‐7)  have  opposing  actions  on  cardiac  myocytes,  fibroblasts,  and  coronary 

endothelial cells.   Ang II, via the AT1 receptor, facilitates calcium (Ca2+) handling in 

the  cardiac  cells  (Baker  et  al.,  1984;Baker  et  al.,  1989;Freer  et  al.,  1976;Kass  and 

Blair, 1981;Peach, 1981), triggering enhanced cardiac contractility.  This occurs via 

increases  in  cytosolic  Ca2+  occurring  both  via  increased  uptake  at  the  cellular 

membrane  and  by  activation  of  inositol  phosphates  leading  to  Ca2+  release  from 

7

sarcoplasmic  reticulum  (Baker  et  al.,  1989).    In  both  cardiac  myocytes  and 

fibroblasts, Ang II also exhibits growth‐promoting effects by activating the mitogen‐

activated protein (MAP) kinase cascade, a pathway long recognized to be important 

in  cellular  growth  (Booz  et  al.,  1994;Sadoshima  et  al.,  1995;Schorb  et  al., 

1995;Yamazaki et al., 1995).  Solid evidence for Ang II‐mediated cardiac fibrosis was 

provided when Villarreal and colleagues (Villarreal et al., 1993) reported that Ang II 

could bind AT1 receptors in cardiac fibroblasts.  Further studies showed that Ang II 

may  act  through  transforming  growth  factor  beta  (TGF‐β)  to  induced  increased 

collagen deposition (Campbell and Katwa, 1997).   Proliferation of fibroblasts leads 

to  an  increased deposition of  collagen  in  the myocardium, which, when  combined 

with myocyte hypertrophy,  leads to  left ventricular hypertrophy (LVH) — a major 

risk factor for hypertension and heart failure.   

The  above‐mentioned  effects  of  Ang  II  have  been  attributed  to  the  AT1 

receptor; however, Ang II also binds to another receptor—the AT2 receptor—with 

high affinity (de Gasparo et al., 2000).  This receptor is thought to oppose the actions 

of  Ang  II‐induced  activation  of  the  AT1  receptor  (Carey,  2005;Nakajima  et  al., 

1995;Yamada et  al.,  1998).   However, more  recent  evidence purports  that  cardiac 

AT2  receptors  can  act  as  constitutive  growth‐promoting  receptors  that  do  not 

antagonize  the  hypertrophy‐promoting  consequences  of  AT1‐receptor‐mediated 

activation  by  Ang  II  (D'Amore  et  al.,  2005).    As  one  can  easily  appreciate,  the 

underlying void of a complete understanding of these two Ang II receptors and its 

implication in the modulation of cardiac function remains to be clarified.   

8

In contrast to the cellular effects of Ang II in the heart, Ang‐(1‐7) was recently 

shown to inhibit the growth of cardiac myocytes via activation of the mas receptor 

(Tallant  et  al.,  2005), which was previously  shown  to be  a  functional  receptor  for 

Ang‐(1‐7) (Santos et al., 2003).   This  finding followed several years of studies that 

showed  Ang‐(1‐7)  could  inhibit  cellular  growth  in  vascular  smooth  muscle  cells 

(Freeman et al., 1996;Strawn et al., 1999;Tallant and Clark, 2003).  Moreover, Ang‐

(1‐7) can also mitigate fibrosis under cell culture conditions (Iwata et al., 2005), as 

well  as  fibrosis  associated with Ang  II‐driven  (Grobe  et  al.,  2007)  and DOCA‐salt‐

driven  (Grobe  et  al.,  2006)  cardiac  hypertrophy.    Indeed,  studies  from  our 

laboratory confirmed the existence of Ang‐(1‐7) in the heart and further showed an 

increase  in  Ang‐(1‐7)  immunoreactivity  in  cardiac  myocytes,  but  not  in  cardiac 

fibroblasts  in  response  to  coronary  artery  ligation  (Averill  et  al.,  2003).    In  two 

separate  studies,  Zisman  also  confirmed  that Ang‐(1‐7)  could  be  generated  in  the 

human heart (Zisman et al., 2003b;Zisman et al., 2003a).   This  local Ang‐(1‐7) may 

act on the cells of the heart to improve cardiac function, as will be discussed later in 

this chapter.   Furthermore, Ang‐(1‐7) augments the threshold to  ischemic‐induced 

arrhythmias (Ferreira et al., 2001;Ferreira et al., 2002;Santos et al., 2006) as well as 

hyperpolarizing  the  ischemic heart  fibers and re‐establishing  impulse propagation 

(De Mello, 2004).  The beneficial effects of Ang (1‐7) are dose‐dependent because at 

higher  concentrations  (10‐7 M)  the heptapeptide elicits  an  appreciable  increase of 

action potential duration and early‐after depolarizations (De Mello et al., 2007).  In 

keeping with these findings, progressive conduction and rhythm disturbances with 

9

sustained  ventricular  tachycardia  and  terminal  ventricular  fibrillation  occurred  in 

transgenic mice with increased cardiac ACE2 expression (Donoghue et al., 2003).   

The  intracellular, or  “intracrine,” RAS may mediate biological  activity on  its 

own.    Very  early  studies  showed  that  Ang  II  could  be  localized  to  nuclei  of  both 

smooth muscle  and  cardiac muscle  (Robertson,  Jr.  and Khairallah,  1971)  and  that 

the  action  of  the  octapeptide may  stimulate  intracellular  changes  in  conductance 

and  calcium  handling.    Moreover,  significant  support  for  intracellular  actions  of 

angiotensin  peptides  is  accumulating.    Baker  and  colleagues  (Baker  et  al.,  2004) 

found  that  exogenously‐administered  Ang  II  could  cause  cardiomyocyte 

hypertrophy,  as  well  as  stimulate  protein  synthesis,  effects  that  could  not  be 

reversed by administration of an AT1 receptor antagonist in the extracellular milieu.  

These  data  suggest  that  intracellular  Ang  II  could  promote  cardiac  hypertrophy 

independent of activation of the AT1 receptors on the cellular membrane.   

I.5  RAS AND THE CORONARY CIRCULATION 

The coronary circulation serves as the supply line to not only  the heart, but 

largely to the whole organism because  if coronary blood flow is  interrupted, heart 

function  is depleted and systemic perfusion can decline.   The coronary circulation 

also  serves  as  a  portal  —  a  portal  that  allows  the  exchange  of  nutrients  and 

hormones so that the heart can function properly.   One of those hormonal systems 

that regulates the coronary circulation is the RAS.  It is well accepted that blood flow 

in any tissue is regulated by both the autonomic nervous system and local effectors.  

This  heart  is  no  exception.    Cardiac  blood  flow  and  coronary maintenance  can be 

10

regulated locally by the production of adenosine, nitric oxide, Ang II, and Ang‐(1‐7), 

just to name a few.  Reduction of coronary blood flow by Ang II may either be direct, 

or  it  may  be mediated  by  the  stimulatory  effect  of  the  peptide  on  the  release  of 

endothelin‐1 (Schaefer et al., 2007).  The relevance of the vasoconstrictor effects of 

Ang II on the coronary circulation is highlighted by the observation that enalaprilat 

improves  coronary  blood  flow  post‐angioplasty  (Schaefer  et  al.,  2007).  

Furthermore, Zhang et al.  (Zhang et al., 2005) showed that AT1 receptor‐mediated 

coronary  constriction  is  augmented  in  the  prediabetic  metabolic  syndrome  and 

contributes to  impaired control of coronary blood flow via  increases  in circulating 

Ang II and coronary arteriolar AT  receptor density. 1

Evidence  for modulation  of  the  coronary  circulation by Ang‐(1‐7) was  first 

discovered by Kumagai and colleagues (Kumagai et al., 1990) in the hamster heart.  

These  investigators  found  that  Ang‐(1‐7)  produced  a  vasoconstrictor‐like  activity, 

likely due to the high doses used.   Later studies  found that Ang‐(1‐7)  in  fact acted 

upon  the  coronary  endothelium  to  induce  nitric  oxide  release,  which  produced  a 

dose‐dependent vasodilatory effect (Almeida et al., 2000;Brosnihan et al., 1996;Li et 

al., 1997;Porsti et al., 1994).  These findings are consistent with the actions of Ang‐

(1‐7)  in  other  vascular  beds  (Feterik  et  al.,  2000;Neves  et  al.,  2003;Oliveira  et  al., 

1999;Ren et al., 2002).   Moreover, Ang‐(1‐7) can also modulate  the distribution of 

blood  flow  via  changes  in  systemic  hemodynamics  (Sampaio  et  al.,  2003).  

Experimental  evidence  clearly  and  directly  shows  that  Ang‐(1‐7)  can  act  as  a 

vasodilator  in  not  only  the  coronary  circulation,  but  also  other  systemic  vascular 

11

beds.    The  heptapeptide may  also  play  a  role  in  the  distribution  of  blood  flow  to 

various systemic vascular beds as physiological needs change.   

I.6  SIGNIFICANCE OF THE RAS ON CARDIAC FUNCTION 

As one can undeniably appreciate given the above‐mentioned consequences 

of  Ang  II  and  Ang‐(1‐7)  at  the  cellular  level  of  the  heart,  these  biologically‐active 

peptides ultimately modulate myocardial performance.   Although the effects of the 

local  cardiac  RAS  at  the  cellular  level  have  unveiled  potential  mediators  of  heart 

disease,  the  ultimate  significance  of  the  local  RAS  in  the  heart  boils  down  to  its 

effects on how the heart performs.   

Pathophysiology of RAS in Cardiac Function 

The development of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors and the 

later  introduction of angiotensin receptor blockers  (ARBs) drastically  changed  the 

medical approaches to the management of cardiac pathology, including heart failure.  

Both in patients and in experimental animal models of left ventricular dysfunction, 

these  agents  were  proven  to  reverse  cardiac  hypertrophy  (Dahlof  et  al., 

1992;Dahlof, 1992;Dahlof et al.,  2002), correct  left ventricular systolic dysfunction 

(Braunwald et al., 2004;Buksa, 2000;Kober et al., 1995;Pfeffer et al., 2003;Young et 

al., 2004), and ameliorate progression of heart failure (Abdulla et al., 2006;Banerjee 

et  al.,  2003;Giles,  2007;Hedrich  et  al.,  2005;Levine  and  Levine,  2005;Pfeffer  et  al., 

2003;Voors and van Veldhuisen, 2005).   

Cardioprotection  mediated  by  blockade  of  increased  cardiac  expression  of 

Ang II has been demonstrated in experimental models of induced cardiac pathology, 

12

while  in humans, direct evidence for a  local  tissue mechanism is  for the most part 

inferred  from  experiments  in  animals.    However,  patients  with  unstable  angina 

produced  Ang  II  in  greater  amount  than  in  patients  with  stable  angina;  these 

changes  were  associated  with  increased  expression  of  angiotensinogen,  ACE,  and 

AT1‐receptor  genes  together  with  upregulation  of  tumor  necrosis  factor  (TNF‐α), 

interlukin‐6,  and  iNOS  genes  (Neri  Serneri  et  al.,  2004).    Human  cardiac  Ang  II‐

forming  activity  is  increased  in  autopsied  hearts  of  patients  with  myocardial 

infarction  (Ihara  et  al.,  2000),  a  finding  that  correlates  with  studies  in  the  rat 

(Ishiyama et al., 2004).  Given that changes in cardiac Ang II in infarcted or remnant 

myocardium are very limited, it remains to be determined whether blockade of the 

octapeptide Ang II in cardiac tissue contributes to the beneficial effects of blockers 

of the RAS on cardiac remodeling post‐myocardial infarction.   

Contrasting  with  the  functional  aspects  of  Ang  II  on  cardiac  performance, 

some evidence exists as  to whether  the heptapeptide Ang‐(1‐7) may be a positive 

modulator  of  cardiac  function,  counterbalancing  the hypertrophic  and pro‐fibrotic 

actions of Ang II.  Initial studies to characterize the functional effects of Ang‐(1‐7) on 

the  heart  showed  that  its  administration  could  improve  both  ischemia‐induced 

functional impairments and cardiac arrhythmias (Ferreira et al., 2001;Ferreira et al., 

2002).    The  latter  effect may  be  due  to  activation  of  the  sodium pump  in  cardiac 

muscle  (De  Mello,  2004)  that  may  act  to  hyperpolarize  the  cell  and  increase 

conduction  velocity  (De Mello  et  al.,  2007).   Additionally,  there  is  accumulating  in 

vivo  evidence  of  the  positive  effects  of  Ang‐(1‐7)  in  the  heart.    For  example, 

administration  of  Ang‐(1‐7)  after  coronary  artery  ligation  in  rats  attenuated  the 

13

development  of  heart  failure  (Loot  et  al.,  2002).    Furthermore,  plasma  Ang‐(1‐7) 

was augmented in response to coronary artery ligation in rats, with a corresponding 

increase  in  cardiac  ACE2  (Ishiyama  et  al.,  2004).    Taken  together,  these  findings 

suggest  that ACE2 may  act  to  facilitate  the  conversion of Ang  II  into Ang‐(1‐7)  as 

part of a feedforward mechanism as previously described by us, although in cardiac 

hypertrophy  it  appears  that  the  levels  of  Ang‐(1‐7)  are  insufficient  to 

counterbalance  the deleterious effects of Ang  II  (Ferrario et al., 2005).   Additional 

evidence  for  this  hypothesis  stems  from  severe  cardiac  functional  impairments  in 

both ACE2‐ and mas‐receptor‐knockout mice  (Crackower et al.,  2002;Santos et  al., 

2006)  and  the  demonstration  that  ACE2  overexpression  is  associated  with 

abrogation  of  experimentally‐induced  cardiac  hypertrophy  and  fibrosis 

(Huentelman et al., 2005).   

I.7  CONCLUSIONS 

As  in  all  biological  systems,  the  integration  of  the  components  of  various 

hormonal  systems  is  required  for  the  proper  assessment  of  physiological  and 

pathophysiological function.  The RAS is no exception.  The regulation of the cardiac 

RAS  is  likely  not  independent  of  the  circulation,  although  its  various  components 

can  undoubtedly  exert  direct  effects  on  the  tissue  itself.    Nor  possibly  does  the 

cardiac RAS operate  independent of other  tissues,  as a very recent  report  showed 

that renal AT1 receptors were required for the development of cardiac hypertrophy 

(Crowley et al., 2006).  Our understanding of the complexity of the system continues 

to  evolve.    One  thing  is  for  sure —  the  RAS  is  not  solely  a  circulating  endocrine 

14

system.    Increasing  data, much  of which  is  discussed  in  this  chapter,  have  shown 

that the RAS also exerts autocrine, paracrine, and intracrine actions that may work 

in concert within the organism to regulate physiological processes that when out of 

balance, may induce pathology. 

 

15

REFERENCES 

Abdulla,  J., Pogue,  J., Abildstrom, S.Z., Kober, L., Christensen, E., Pfeffer, M.A., Yusuf, 

S., and Torp‐Pedersen, C. (2006). Effect of angiotensin‐converting enzyme inhibition 

on  functional  class  in  patients  with  left  ventricular  systolic  dysfunction‐‐a  meta‐

analysis. Eur. J. Heart Fail. 8, 90‐96. 

Almeida, A.P., Frabregas, B.C., Madureira, M.M., Santos, R.J., Campagnole‐Santos, M.J., 

and Santos, R.A.  (2000). Angiotensin‐(1‐7) potentiates  the coronary vasodilatatory 

effect of bradykinin in the isolated rat heart. Braz. J. Med. Biol. Res. 33, 709‐713. 

Averill,  D.B.,  Ishiyama,  Y.,  Chappell,  M.C.,  and  Ferrario,  C.M.  (2003).  Cardiac 

angiotensin‐(1‐7) in ischemic cardiomyopathy. Circulation 108, 2141‐2146. 

Baker, K.M., Campanile, C.P., Trachte, G.J., and Peach, M.J. (1984). Identification and 

characterization of the rabbit angiotensin II myocardial receptor. Circ. Res. 54, 286‐

293. 

Baker, K.M., Chernin, M.I., Schreiber, T., Sanghi, S., Haiderzaidi, S., Booz, G.W., Dostal, 

D.E., and Kumar, R. (2004). Evidence of a novel intracrine mechanism in angiotensin 

II‐induced cardiac hypertrophy. Regul. Pept. 120, 5‐13. 

Baker,  K.M.,  Singer,  H.A.,  and  Aceto,  J.F.  (1989).  Angiotensin  II  receptor‐mediated 

stimulation  of  cytosolic‐free  calcium  and  inositol  phosphates  in  chick myocytes.  J. 

Pharmacol. Exp. Ther. 251, 578‐585. 

16

Banerjee,  A.,  Talreja,  A.,  Sonnenblick,  E.H.,  and  LeJemtel,  T.H.  (2003).  Evolving 

rationale for angiotensin‐converting enzyme inhibition in chronic heart failure. Mt. 

Sinai J. Med. 70, 225‐231. 

Booz, G.W., Dostal, D.E., Singer, H.A., and Baker, K.M. (1994). Involvement of protein 

kianse C and Ca2+ in angiotensin II‐induced mitogenesis of cardiac fibroblasts. Am. 

J. Physiol 267, C1308‐C1318. 

Braunwald,  E., Domanski, M.J.,  Fowler,  S.E.,  Geller, N.L.,  Gersh,  B.J., Hsia,  J.,  Pfeffer, 

M.A., Rice, M.M., Rosenberg, Y.D., and Rouleau,  J.L.  (2004). Angiotensin‐converting‐

enzyme inhibition in stable coronary artery disease. N. Engl. J. Med. 351, 2058‐2068. 

Brosnihan,  K.B.,  Li,  P.,  and  Ferrario,  C.M.  (1996).  Angiotensin‐(1‐7)  dilates  canine 

coronary arteries through kinins and nitric oxide. Hypertension 27, 523‐528. 

Buksa, M. (2000). [Trandolapril in the prevention of the sequelae of left ventricular 

systolic dysfunction after acute myocardial infarct]. Med. Arh. 54, 103‐106. 

Campbell,  S.E.  and  Katwa,  L.C.  (1997).  Angiotensin  II  stimulated  expression  of 

transforming growth factor‐beta1  in cardiac fibroblasts and myofibroblasts.  J. Mol. 

Cell Cardiol. 29, 1947‐1958. 

Carey, R.M.  (2005). Cardiovascular  and  renal  regulation by  the  angiotensin  type 2 

receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension 45, 840‐844. 

17

Chappell,  M.C.,  Gomez,  M.N.,  Pirro,  N.T.,  and  Ferrario,  C.M.  (2000).  Release  of 

angiotensin‐(1‐7)  from  the  rat  hindlimb:  influence  of  angiotensin‐converting 

enzyme inhibition. Hypertension 35, 348‐352. 

Chernin,  M.I.,  Candia,  A.F.,  Stark,  L.L.,  Aceto,  J.F.,  and  Baker,  K.M.  (1990).  Fetal 

expression of renin, angiotensinogen, and atriopeptin genes in chick heart. Clin. Exp. 

Hypertens. A 12, 617‐629. 

Cicilini,  M.A.,  Ramos,  P.S.,  Vasquez,  E.C.,  and  Cabral,  A.M.  (1994).  Heart  prolyl 

endopeptidase activity  in one‐kidney, one clip hypertensive rats. Braz.  J. Med. Biol. 

Res. 27, 2821‐2830. 

Crackower, M.A., Sarao, R., Oudit, G.Y., Yagil, C., Kozieradzki, I., Scanga, S.E., Oliveira‐

dos‐Santos, A.J., da, C.J., Zhang, L., Pei, Y., Scholey, J., Ferrario, C.M., Manoukian, A.S., 

Chappell,  M.C.,  Backx,  P.H.,  Yagil,  Y.,  and  Penninger,  J.M.  (2002).  Angiotensin‐

converting  enzyme 2  is  an  essential  regulator  of  heart  function. Nature  417,  822‐

828. 

Crowley, S.D., Gurley, S.B., Herrera, M.J., Ruiz, P., Griffiths, R., Kumar, A.P., Kim, H.S., 

Smithies, O., Le, T.H., and Coffman, T.M. (2006). Angiotensin II causes hypertension 

and cardiac hypertrophy through its receptors in the kidney. Proc. Natl. Acad. Sci. U. 

S. A 103, 17985‐17990. 

D'Amore, A., Black, M.J., and Thomas, W.G. (2005). The angiotensin II type 2 receptor 

causes constitutive growth of cardiomyocytes and does not antagonize angiotensin 

II type 1 receptor‐mediated hypertrophy. Hypertension 46, 1347‐1354. 

18

Dahlof,  B.  (1992).  Structural  cardiovascular  changes  in  essential  hypertension. 

Studies on the effect of antihypertensive therapy. Blood Press Suppl 6, 1‐75. 

Dahlof, B., Devereux, R.B., Kjeldsen, S.E., Julius, S., Beevers, G., de, F.U., Fyhrquist, F., 

Ibsen, H., Kristiansson, K.,  Lederballe‐Pedersen, O.,  Lindholm,  L.H., Nieminen, M.S., 

Omvik, P., Oparil, S., and Wedel, H. (2002). Cardiovascular morbidity and mortality 

in the Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension study (LIFE): a 

randomised trial against atenolol. Lancet 359, 995‐1003. 

Dahlof,  B.,  Pennert,  K.,  and  Hansson,  L.  (1992).  Reversal  of  left  ventricular 

hypertrophy in hypertensive patients. A metaanalysis of 109 treatment studies. Am. 

J. Hypertens. 5, 95‐110. 

Danser,  A.H.  (2003).  Local  renin‐angiotensin  systems:  the  unanswered  questions. 

Int. J. Biochem. Cell Biol. 35, 759‐768. 

Danser,  A.H.,  van Kats,  J.P.,  Admiraal,  P.J.,  Derkx,  F.H.,  Lamers,  J.M.,  Verdouw,  P.D., 

Saxena, P.R., and Schalekamp, M.A. (1994). Cardiac renin and angiotensins. Uptake 

from plasma versus in situ synthesis. Hypertension 24, 37‐48. 

de Lannoy, L.M., Danser, A.H., Bouhuizen, A.M.,  Saxena, P.R.,  and Schalekamp, M.A. 

(1998).  Localization  and  production  of  angiotensin  II  in  the  isolated  perfused  rat 

heart. Hypertension 31, 1111‐1117. 

de  Lannoy,  L.M.,  Danser,  A.H.,  van  Kats,  J.P.,  Schoemaker,  R.G.,  Saxena,  P.R.,  and 

Schalekamp, M.A.  (1997). Renin‐angiotensin  system  components  in  the  interstitial 

19

fluid  of  the  isolated  perfused  rat  heart.  Local  production  of  angiotensin  I. 

Hypertension 29, 1240‐1251. 

De  Mello,  W.C.  (2004).  Angiotensin  (1‐7)  re‐establishes  impulse  conduction  in 

cardiac muscle during ischaemia‐reperfusion. The role of the sodium pump. J. Renin. 

Angiotensin. Aldosterone. Syst. 5, 203‐208. 

De  Mello,  W.C.,  Ferrario,  C.M.,  and  Jessup,  J.A.  (2007).  Beneficial  versus  harmful 

effects of Angiotensin (1‐7) on impulse propagation and cardiac arrhythmias in the 

failing heart. J. Renin. Angiotensin. Aldosterone. Syst. 8, 74‐80. 

de  Gasparo,  M.,  Catt,  K.J.,  Inagami,  T.,  Wright,  J.W.,  and  Unger,  T.  (2000). 

International union of pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors. Pharmacol. 

Rev. 52, 415‐472. 

Donoghue,  M.,  Wakimoto,  H.,  Maguire,  C.T.,  Acton,  S.,  Hales,  P.,  Stagliano,  N., 

Fairchild‐Huntress, V., Xu, J., Lorenz, J.N., Kadambi, V., Berul, C.I., and Breitbart, R.E. 

(2003). Heart block, ventricular tachycardia, and sudden death  in ACE2 transgenic 

mice with downregulated connexins. J. Mol. Cell Cardiol. 35, 1043‐1053. 

Dzau, V.J., Ellison, K.E., Brody, T., Ingelfinger, J., and Pratt, R.E. (1987). A comparative 

study of the distributions of renin and angiotensinogen messenger ribonucleic acids 

in rat and mouse tissues. Endocrinology 120, 2334‐2338. 

Ferrario,  C.M.,  Trask,  A.J.,  and  Jessup,  J.A.  (2005).  Advances  in  biochemical  and 

functional  roles  of  angiotensin‐converting  enzyme  2  and  angiotensin‐(1‐7)  in 

20

regulation of cardiovascular function. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol 289, H2281‐

H2290. 

Ferreira,  A.J.,  Santos,  R.A.,  and  Almeida,  A.P.  (2001).  Angiotensin‐(1‐7): 

cardioprotective effect  in myocardial  ischemia/reperfusion. Hypertension 38, 665‐

668. 

Ferreira, A.J., Santos, R.A., and Almeida, A.P. (2002). Angiotensin‐(1‐7) improves the 

post‐ischemic  function  in  isolated  perfused  rat  hearts.  Braz.  J.  Med.  Biol.  Res.  35, 

1083‐1090. 

Feterik,  K.,  Smith,  L.,  and  Katusic,  Z.S.  (2000).  Angiotensin‐(1‐7)  causes 

endothelium‐dependent relaxation in canine middle cerebral artery. Brain Res. 873, 

75‐82. 

Fielitz,  J., Dendorfer, A., Pregla, R., Ehler, E., Zurbrugg, H.R., Bartunek,  J., Hetzer, R., 

and  Regitz‐Zagrosek,  V.  (2002).  Neutral  endopeptidase  is  activated  in 

cardiomyocytes  in  human  aortic  valve  stenosis  and  heart  failure.  Circulation  105, 

286‐289. 

Francis, G.S. and Tang, W.H. (2006). Histamine, mast cells, and heart failure: is there 

a connection? J. Am. Coll. Cardiol. 48, 1385‐1386. 

Freeman, E.J., Chisolm, G.M., Ferrario, C.M., and Tallant, E.A. (1996). Angiotensin‐(1‐

7) inhibits vascular smooth muscle cell growth. Hypertension 28, 104‐108. 

21

Freer, R.J., Pappano, A.J., Peach, M.J., Bing, K.T., McLean, M.J., Vogel, S., and Sperelakis, 

N.  (1976). Mechanism  for  the postive  inotropic effect of  angiotensin  II on  isolated 

cardiac muscle. Circ. Res. 39, 178‐183. 

Giles,  T.D.  (2007).  Renin‐Angiotensin  system  modulation  for  treatment  and 

prevention of cardiovascular diseases: toward an optimal therapeutic strategy. Rev. 

Cardiovasc. Med. 8 Suppl 2, S14‐S21. 

Grobe, J.L., Mecca, A.P., Lingis, M., Shenoy, V., Bolton, T.A., Machado, J.M., Speth, R.C., 

Raizada,  M.K.,  and  Katovich,  M.J.  (2007).  Prevention  of  angiotensin  II‐induced 

cardiac  remodeling  by  angiotensin‐(1‐7).  Am.  J.  Physiol  Heart  Circ.  Physiol  292, 

H736‐H742. 

Grobe, J.L., Mecca, A.P., Mao, H., and Katovich, M.J. (2006). Chronic angiotensin‐(1‐7) 

prevents cardiac  fibrosis  in DOCA‐salt model of hypertension. Am.  J. Physiol Heart 

Circ. Physiol 290, H2417‐H2423. 

Hedrich,  O.,  Patten,  R.D.,  and  Denofrio,  D.  (2005).  Current  Treatment  Options  for 

CHF Management: Focus on the Renin‐Angiotensin‐Aldosterone System. Curr. Treat. 

Options. Cardiovasc. Med. 7, 3‐13. 

Huentelman,  M.J.,  Grobe,  J.L.,  Vazquez,  J.,  Stewart,  J.M.,  Mecca,  A.P.,  Katovich,  M.J., 

Ferrario,  C.M.,  and  Raizada,  M.K.  (2005).  Protection  from  angiotensin  II‐induced 

cardiac hypertrophy and fibrosis by systemic lentiviral delivery of ACE2 in rats. Exp. 

Physiol 90, 783‐790. 

22

Ihara, M., Urata, H., Shirai, K.,  Ideishi, M., Hoshino, F., Suzumiya,  J., Kikuchi, M., and 

Arakawa,  K.  (2000).  High  cardiac  angiotensin‐II‐forming  activity  in  infarcted  and 

non‐infarcted human myocardium. Cardiology 94, 247‐253. 

Ishiyama, Y., Gallagher, P.E., Averill, D.B., Tallant, E.A., Brosnihan, K.B., and Ferrario, 

C.M.  (2004).  Upregulation  of  angiotensin‐converting  enzyme  2  after  myocardial 

infarction by blockade of angiotensin II receptors. Hypertension 43, 970‐976. 

Iwata, M., Cowling, R.T., Gurantz, D., Moore, C., Zhang, S., Yuan,  J.X., and Greenberg, 

B.H.  (2005). Angiotensin‐(1‐7) binds  to specific receptors on cardiac  fibroblasts  to 

initiate  antifibrotic  and  antitrophic  effects.  Am.  J.  Physiol  Heart  Circ.  Physiol  289, 

H2356‐H2363. 

Kalinyak, J.E. and Perlman, A.J. (1987). Tissue‐specific regulation of angiotensinogen 

mRNA accumulation by dexamethasone. J. Biol. Chem. 262, 460‐464. 

Kass, R.S.  and Blair, M.L.  (1981). Effects of angiotensin  II on membrane current  in 

cardiac Purkinje fibers. J. Mol. Cell Cardiol. 13, 797‐809. 

Kober,  L.,  Torp‐Pedersen,  C.,  Carlsen,  J.E.,  Bagger,  H.,  Eliasen,  P.,  Lyngborg,  K., 

Videbaek,  J.,  Cole,  D.S.,  Auclert,  L.,  and  Pauly,  N.C.  (1995).  A  clinical  trial  of  the 

angiotensin‐converting‐enzyme  inhibitor  trandolapril  in  patients  with  left 

ventricular dysfunction after myocardial infarction. Trandolapril Cardiac Evaluation 

(TRACE) Study Group. N. Engl. J. Med. 333, 1670‐1676. 

23

Kumagai,  H.,  Khosla,  M.,  Ferrario,  C.,  and  Fouad‐Tarazi,  F.M.  (1990).  Biological 

activity  of  angiotensin‐(1‐7)  heptapeptide  in  the  hamster  heart.  Hypertension  15, 

I29‐I33. 

Kunapuli,  S.P.  and Kumar, A.  (1987). Molecular  cloning of human angiotensinogen 

cDNA and evidence for the presence of its mRNA in rat heart. Circ. Res. 60, 786‐790. 

Le,  T.H.  and  Coffman,  T.M.  (2006).  A  new  cardiac  MASTer  switch  for  the  renin‐

angiotensin system. J. Clin. Invest 116, 866‐869. 

Lee,  M.A.,  Bohm,  M.,  Paul,  M.,  and  Ganten,  D.  (1993).  Tissue  renin‐angiotensin 

systems. Their role in cardiovascular disease. Circulation 87, IV7‐13. 

Levine,  T.B.  and  Levine,  A.B.  (2005).  Clinical  update:  the  role  of  angiotensin  II 

receptor  blockers  in  patients with  left  ventricular  dysfunction  (Part  II  of  II).  Clin. 

Cardiol. 28, 277‐280. 

Li,  P.,  Chappell, M.C.,  Ferrario,  C.M.,  and Brosnihan, K.B.  (1997). Angiotensin‐(1‐7) 

augments  bradykinin‐induced  vasodilation  by  competing  with  ACE  and  releasing 

nitric oxide. Hypertension 29, 394‐400. 

Linardi,  A.,  Panunto,  P.C.,  Ferro,  E.S.,  and Hyslop,  S.  (2004).  Peptidase  activities  in 

rats  treated  chronically  with  N(omega)‐nitro‐L‐arginine  methyl  ester  (L‐NAME). 

Biochem. Pharmacol. 68, 205‐214. 

24

Loot, A.E., Roks, A.J., Henning, R.H., Tio, R.A., Suurmeijer, A.J., Boomsma, F., and van 

Gilst,  W.H.  (2002).  Angiotensin‐(1‐7)  attenuates  the  development  of  heart  failure 

after myocardial infarction in rats. Circulation 105, 1548‐1550. 

Mackins, C.J., Kano, S., Seyedi, N., Schafer, U., Reid, A.C., Machida, T., Silver, R.B., and 

Levi,  R.  (2006).  Cardiac  mast  cell‐derived  renin  promotes  local  angiotensin 

formation, norepinephrine release, and arrhythmias in ischemia/reperfusion. J. Clin. 

Invest 116, 1063‐1070. 

Miyazaki,  M.,  Takai,  S.,  Jin,  D.,  and  Muramatsu,  M.  (2006).  Pathological  roles  of 

angiotensin II produced by mast cell chymase and the effects of chymase inhibition 

in animal models. Pharmacol. Ther. 112, 668‐676. 

Nakajima, M., Hutchinson, H.G., Fujinaga, M., Hayashida, W., Morishita, R., Zhang, L., 

Horiuchi,  M.,  Pratt,  R.E.,  and  Dzau,  V.J.  (1995).  The  angiotensin  II  type  2  (AT2) 

receptor antagonizes the growth effects of the AT1 receptor: gain‐of‐function study 

using gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 10663‐10667. 

Neri Serneri, G.G., Boddi, M., Modesti, P.A., Coppo, M., Cecioni,  I., Toscano, T., Papa, 

M.L.,  Bandinelli,  M.,  Lisi,  G.F.,  and  Chiavarelli,  M.  (2004).  Cardiac  angiotensin  II 

participates  in  coronary  microvessel  inflammation  of  unstable  angina  and 

strengthens the immunomediated component. Circ. Res. 94, 1630‐1637. 

Neves,  L.A.,  Averill,  D.B.,  Ferrario,  C.M.,  Chappell, M.C.,  Aschner,  J.L., Walkup, M.P., 

and Brosnihan, K.B. (2003). Characterization of angiotensin‐(1‐7) receptor subtype 

in mesenteric arteries. Peptides 24, 455‐462. 

25

Nguyen,  G.  and  Burckle,  C.A.  (2004).  [The  (pro)renin  receptor:  biology  and 

functional significance]. Bull. Acad. Natl. Med. 188, 621‐628. 

Nguyen,  G.,  Burckle,  C.A.,  and  Sraer,  J.D.  (2004).  Renin/prorenin‐receptor 

biochemistry and functional significance. Curr. Hypertens. Rep. 6, 129‐132. 

Nguyen,  G.,  Delarue,  F.,  Burckle,  C.,  Bouzhir,  L.,  Giller,  T.,  and  Sraer,  J.D.  (2002). 

Pivotal role of the renin/prorenin receptor in angiotensin II production and cellular 

responses to renin. J. Clin. Invest 109, 1417‐1427. 

Oliveira, M.A.,  Fortes,  Z.B.,  Santos,  R.A.,  Kosla, M.C.,  and  de  Carvalho, M.H.  (1999). 

Synergistic  effect  of  angiotensin‐(1‐7)  on  bradykinin  arteriolar  dilation  in  vivo. 

Peptides 20, 1195‐1201. 

Paul, M.,  Poyan, M.A.,  and Kreutz,  R.  (2006).  Physiology  of  local  renin‐angiotensin 

systems. Physiol Rev. 86, 747‐803. 

Peach, M.J. (1981). Molecular actions of angiotensin. Biochem. Pharmacol. 30, 2745‐

2751. 

Pfeffer, M.A., McMurray,  J.J.,  Velazquez,  E.J.,  Rouleau,  J.L.,  Kober,  L., Maggioni,  A.P., 

Solomon,  S.D.,  Swedberg,  K.,  Van  de,  W.F.,  White,  H.,  Leimberger,  J.D.,  Henis,  M., 

Edwards,  S.,  Zelenkofske,  S.,  Sellers,  M.A.,  and  Califf,  R.M.  (2003).  Valsartan, 

captopril,  or  both  in  myocardial  infarction  complicated  by  heart  failure,  left 

ventricular dysfunction, or both. N. Engl. J. Med. 349, 1893‐1906. 

26

Porsti,  I.,  Bara,  A.T.,  Busse,  R.,  and  Hecker,  M.  (1994).  Release  of  nitric  oxide  by 

angiotensin‐(1‐7)  from  porcine  coronary  endothelium:  implications  for  a  novel 

angiotensin receptor. Br. J. Pharmacol. 111, 652‐654. 

Re,  R.N.  (2004).  Mechanisms  of  disease:  local  renin‐angiotensin‐aldosterone 

systems  and  the  pathogenesis  and  treatment  of  cardiovascular  disease.  Nat.  Clin. 

Pract. Cardiovasc. Med. 1, 42‐47. 

Reid,  A.C.,  Silver,  R.B.,  and  Levi,  R.  (2007).  Renin:  at  the  heart  of  the  mast  cell. 

Immunol. Rev. 217, 123‐140. 

Ren, Y., Garvin, J.L., and Carretero, O.A. (2002). Vasodilator action of angiotensin‐(1‐

7) on isolated rabbit afferent arterioles. Hypertension 39, 799‐802. 

Robertson, A.L.,  Jr. and Khairallah, P.A.  (1971). Angiotensin II: rapid  localization  in 

nuclei of smooth and cardiac muscle. Science 172, 1138‐1139. 

Sadoshima,  J.,  Qiu,  Z., Morgan,  J.P.,  and  Izumo,  S.  (1995).  Angiotensin  II  and  other 

hypertrophic  stimuli  mediated  by  G  protein‐coupled  receptors  activate  tyrosine 

kinase, mitogen‐activated protein kinase, and 90‐kD S6 kinase in cardiac myocytes. 

The critical role of Ca(2+)‐dependent signaling. Circ. Res. 76, 1‐15. 

Sampaio,  W.O.,  Nascimento,  A.A.,  and  Santos,  R.A.  (2003).  Systemic  and  regional 

hemodynamic effects of angiotensin‐(1‐7) in rats. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol 

284, H1985‐H1994. 

27

Santos,  R.A.,  Brum,  J.M.,  Brosnihan,  K.B.,  and  Ferrario,  C.M.  (1990).  The  renin‐

angiotensin  system  during  acute  myocardial  ischemia  in  dogs.  Hypertension  15, 

I121‐I127. 

Santos, R.A., Castro, C.H., Gava, E., Pinheiro, S.V., Almeida, A.P., Paula, R.D., Cruz, J.S., 

Ramos,  A.S.,  Rosa,  K.T.,  Irigoyen,  M.C.,  Bader,  M.,  Alenina,  N.,  Kitten,  G.T.,  and 

Ferreira,  A.J.  (2006).  Impairment  of  in  vitro  and  in  vivo  heart  function  in 

angiotensin‐(1‐7) receptor MAS knockout mice. Hypertension 47, 996‐1002. 

Santos, R.A., Simoes e Silva AC, Maric, C., Silva, D.M., Machado, R.P., de, B., I, Heringer‐

Walther,  S.,  Pinheiro,  S.V.,  Lopes,  M.T.,  Bader,  M.,  Mendes,  E.P.,  Lemos,  V.S., 

Campagnole‐Santos,  M.J.,  Schultheiss,  H.P.,  Speth,  R.,  and  Walther,  T.  (2003). 

Angiotensin‐(1‐7) is an endogenous ligand for the G protein‐coupled receptor Mas. 

Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 100, 8258‐8263. 

Sawa, H.,  Tokuchi,  F., Mochizuki, N.,  Endo,  Y.,  Furuta,  Y.,  Shinohara,  T.,  Takada,  A., 

Kawaguchi,  H.,  Yasuda,  H.,  and  Nagashima,  K.  (1992).  Expression  of  the 

angiotensinogen gene and localization of its protein in the human heart. Circulation 

86, 138‐146. 

Schaefer, U., Kurz, T., Bonnemeier, H., Dendorfer, A., Hartmann, F., Schunkert, H., and 

Richardt,  G.  (2007).  Intracoronary  enalaprilat  during  angioplasty  for  acute 

myocardial infarction: alleviation of postischaemic neurohumoral and inflammatory 

stress? J. Intern. Med. 261, 188‐200. 

28

Schorb,  W.,  Conrad,  K.M.,  Singer,  H.A.,  Dostal,  D.E.,  and  Baker,  K.M.  (1995). 

Angiotensin II  is a potent stimulator of MAP‐kinase activity  in neonatal rat cardiac 

fibroblasts. J. Mol. Cell Cardiol. 27, 1151‐1160. 

Strawn,  W.B.,  Ferrario,  C.M.,  and  Tallant,  E.A.  (1999).  Angiotensin‐(1‐7)  reduces 

smooth muscle growth after vascular injury. Hypertension 33, 207‐211. 

Tallant, E.A. and Clark, M.A. (2003). Molecular mechanisms of inhibition of vascular 

growth by angiotensin‐(1‐7). Hypertension 42, 574‐579. 

Tallant,  E.A.,  Ferrario,  C.M.,  and  Gallagher,  P.E.  (2005).  Angiotensin‐(1‐7)  inhibits 

growth of  cardiac myocytes  through activation of  the mas  receptor. Am.  J. Physiol 

Heart Circ. Physiol 289, H1560‐H1566. 

Trask, A.J., Averill, D.B., Ganten, D., Chappell, M.C., and Ferrario, C.M. (2007). Primary 

role of angiotensin‐converting enzyme‐2 in cardiac production of angiotensin‐(1‐7) 

in transgenic Ren‐2 hypertensive rats. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol 292, H3019‐

H3024. 

Trask,  A.J.  and  Ferrario,  C.M.  (2007).  Angiotensin‐(1‐7):  pharmacology  and  new 

perspectives in cardiovascular treatments. Cardiovasc. Drug Rev. 25, 162‐174. 

Urata,  H.,  Kinoshita,  A.,  Misono,  K.S.,  Bumpus,  F.M.,  and  Husain,  A.  (1990). 

Identification  of  a  highly  specific  chymase  as  the  major  angiotensin  II‐forming 

enzyme in the human heart. J. Biol. Chem. 265, 22348‐22357. 

29

van  Kats,  J.P.,  de  Lannoy,  L.M.,  Jan  Danser,  A.H.,  van,  M.,  Jr.,  Verdouw,  P.D.,  and 

Schalekamp,  M.A.  (1997).  Angiotensin  II  type  1  (AT1)  receptor‐mediated 

accumulation  of  angiotensin  II  in  tissues  and  its  intracellular  half‐life  in  vivo. 

Hypertension 30, 42‐49. 

Villarreal,  F.J.,  Kim,  N.N.,  Ungab,  G.D.,  Printz,  M.P.,  and  Dillmann,  W.H.  (1993). 

Identification  of  functional  angiotensin  II  receptors  on  rat  cardiac  fibroblasts. 

Circulation 88, 2849‐2861. 

Voors, A.A.  and van Veldhuisen, D.J.  (2005).  Pharmacological  treatment  of  chronic 

heart failure according to the 2005 guidelines of the European Society of Cardiology. 

Minerva Cardioangiol. 53, 233‐239. 

Welches,  W.R.,  Brosnihan,  K.B.,  and  Ferrario,  C.M.  (1993).  A  comparison  of  the 

properties  and  enzymatic  activities  of  three  angiotensin  processing  enzymes: 

angiotensin  converting  enzyme,  prolyl  endopeptidase  and  neutral  endopeptidase 

24.11. Life Sci. 52, 1461‐1480. 

Xiao, H.D. and Bernstein, K.E. (2005). Mast cells: the missing source of cardiac renin? 

Mol. Interv. 5, 11‐14. 

Yamada,  T.,  Akishita,  M.,  Pollman,  M.J.,  Gibbons,  G.H.,  Dzau,  V.J.,  and  Horiuchi,  M. 

(1998).  Angiotensin  II  type  2  receptor  mediates  vascular  smooth  muscle  cell 

apoptosis  and  antagonizes  angiotensin  II  type  1  receptor  action:  an  in  vitro  gene 

transfer study. Life Sci. 63, L289‐L295. 

30

Yamamoto,  K.,  Chappell,  M.C.,  Brosnihan,  K.B.,  and  Ferrario,  C.M.  (1992).  In  vivo 

metabolism  of  angiotensin  I  by  neutral  endopeptidase  (EC  3.4.24.11)  in 

spontaneously hypertensive rats. Hypertension 19, 692‐696. 

Yamazaki, T., Komuro, I., Kudoh, S., Zou, Y., Shiojima, I., Mizuno, T., Takano, H., Hiroi, 

Y., Ueki, K., Tobe, K., and . (1995). Angiotensin II partly mediates mechanical stress‐

induced cardiac hypertrophy. Circ. Res. 77, 258‐265. 

Young,  J.B.,  Dunlap,  M.E.,  Pfeffer,  M.A.,  Probstfield,  J.L.,  Cohen‐Solal,  A.,  Dietz,  R., 

Granger,  C.B.,  Hradec,  J.,  Kuch,  J.,  McKelvie,  R.S.,  McMurray,  J.J.,  Michelson,  E.L., 

Olofsson, B., Ostergren, J., Held, P., Solomon, S.D., Yusuf, S., and Swedberg, K. (2004). 

Mortality and morbidity reduction with Candesartan in patients with chronic heart 

failure  and  left  ventricular  systolic  dysfunction:  results  of  the  CHARM  low‐left 

ventricular ejection fraction trials. Circulation 110, 2618‐2626. 

Zhang,  C.,  Knudson,  J.D.,  Setty,  S.,  Araiza,  A.,  Dincer,  U.D.,  Kuo,  L.,  and  Tune,  J.D. 

(2005).  Coronary  arteriolar  vasoconstriction  to  angiotensin  II  is  augmented  in 

prediabetic metabolic syndrome via activation of AT1 receptors. Am. J. Physiol Heart 

Circ. Physiol 288, H2154‐H2162. 

Zisman, L.S., Keller, R.S., Weaver, B., Lin, Q., Speth, R., Bristow, M.R., and Canver, C.C. 

(2003a).  Increased  angiotensin‐(1‐7)‐forming  activity  in  failing  human  heart 

ventricles:  evidence  for  upregulation  of  the  angiotensin‐converting  enzyme 

Homologue ACE2. Circulation 108, 1707‐1712. 

31

Zisman, L.S., Meixell, G.E., Bristow, M.R., and Canver, C.C. (2003b). Angiotensin‐(1‐7) 

formation  in  the  intact  human  heart:  in  vivo  dependence  on  angiotensin  II  as 

substrate. Circulation 108, 1679‐1681. 

  

 

 

32

Figure  I.1.    Current  view of  the  cardiac  renin  angiotensin  system enzymes 

and  peptides.    Abbreviations  used  are:  ACE,  angiotensin  converting  enzyme  (EC 

3.4.15.1); ACE2,  angiotensin  converting  enzyme 2; NEP,  neprilysin  (EC  3.4.24.11); 

POP, prolyl oligopeptidase (EC 3.4.21.26); TOP, thimet oligopeptidase (EC 3.4.24.15) 

controlling  angiotensin‐(1‐7)  [Ang‐(1‐7)]  production  from  angiotensin  I  or 

angiotensin  II;  Angiotensin  receptors  are  the  AT1‐R,  the  AT2‐R,  and  the  mas‐R.  

Adapted from Trask and Ferrario (Trask and Ferrario, 2007). 

33

 

FIGURE I.1 

 

 

34

Figure I.2.   The two possible sources of the cardiac RAS are shown.   Ang II 

and/or  renin  may  be  uptaken  from  the  coronary  circulation,  or  renin  and  the 

precursor angiotensin protein, angiotensinogen (aogen), may be synthesized in the 

nuclei  of  cardiac  cells.    These  two  sources  of  RAS  components  likely  interact  via 

endocrine,  paracrine,  autocrine,  and  even  intracrine  mechanisms  to  produce  and 

regulate the bioactive peptides of the RAS, Ang II and Ang‐(1‐7). 

 

 

 

 

 

35

 

FIGURE I.2 

36

CHAPTER II  

ANGIOTENSIN­(1­7): PHARMACOLOGY & NEW PERSPECTIVES IN CARDIOVASCULAR TREATMENTS 

 Aaron J. Trask and Carlos M. Ferrario 

  

H  D  ypertension and Vascular Research Centerepart cologyWake icine 

 

ment of Physiology and Pharma Forest Universi y School of MedWinston‐Salem, North Carolina 

t

  

 [This  chapter was published  in Cardiovascular Drug Reviews  (2007; 25:162­174.) and  is reprinted with permission.   Differences  in  formatting reflect the equirements of  the  journal.   Aaron  J. Trask prepared  the manuscript, while r. Carlos M. Ferrario acted in an editorial and advisory capacity.] 

rD                       

37

II.1  ABSTRACT 

  Many advances have been made in the cardiovascular field in the past several 

decades.    Among  them  is  the  progress  completed  to  date  on  the  heptapeptide 

member of the renin‐angiotensin system (RAS), angiotensin‐(1‐7) [Ang‐(1‐7)].  The 

peptide’s  beneficial  actions  against  pathophysiological  processes  such  as  cardiac 

arrhythmia,  heart  failure,  hypertension,  renal  disease,  preeclampsia,  and  even 

cancer  are  continuously  being  uncovered.    This  review  encompasses  the 

pharmacology  of  Ang‐(1‐7)  and  expounds  upon  the  peptide’s  potential  as  a 

therapeutic  agent  against  pathological  processes  both  within  and  outside  the 

ardiovascular continuum.  c

  

Key Words: Angiotensin‐(1‐7), Hypertension, Cardiac Hypertrophy, Heart Failure, Cardiac Arrhythmia, Cancer  

 

38

II.2  INTRODUCTION 

Over the past several decades, many advances have been made regarding the 

contribution  of  the  renin‐angiotensin  system  (RAS)  in  cardiovascular  regulation.  

The  formation  of  the  biologically  active  octapeptide,  angiotensin  II  (Ang  II)  from 

angiotensin  I  (Ang  I)  has  been  a  significant  topic  of  research,  and  this  has  led  to 

some of the most important treatments in cardiovascular pathologies.  For example, 

current therapies for hypertension and heart failure include blocking the synthesis 

and/or  actions of Ang  II  using  angiotensin  converting  enzyme  (ACE)  inhibitors  or 

angiotensin  receptor  blockers  (ARBs),  respectively.    Undoubtedly,  the  blockade  of 

this biologically active peptide has proven very beneficial and has  likely  increased 

not only  the quality of  life  for patients, but also  their  lifespan  (2000; Dahlof et al., 

2002).  More recently, the discovery of angiotensin‐(1‐7) [Ang‐(1‐7), Figure II.1] by 

our  laboratory  in  1988  (Schiavone  et  al.,  1988)  and  the  cloning  of  angiotensin 

converting  enzyme  2  (ACE2)  in  2000  (Donoghue  et  al.,  2000)  have  led  to  a  new 

perception of the intrinsic mechanisms through which the renin angiotensin system 

regulates  homeostasis.    Ang‐(1‐7)  is  a  downstream  heptapeptide  product  of  the 

system that can regulate blood pressure (Benter et al., 1995b; Ferrario et al., 2005), 

cardiac function, and cell growth (Tallant et al., 2005).   

Ang  II  and  Ang‐(1‐7)  exhibit  counterregulatory  effects  in  the  systemic 

circulation,  as well  as  in  tissues  important  in  cardiovascular  regulation.    It  is well 

documented that Ang II promotes cell proliferation (Daemen et al., 1991; Su et al., 

1998)  and  vasoconstriction  (Wackenfors  et  al.,  2004),  whereas  Ang‐(1‐7)  has 

antiproliferative  actions  on  cardiac  myocytes  (Tallant  et  al.,  2005)  and  vascular 

39

smooth muscle  (Strawn  et  al.,  1999),  and  is  a  vasodilator  (Ferrario  et  al.,  2005).  

These actions have uncovered a new way to think about the RAS, both conceptually 

and  therapeutically.    Indeed,  a  balance  of  the  two  peptides  may  be  required  to 

circumvent many  cardiovascular  processes.    Both ACE2  and  prolyl  oligopeptidase 

(POP), since they mediate the direct conversion of Ang II into Ang‐(1‐7), may work 

to regulate and balance the levels of the two peptides (Figure II.2).  Throughout the 

history of medicine and pharmacology,  few therapeutic possibilities have emerged 

that  have  the potential  to  truly  change  the  face of  a  disease without  the negative, 

compliance‐compromising side effects.   The heptapeptide Ang‐(1‐7) may very well 

in the near future join those few such drugs in that quest and it emanates from our 

own  bodies.    First  discovered  by  our  laboratory  in  1988  (Schiavone  et  al.,  1988), 

ng‐(1‐7) has been the focus of much current research in the cardiovascular field.   A

 

II.3  ANGIOTENSIN­(1­7)­FORMING ENZYMES 

  Three known enzymes can regulate the formation of Ang‐(1‐7) from Ang I, as 

reviewed by Ferrario et al.  (Ferrario et al., 1998a).   They  include neprilysin 24.11 

(NEP),  thimet  oligopeptidase  24.15  (TOP),  and  prolyl  oligopeptidase  21.26  (POP).  

Moreover,  two  known enzymes  are  known  to  cleave Ang  II  into Ang‐(1‐7)  –  POP, 

and the newly discovered angiotensin converting enzyme 2 (ACE2).  These enzymes 

will be briefly reviewed here.   

Neprilysin 24.11 

  In 1992, studies from our laboratory determined that angiotensin I serves as 

a substrate for the enzyme neprilysin (NEP), which produces Ang‐(1‐7) (Yamamoto 

40

et al., 1992).  Recent studies confirmed that NEP can metabolize Ang I directly into 

Ang‐(1‐7), and furthermore, NEP can act upon Ang II to yield Ang‐(1‐4) and Ang‐(3‐

4),  but not Ang‐(1‐7)  in  sheep  renal  proximal  tubular membranes  (Shaltout  et  al., 

2007).   

T  Oligopeptidase 24.15himet  

  In  a  study  completed  by  our  group,  we  showed  that  Ang‐(1‐7)  could  be 

formed directly from Ang I in the rat hindlimb, which was completely abolished with 

the addition of an inhibitor specific to thimet oligopeptidase (Chappell et al., 2000).  

The Ang‐(1‐7) formation from Ang I was reduced by NEP inhibition, but it was not 

completely  abolished.    These  data  confirm  the  ability  of  thimet  oligopeptidase  to 

generate Ang‐(1‐7) from Ang I.  

Prolyl Oligopeptidase 21.26 

In 1971, Walter et al. (Walter et al., 1971) discovered an enzyme found in the 

human uterus  that  cleaved oxytocin  at  the  carboxy‐terminal proline‐leucine bond.  

Thus, the enzyme was named post‐proline cleaving enzyme for its action.  Since its 

discovery, the enzyme was renamed prolyl oligopeptidase 21.26 (POP).   Koida and 

Walter    (Koida  and Walter,  1976)  discovered  that  this  enzyme  cleaved  the  post‐

proline bond of not only oxytocin and bradykinin, but also Ang II, yielding Ang‐(1‐7).  

Later, studies from our laboratory showed that POP can utilize the substrate Ang I to 

yield Ang‐(1‐7) in spontaneously hypertensive rats (SHR) (Yamamoto et al., 1992).  

Kato and colleagues (Kato et al., 1980) investigated the tissue and brain distribution 

of POP and found that POP activity was found in all tissues measured, including, but 

not limited to the heart, kidney, lung. 

41

Angiotensin Converting Enzyme 2 

A  reinterpretation  of  the  classical  view  of  the  RAS  gained  favor  with  the 

cloning  of  ACE2  in  2000  (Donoghue  et  al.,  2000).    ACE2  shares  42%  sequence 

identity  to  the  catalytic  domain  of  ACE  (Towler  et  al.,  2004;  Vickers  et  al.,  2002); 

however it is insensitive to ACE inhibitors.  ACE2 mediates the conversion of Ang I 

to angiotensin‐(1‐9) [Ang‐(1‐9)] — which can be metabolized into Ang‐(1‐7) by ACE 

— as well as the conversion of Ang II into Ang‐(1‐7); however, ACE2 shows a >400‐

fold substrate preference for Ang II than for Ang I (Vickers et al., 2002), reinforcing 

the  idea  that  this  enzyme  is  critically  important  in  regulating  the  levels  of 

angiotensin peptides in plasma and tissues.  Lack of the functional presence of ACE2 

resulted  in severe cardiac dysfunction associated with the accumulation of cardiac 

Ang II (Crackower et al., 2002), and Shaltout and colleagues (Shaltout et al., 2007) 

found that ACE2 played a major role in the metabolism of Ang II in the sheep kidney.  

We (Trask et al., 2007) recently reported that ACE2 was responsible for most of the 

Ang‐(1‐7)  formation  from  exogenously‐added  Ang  II  in  isolated  hearts  from 

hypertensive rats, suggesting that ACE2 may serve as a compensatory response to 

cardiac remodeling.  Additionally, overexpression of ACE2 delivered using lentiviral 

methods  resulted  in  the  reversal  of  cardiac  hypertrophy  and  fibrosis  in  rats 

(Huentelman et al., 2005).   

 

I PHARMACOKINETICS 

  Because Ang‐(1‐7) is a short seven amino acid peptide, it can be readily acted 

upon by peptidases,  and  as  such,  it  has  a  short  half  life  (t

I.4 

1/2).    In  a  vital  study by 

42

Yamada et. al.,  (Yamada et al., 1998) the baseline circulating  t1/2 of vehicle‐treated 

Sprague‐Dawley  rats  (SD),  spontaneously  hypertensive  rats  (SHR),  and 

hypertensive  [mRen2]27  transgenic  rats  [Tg(+)]  was  about  10  seconds,  although 

baseline values of the peptide were much higher in the SHR and Tg(+) compared to 

the  normotensive  SD  (377±88  pmol/L,  367±122  pmol/L,  and  137±18  pmol/L, 

respectively).    The  t1/2  values  were  increased  4‐  to  6‐fold  with  ACE  inhibitor 

(lisinopril)  treatment,  whereas  the  angiotensin  receptor  blocker  (ARB),  losartan, 

had  no  significant  effect.    This  result  was  not  entirely  unexpected  as  ACE  is 

responsible,  at  least  in  part,  for  the  metabolism  of  Ang‐(1‐7)  to  the  inactive 

metabolite, Ang‐(1‐5) (Allred et al., 2000; Chappell et al., 1998; Deddish et al., 1998).  

Thus,  inhibiting  this  pathway  would  effectively  prolong  the  t1/2  of  the  peptide.  

Moreover,  the  plasma  clearance  of  Ang‐(1‐7)  was  6.5  ±  0.9  L  min‐1  kg‐1  in 

normotensive  SD  rats,  whereas  the  plasma  clearance  in  SHR  and  Tg(+)  rats  was 

significantly decreased by 39% and 60%, respectively (SHR, 4.0 ± 0.2 L min‐1 kg‐1; 

Tg(+), 2.6 ± 0.1 L min‐1 kg‐1) (Yamada et al., 1998), suggesting that the plasma Ang‐

(1‐7) is cleared from the body much slower in the two hypertensive strains (Figure 

II.3).    Indeed,  Chappell  and  colleagues  first  found  that Ang‐(1‐7) was metabolized 

into  the  inactive  fragment Ang‐(1‐5) by ACE  in pulmonary  tissues  (Chappell  et al., 

1998).  Moreover, Dr. Chappell’s laboratory later found that ACE was responsible for 

the  breakdown  of  Ang‐(1‐7)  into  the  inactive  metabolite,  Ang‐(1‐5)  in  both 

pulmonary and renal tissues (Allred et al., 2000; Chappell et al., 2001).   

  Indeed,  a  clinical  study  by  Rodgers  and  colleagues  (Rodgers  et  al.,  2006) 

employed increasing subcutaneous doses of Ang‐(1‐7) in human subjects and found 

43

a mean plasma t1/2 of 29 minutes and a mean volume of distribution of 3.71 L/kg.  

The  half  life  reported  in  this  study  is  much  higher  than  that  reported  in  rodent 

models, likely due not only to the use of higher concentrations of the drug, but also 

to  its  being  administered  subcutaneously  as  a  slow‐release  depot,  whereas  the 

rodent studies employed direct  intravenous administration.   Taken together, these 

studies  suggest  that  Ang‐(1‐7)  administered  subcutaneously  may  have  a  long 

enough  t1/2  to  effectively  mediate  prolonged  biological  activity  of  Ang‐(1‐7), 

although the employment of stable analogs of Ang‐(1‐7) may yield a more favorable 

harmacologic profile.   p

 

II.5  PHARMACODYNAMICS 

  The receptor responsible for the observed physiological actions of Ang‐(1‐7) 

was  not  known  for  some  time.    However,  studies  by  Tallant  et  al.  (Tallant  et  al., 

1997) showed that Ang‐(1‐7) bound a non‐AT1, non‐AT2 receptor with high affinity, 

which was completely blocked by the addition of the Ang‐(1‐7) antagonist, D‐Ala7‐

Ang‐(1‐7).  It was recently discovered that the orphaned mas oncogene bound Ang‐

(1‐7)  with  high‐affinity  (Santos  et  al.,  2003).    This  G‐protein‐coupled  receptor 

mediates the current known actions of Ang‐(1‐7), as most of them can be blocked by 

its specific  inhibitor, D‐Ala7‐Ang‐(1‐7).   Activation of  the mas receptor  triggers the 

stimulation of the G‐protein, Gαq, which results in release of nitric oxide (NO) from 

the  vascular  endothelium  to mediate  vasodilation.    Ang‐(1‐7)  administration  also 

decreased the thymidine incorporation in vascular smooth muscle cells (Freeman et 

al., 1996; Tallant and Clark, 2003), resulting in a reduction in cellular proliferation 

44

and  growth.    This  mechanism  was  likely  due  to  the  receptor’s  ability  to  release 

prostaglandins.   Moreover, Ang‐(1‐7)  inhibits  cardiac myocyte  growth, which was 

mediated by the mas receptor (Tallant et al., 2005).  Indeed, mice in which the mas 

protein was genetically inactivated exhibit marked cardiac dysfunction (Castro et al., 

2006; Santos et al., 2006).   

  Although many of the effects of Ang‐(1‐7) can be at least partially attributed 

to  activation  of  the mas  receptor,  Silva  et  al.  (Silva  et  al.,  2006)  recently  reported 

another Ang‐(1‐7)  receptor  that was  sensitive  to  the Ang‐(1‐7)  antagonist D‐Pro7‐

Ang‐(1‐7), but not to another antagonist, D‐Ala7‐Ang‐(1‐7) in aortas from Sprague‐

Dawley  rats.    There  is  some  bit  of  discrepancy  in  this  report  as  the  authors  have 

previously reported that both Ang‐(1‐7) antagonists block the vasodilatory effect in 

the  mouse  aorta  (Santos  et  al.,  2003).    This  adds  yet  another  dimension  to  the 

evolution  of  the  complexity  of  the  RAS  that  needs  to  be  fully  investigated.    Two 

major questions that need to be addressed are: (1) are the reported effects thus far 

on Ang‐(1‐7) due to the activation of the mas receptor, and (2) are the current Ang‐

(1‐7) antagonists solely specific to the mas receptor?   Binding studies showed that 

Ang‐(1‐7) binds the mas receptor, which was completely blocked with the addition 

of  D‐Ala7‐Ang‐(1‐7)  (Tallant  et  al.,  1997).    Therefore,  it  is  known  that  Ang‐(1‐7) 

binds  the mas  receptor  and  is  a  least  partially  responsible  for  the  physiological 

effects  reported  on  Ang‐(1‐7),  but  given  the  current  data  on  interactions  of  the 

different angiotensin receptors (Castro et al., 2005; Kostenis et al., 2005), we do not 

even come close to understanding the roles of  the angiotensin receptor types as  it 

pertains  to  their physiological  actions and/or  interactions.   The  role of  this newly 

45

reported Ang‐(1‐7) receptor remains to be elucidated, and its functional significance 

may bring scientists to a better understanding of how the system functions not only 

within itself, but also with other endogenous physiological systems. 

Physiological Actions of Ang­(1­7) on the Heart 

  One of  the  first  studies  to address whether  the heart had  the machinery  to 

synthesize Ang‐(1‐7)  in vivo was done by Wei and colleagues  (Wei et al., 2002)  in 

the dog heart interstitium.  These authors found that Ang‐(1‐7) could be generated 

from  Ang  I,  an  effect  not  blocked  by  the  administration  of  either  an  AT1  or  AT2 

receptor  blocker.    Zisman  (Zisman  et  al.,  2003b)  later  confirmed  that  Ang‐(1‐7) 

could be generated in the human heart from Ang II.   Indeed, Averill and colleagues 

(Averill  et  al.,  2003)  found  augmented  expression  of  Ang‐(1‐7)  in  response  to 

coronary  artery  ligation  in  rat  cardiomyocytes,  but  not  cardiac  fibroblasts.  

Moreover,  several  studies  found  that  Ang‐(1‐7)  improves  cardiac  function  in 

response to ischemia/reperfusion.  In two separate studies, Ferreira and colleagues 

(Ferreira  et  al.,  2001;  Ferreira  et  al.,  2002)  found  that  Ang‐(1‐7)  was  protective 

against  both  ischemia‐induced  cardiac  functional  impairments  and  ischemia‐

induced cardiac arrhythmias in isolated rat hearts.  De Mello (De Mello, 2004) later 

reported  that  Ang‐(1‐7)  exerted  its  antiarrhythmic  effects  via  activation  of  the 

sodium pump.  More recently, Ang‐(1‐7) administration caused an improved cardiac 

function  recovery  after  40  minutes  of  ischemia  in  isolated  hearts  from  SHR  rats 

reatedt  with the nitric oxide synthase inhibitor, L‐NAME (Benter et al., 2006).   

  Ang‐(1‐7) also has cardioprotective effects against heart  failure and cardiac 

hypertrophy.    Indeed,  chronic  Ang‐(1‐7)  treatment  not  only  attenuated  the 

46

development of heart failure in response to coronary artery ligation in rats (Loot et 

al., 2002), but it also reversed cardiac hypertrophy and fibrosis in rats (Grobe et al., 

2006a; Grobe et al., 2006b; Iwata et al., 2005; Tallant et al., 2005; Wang et al., 2005).  

Ishiyama  et  al.  found  that  heart  failure  induced  by  coronary  artery  ligation  was 

associated with an increase in plasma Ang‐(1‐7) levels, which was augmented with 

the administration of the AT1 receptor blockers losartan and olmesartan (Ishiyama 

et  al.,  2004).    The  AT1‐receptor  blockade was  associated with  an  upregulation  of 

cardiac  ACE2,  suggesting  that  the  increased  Ang‐(1‐7)  levels  may  be  due  to 

increased  ACE2.    Likewise,  cardiac  Ang‐(1‐7)  formation  was  also  increased  in 

human  heart  failure when  compared  to  non‐failing  hearts  (Zisman  et  al.,  2003a).  

Taken together,  these studies  indicate that Ang‐(1‐7) exerts positive effects on the 

heart,  through  both  the  reduction  in  cardiac  remodeling,  and  the  correction  of 

cardiac arrhythmias.   

Physiological Actions of Ang­(1­7) on the Kidney   

  Several  studies  over  the  past  15  years  showed  that  Ang‐(1‐7)  affects  the 

ways  in  which  the  kidney  handles  water/sodium  balance.    Ang‐(1‐7)  produced 

natriuretic  and  diuretic  effects  on  the  kidney,  with  corresponding  increases  in 

glomerular filtration rate (GFR) (DelliPizzi et al., 1994; Heller et al., 2000; Vallon et 

al.,  1998),  which was  explained  by  inhibition  of  the  Na+‐K+‐ATPase  (Handa  et  al., 

1996).   These effects were not dependent upon the AT1 or AT2 receptors, but they 

were  attenuated  by  the  Ang‐(1‐7)  antagonist,  D‐Ala7‐Ang‐(1‐7),  suggesting 

involvement  of  the mas  receptor.    Interestingly,  Ang‐(1‐7)  attenuated  the  sodium 

reabsorption caused by Ang II infusion, but the heptapeptide did not affect the Ang 

47

II‐mediated decrease in GFR (Burgelova et al., 2002).  Clark et al. (Clark et al., 2003) 

later showed that this may be caused by the ability of Ang‐(1‐7) to reduce renal Ang 

II receptors.  Intrarenal Ang‐(1‐7) blockade caused a decrease in GFR, renal plasma 

flow,  and  sodium  excretion  in  one‐kidney,  one‐clip  hypertension,  as  well  as  salt‐

depleted  Sprague‐Dawley  and  [mRen2]27  transgenic  rats,  but  it  had  no  effect  in 

salt‐replete or Ang II‐infused rats (Burgelova et al., 2005).  These data suggest that 

Ang‐(1‐7)  only  exerts  counterregulatory  actions  on  the  kidney  in  response  to  the 

activation  of  the  RAS.    In  humans,  urinary  Ang‐(1‐7)  was  decreased  in  untreated 

essential  hypertensive  patients  when  compared  to  normal,  healthy  individuals 

(Ferrario  et  al.,  1998b).    Collectively,  these  studies  show  that  Ang‐(1‐7)  exerts 

effects opposite to those of Ang II on the kidney, and that an attenuation of Ang‐(1‐

7) in the kidney may be associate ith human hypertension.   d w

ng­(1A ­7) and Brain Mechanisms      

  Shortly  after  its  discovery  in  the  hypothalamic‐pituitary  explants  in  1988 

(Schiavone et al., 1988), Ang‐(1‐7) was found to be present in brain areas including 

the hypothalamus, medulla oblongata, and amygdala  (Chappell et  al., 1989).   Even 

though Ang‐(1‐7) released vasopressin  from the hypothalamus (Qadri et al., 1998; 

Schiavone et al., 1988), which was not associated with increases in blood pressure 

or  water  intake,  there  was  no  increase  in  the  plasma  level  of  the  antidiuretic 

hormone,  suggesting  that  Ang‐(1‐7)  has  local  effects  on  the  hypothalamus  to 

modulate vasopressin release.   

Since that time, perhaps the most recognized action of Ang‐(1‐7) on the brain 

is  its  alteration  of  the  baroreceptor  reflex  and  neural  control  of  the  homeostatic 

48

blood pressure.  Ang‐(1‐7) also augments the gain of the baroreflex control of heart 

rate  (Benter  et  al.,  1995a;  Campagnole‐Santos  et  al.,  1992;  Oliveira  et  al.,  1996) 

indicating  that  loss  of  the  balance  between Ang  II  and Ang‐(1‐7) may  explain  the 

altered regulation of blood pressure in aging individuals (Sakima et al., 2005).  One 

of  the more unexpected  actions of Ang‐(1‐7) was data published  that  it  enhanced 

long‐term  potentiation  (LTP)  in  the  hippocampus  (Hellner  et  al.,  2005),  which  is 

thought  to be  the process behind  learning and memory.   From the data presented 

herein, it is obvious that Ang‐(1‐7) has far‐reaching actions on the brain — from the 

modulation of vasopressin release to baroreflex function to learning and memory.   

A ­7) and Pregnancyng­(1  

  During normal pregnancy, bioactive components of  the RAS are elevated  in 

the plasma and urine, including Ang‐(1‐7) (Merrill et al., 2002; Valdes et al., 2001), 

and Ang‐(1‐7)  and ACE2  are  both  expressed  in  the  placenta  (Valdes  et  al.,  2006).  

Preeclampsia, a condition that can occur during pregnancy that is characterized by 

high  blood  pressure  and  proteinuria,  can  be  detrimental  to  both  the mother  and 

fetus.    Recent  studies  showed  impairment  in  plasma  Ang‐(1‐7)  levels  during 

preeclamptic  pregnancies  (Merrill  et  al.,  2002),  which  may  be  at  least  partially 

responsible for the etiology behind this condition.  These initial studies in pregnancy 

are in line with what is thought to be impairment in the peptide hormone’s ability to 

vasodilate properly.   

Vascular effects of Ang­(1­7) 

  Evidence that Ang‐(1‐7) was produced in the vasculature was first shown by 

our laboratory 15 years ago (Santos et al., 1992).  It was later shown that Ang‐(1‐7) 

49

produced endothelium‐dependent dilation of the coronary arteries of pigs and dogs, 

which was mediated  by  nitric  oxide  (NO)  and  bradykinin  (Brosnihan  et  al.,  1996; 

Porsti et al., 1994).  This response was independent of AT1 receptors, AT2 receptors, 

and prostaglandins; however ACE inhibition magnified the vasodilatory response of 

Ang‐(1‐7).    To  determine  the  interaction  of  Ang‐(1‐7)  and  NO,  studies  conducted 

from our group confirmed that the vasodilator response was mediated by NO, but it 

was  discovered  that  inhibition  of  nitric  oxide  synthase  in  2‐kidney‐1‐clip  (2K1C) 

hypertension  induced  in  dogs  resulted  in  a  blunted  vasodilatory  response, 

suggesting  that  an  impairment  in  the  nitric  oxide  system may  play  a  role  in  the 

pathology  of  hypertension  (Nakamoto  et  al.,  1995).    Moreover,  Ang‐(1‐7) 

potentiated  the  vasodilatory  effect  of  bradykinin  administered  to  conscious  rats, 

and  this  response  was  significantly  attenuated  by  indomethacin,  suggesting  the 

involvement  of  the  prostaglandins  (Paula  et  al.,  1995).    This  effect  was  later 

confirmed  by  us,  and  we  showed  that  this  effect  of  Ang‐(1‐7)  to  potentiate 

bradykinin‐induced vasodilation was due to the ability of Ang‐(1‐7)  to  inhibit ACE 

activity  and  release  NO  (Li  et  al.,  1997),  thereby  decreasing  the  metabolism  of 

bradykinin  and  further  stimulating  vasodilation.    More  recently,  mas  receptor 

activation  by  Ang‐(1‐7)  improved  endothelial  function  (Faria‐Silva  et  al.,  2005).  

Collectively,  these  data  showed  that  Ang‐(1‐7)  acts  as  a  vasodilator  through  the 

release  of  NO  and  bradykinin,  and  it  may  also  improve  endothelial  function  by 

otentiating the hypotensive effects of acetylcholine.   p

 

 

50

A ­7) and Growthng­(1  

  The first  indication that Ang‐(1‐7) could inhibit growth came  in 1996 when 

Freeman and colleagues  (Freeman et al., 1996)  found  that Ang‐(1‐7)  inhibited  the 

growth  of  vascular  smooth muscle  cells  isolated  from  Sprague‐Dawley  rat  aortas, 

which was  later  found  to be mediated  through  the  release of prostaglandins, with 

prostacyclin being the most likely candidate (Tallant and Clark, 2003).  In a follow‐

up  study  from  our  group,  Ang‐(1‐7)  administered  continuously  for  12  days  after 

carotid artery balloon catheter  injury,  inhibited neointimal  formation compared to 

saline‐infused control rats (Strawn et al., 1999).  Elevated endogenous Ang‐(1‐7) by 

ACE  inhibition  or  angiotensin  receptor  blockade  also  yielded  similar  results.    The 

data from these studies suggests that Ang‐(1‐7) may be a good candidate for drug‐

coated stent development (Langeveld et al., 2005), and that the ACE inhibitors and 

ARBs  already  on  the  market  may  already  be  facilitating  this  process.    This 

suggestion is in keeping with the demonstration of large elevations in plasma Ang‐

(1‐7)  in  normotensive  volunteers  administered  irbesartan  (Schindler,  2007).    In 

addition, Tallant et al. (Tallant et al., 2005) showed that Ang‐(1‐7) also inhibited the 

growth  of  cardiac  myocytes  through  the  activation  of  the  mas  receptor,  which 

further  reinforces  that  Ang‐(1‐7)  may  be  responsible  for  at  least  some  of  the 

beneficial  outcomes  (improved  cardiac  function  and  reduced  ventricular 

remodeling) observed with ACE inhibitor and ARB treatment in heart failure.   

  In a tireless effort to find a magic bullet for the treatment of various types of 

cancers, Ang‐(1‐7) has proven to have high potential as a chemotherapeutic agent.  

Building  upon  the  anti‐trophic  mechanisms  of  Ang‐(1‐7),  Gallagher  and  Tallant 

51

(Gallagher  and Tallant,  2004)  showed  recently  that Ang‐(1‐7)  inhibited  cancerous 

growth  in  several  human  lung  cancer  cell  lines,  which  is  in  keeping  with  the 

peptide’s antiproliferative effects in the cardiovascular system.  Menon et al. (Menon 

et al., 2007) recently showed that these results held true  in vivo because Ang‐(1‐7) 

caused a reduction in the size of lung tumors induced in the flank region of athymic 

mice,  which  was  associated  with  a  reduction  in  cyclooxygenase‐2  (COX‐2).  

Likewise, Pantoja et  al.  (Pantoja et  al.,  2004)  found  that Ang‐(1‐7) exerted  similar 

effects  in  breast  cancer  cells,  possibly  in  part  due  to  inhibition  of  angiogenesis.  

Indeed,  Ang‐(1‐7)  was  examined  in  a  Phase  I/II  clinical  trial  to  determine  its 

effectiveness and optimal dose against chemotherapy‐induced cytopenias in breast 

cancer  patients  (Rodgers  et  al.,  2006).    This  study  found  that  the  heptapeptide 

attenuated  cytopenias  associated  with  chemotherapy  without  any  hematologic 

toxicity.  Collectively, the data on Ang‐(1‐7) and its effects on cancerous growth are 

promising.    Although  still  in  its  infancy,  the  peptide  hormone may  provide  health 

care  providers with  an  alternative  treatment  regimen with  fewer  side  effects  and 

ertainly less toxicity.   c

 

II.6  CONCLUSIONS 

  As indicated in this review, the heptapeptide Ang‐(1‐7) has many beneficial 

effects not only on cardiovascular processes, but also in the treatment of cancer, and 

an elevation in the peptide associated with current ACE inhibitor and ARB therapy 

may  account  for  the  favorable  outcomes  associated with  their  use.    The  potential 

therapeutic implications of Ang‐(1‐7) indicated that it may be used to treat cardiac 

52

hypertrophy, heart failure, hypertension, kidney disease, preeclampsia, and cancer.   

Although  using  the  endogenously‐derived  peptide  for  treatments  may  be  on  the 

horizon, the development of stable Ang‐(1‐7) analogs such as AVE 0991 may prove 

to  be  better  pharmacologic  effectors  of  the  actions  of  Ang‐(1‐7)  (See  Review  by 

Santos and Ferreira, 2006).    In any  case,  the  current data on Ang‐(1‐7)  is  exciting 

and new developments using the peptide are on the horizon.   

 

ACKNOLEDGEMENTS 

  The authors would like to gratefully acknowledge financial support from the 

NIH (HL‐51952), as well as grant support in part provided by Unifi, Inc., Greensboro, 

NC, and Farley‐Hudson Foundation, Jacksonville, NC.   

 

53

REFERENCES 

 (2000) Effects of ramipril on cardiovascular and microvascular outcomes in people 

with diabetes mellitus: results of the HOPE study and MICRO‐HOPE substudy. 

Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. Lancet 355:253‐

259. 

Allred  A.  J.,  Diz,  D.  I.,  Ferrario,  C.  M.,  and  Chappell,  M.  C.  (2000)  Pathways  for 

angiotensin‐(1‐‐‐7) metabolism in pulmonary and renal tissues. Am.J.Physiol 

Renal Physiol 279:F841‐F850. 

Averill  D.  B.,  Ishiyama,  Y.,  Chappell,  M.  C.,  and  Ferrario,  C.  M.  (2003)  Cardiac 

angiotensin‐(1‐7) in ischemic cardiomyopathy. Circulation 108:2141‐2146. 

Benter  I.  F.,  Diz, D.  I.,  and  Ferrario,  C. M.  (1995a) Pressor  and  reflex  sensitivity  is 

altered  in  spontaneously  hypertensive  rats  treated  with  angiotensin‐(1‐7). 

Hypertension 26:1138‐1144. 

Benter  I.  F.,  Ferrario,  C.  M.,  Morris,  M.,  and  Diz,  D.  I.  (1995b)  Antihypertensive 

actions of angiotensin‐(1‐7) in spontaneously hypertensive rats. Am.J.Physiol 

269:H313‐H319. 

Benter I. F., Yousif, M. H., Anim, J. T., Cojocel, C., and Diz, D. I. (2006) Angiotensin‐(1‐

7) prevents development of  severe hypertension  and  end‐organ damage  in 

spontaneously  hypertensive  rats  treated  with  L‐NAME.  Am.J.Physiol  Heart 

Circ.Physiol 290:H684‐H691. 

54

Brosnihan K.  B.,  Li,  P.,  and Ferrario,  C. M.  (1996) Angiotensin‐(1‐7)  dilates  canine 

coronary arteries through kinins and nitric oxide. Hypertension 27:523‐528. 

Burgelova M., Kramer, H. J., Teplan, V., Thumova, M., and Cervenka, L. (2005) Effects 

of  angiotensin‐(1‐7)  blockade  on  renal  function  in  rats  with  enhanced 

intrarenal Ang II activity. Kidney Int. 67:1453‐1461. 

Burgelova M., Kramer, H. J., Teplan, V., Velickova, G., Vitko, S., Heller, J., Maly, J., and 

Cervenka, L. (2002) Intrarenal infusion of angiotensin‐(1‐7) modulates renal 

functional  responses  to  exogenous  angiotensin  II  in  the  rat.  Kidney  Blood 

Press Res. 25:202‐210. 

Campagnole‐Santos M. J., Heringer, S. B., Batista, E. N., Khosla, M. C., and Santos, R. A. 

(1992)  Differential  baroreceptor  reflex  modulation  by  centrally  infused 

angiotensin peptides. Am.J.Physiol 263:R89‐R94. 

Castro C. H.,  Santos,  R.  A.,  Ferreira,  A.  J.,  Bader, M.,  Alenina, N.,  and Almeida, A.  P. 

(2005)  Evidence  for  a  functional  interaction  of  the  angiotensin‐(1‐7) 

receptor Mas with AT1 and AT2 receptors in the mouse heart. Hypertension 

46:937‐942. 

Castro C. H.,  Santos,  R.  A.,  Ferreira,  A.  J.,  Bader, M.,  Alenina, N.,  and Almeida, A.  P. 

(2006)  Effects  of  genetic  deletion  of  angiotensin‐(1‐7)  receptor  Mas  on 

cardiac function during ischemia/reperfusion in the isolated perfused mouse 

heart. Life Sci. 80:264‐268. 

55

Chappell M. C., Allred, A. J., and Ferrario, C. M. (2001) Pathways of angiotensin‐(1‐7) 

metabolism in the kidney. Nephrol.Dial.Transplant. 16 Suppl 1:22‐26. 

Chappell M. C., Brosnihan, K. B., Diz, D. I., and Ferrario, C. M. (1989) Identification of 

angiotensin‐(1‐7)  in  rat  brain.  Evidence  for  differential  processing  of 

angiotensin peptides. J.Biol.Chem. 264:16518‐16523. 

Chappell  M.  C.,  Gomez,  M.  N.,  Pirro,  N.  T.,  and  Ferrario,  C.  M.  (2000)  Release  of 

angiotensin‐(1‐7) from the rat hindlimb: influence of angiotensin‐converting 

enzyme inhibition. Hypertension 35:348‐352. 

Chappell  M.  C.,  Pirro,  N.  T.,  Sykes,  A.,  and  Ferrario,  C.  M.  (1998)  Metabolism  of 

angiotensin‐(1‐7)  by  angiotensin‐converting  enzyme.  Hypertension  31:362‐

367. 

Clark M. A., Tallant, E. A., Tommasi, E., Bosch, S., and Diz, D. I. (2003) Angiotensin‐(1‐

7)  reduces  renal  angiotensin  II  receptors  through  a  cyclooxygenase‐

dependent mechanism. J.Cardiovasc.Pharmacol. 41:276‐283. 

Crackower M. A., Sarao, R., Oudit, G. Y., Yagil, C., Kozieradzki, I., Scanga, S. E., Oliveira‐

dos‐Santos,  A.  J.,  da,  Costa  J.,  Zhang,  L.,  Pei,  Y.,  Scholey,  J.,  Ferrario,  C.  M., 

Manoukian, A. S., Chappell, M. C., Backx, P. H., Yagil, Y.,  and Penninger,  J. M. 

(2002)  Angiotensin‐converting  enzyme  2  is  an  essential  regulator  of  heart 

function. Nature 417:822‐828. 

56

Daemen M. J., Lombardi, D. M., Bosman, F. T., and Schwartz, S. M. (1991) Angiotensin 

II  induces  smooth  muscle  cell  proliferation  in  the  normal  and  injured  rat 

arterial wall. Circ.Res. 68:450‐456. 

Dahlof B., Devereux, R. B., Kjeldsen, S. E., Julius, S., Beevers, G., de, Faire U., Fyhrquist, 

F.,  Ibsen,  H.,  Kristiansson,  K.,  Lederballe‐Pedersen,  O.,  Lindholm,  L.  H., 

Nieminen, M.  S.,  Omvik,  P.,  Oparil,  S.,  and Wedel,  H.  (2002)  Cardiovascular 

morbidity and mortality in the Losartan Intervention For Endpoint reduction 

in  hypertension  study  (LIFE):  a  randomised  trial  against  atenolol.  Lancet 

359:995‐1003. 

De  Mello  W.  C.  (2004)  Angiotensin  (1‐7)  re‐establishes  impulse  conduction  in 

cardiac muscle during ischaemia‐reperfusion. The role of the sodium pump. 

J.Renin.Angiotensin.Aldosterone.Syst. 5:203‐208. 

Deddish P. A., Marcic, B.,  Jackman, H. L., Wang, H. Z., Skidgel, R. A., and Erdos, E. G. 

(1998) N‐domain‐specific substrate and C‐domain inhibitors of angiotensin‐

converting  enzyme:  angiotensin‐(1‐7)  and  keto‐ACE.  Hypertension  31:912‐

917. 

DelliPizzi  A.  M.,  Hilchey,  S.  D.,  and  Bell‐Quilley,  C.  P.  (1994)  Natriuretic  action  of 

angiotensin(1‐7). Br.J.Pharmacol. 111:1‐3. 

Donoghue M., Hsieh, F., Baronas, E., Godbout, K., Gosselin, M., Stagliano, N., Donovan, 

M., Woolf, B., Robison, K., Jeyaseelan, R., Breitbart, R. E., and Acton, S. (2000) 

57

A  novel  angiotensin‐converting  enzyme‐related  carboxypeptidase  (ACE2) 

converts angiotensin I to angiotensin 1‐9. Circ.Res. 87:E1‐E9. 

Faria‐Silva  R.,  Duarte,  F.  V.,  and  Santos,  R.  A.  (2005)  Short‐term  angiotensin(1‐7) 

receptor  MAS  stimulation  improves  endothelial  function  in  normotensive 

rats. Hypertension 46:948‐952. 

Ferrario C. M., Chappell, M. C., Dean, R. H., and Iyer, S. N. (1998a) Novel angiotensin 

peptides  regulate  blood  pressure,  endothelial  function,  and  natriuresis. 

J.Am.Soc Nephrol. 9:1716‐1722. 

Ferrario  C.  M.,  Martell,  N.,  Yunis,  C.,  Flack,  J.  M.,  Chappell,  M.  C.,  Brosnihan,  K.  B., 

Dean, R. H., Fernandez, A., Novikov, S. V., Pinillas, C., and Luque, M. (1998b) 

Characterization  of  angiotensin‐(1‐7)  in  the  urine  of  normal  and  essential 

hypertensive subjects. Am.J.Hypertens. 11:137‐146. 

Ferrario  C.  M.,  Trask,  A.  J.,  and  Jessup,  J.  A.  (2005)  Advances  in  biochemical  and 

functional roles of angiotensin‐converting enzyme 2 and angiotensin‐(1‐7) in 

regulation  of  cardiovascular  function.  Am.J.Physiol  Heart  Circ.Physiol 

289:H2281‐H2290. 

Ferreira  A.  J.,  Santos,  R.  A.,  and  Almeida,  A.  P.  (2001)  Angiotensin‐(1‐7): 

cardioprotective  effect  in  myocardial  ischemia/reperfusion.  Hypertension 

38:665‐668. 

58

Ferreira A. J., Santos, R. A., and Almeida, A. P. (2002) Angiotensin‐(1‐7) improves the 

post‐ischemic  function  in  isolated  perfused  rat  hearts.  Braz.J.Med.Biol.Res. 

35:1083‐1090. 

Freeman E. J., Chisolm, G. M., Ferrario, C. M., and Tallant, E. A. (1996) Angiotensin‐(1‐

7) inhibits vascular smooth muscle cell growth. Hypertension 28:104‐108. 

Gallagher P. E. and Tallant, E. A. (2004) Inhibition of human lung cancer cell growth 

by angiotensin‐(1‐7). Carcinogenesis 25:2045‐2052. 

Grobe J. L., Mecca, A. P., Lingis, M., Shenoy, V., Bolton, T. A., Machado, J. M., Speth, R. 

C.,  Raizada,  M.  K.,  and  Katovich,  M.  (2006a)  Prevention  of  Angiotensin  II‐

Induced  Cardiac  Remodeling  by  Angiotensin‐(1‐7).  Am.J.Physiol  Heart 

Circ.Physiol 

Grobe J. L., Mecca, A. P., Mao, H., and Katovich, M. J. (2006b) Chronic angiotensin‐(1‐

7) prevents cardiac fibrosis in DOCA‐salt model of hypertension. Am.J.Physiol 

Heart Circ.Physiol 290:H2417‐H2423. 

Handa R. K., Ferrario, C. M., and Strandhoy, J. W. (1996) Renal actions of angiotensin‐

(1‐7): in vivo and in vitro studies. Am.J.Physiol 270:F141‐F147. 

Heller  J.,  Kramer,  H.  J.,  Maly,  J.,  Cervenka,  L.,  and  Horacek,  V.  (2000)  Effect  of 

intrarenal  infusion  of  angiotensin‐(1‐7)  in  the  dog. Kidney Blood Press Res. 

23:89‐94. 

59

Hellner  K.,  Walther,  T.,  Schubert,  M.,  and  Albrecht,  D.  (2005)  Angiotensin‐(1‐7) 

enhances  LTP  in  the  hippocampus  through  the  G‐protein‐coupled  receptor 

Mas. Mol.Cell Neurosci 29:427‐435. 

Huentelman M. J., Grobe, J. L., Vazquez, J., Stewart, J. M., Mecca, A. P., Katovich, M. J., 

Ferrario,  C.  M.,  and  Raizada,  M.  K.  (2005)  Protection  from  angiotensin  II‐

induced  cardiac  hypertrophy  and  fibrosis  by  systemic  lentiviral  delivery  of 

ACE2 in rats. Exp.Physiol 90:783‐790. 

Ishiyama  Y.,  Gallagher,  P.  E.,  Averill,  D.  B.,  Tallant,  E.  A.,  Brosnihan,  K.  B.,  and 

Ferrario, C. M. (2004) Upregulation of angiotensin‐converting enzyme 2 after 

myocardial  infarction by blockade of  angiotensin  II  receptors. Hypertension 

43:970‐976. 

Iwata M., Cowling, R. T., Gurantz, D., Moore, C., Zhang, S., Yuan, J. X., and Greenberg, 

B.  H.  (2005)  Angiotensin‐(1‐7)  binds  to  specific  receptors  on  cardiac 

fibroblasts  to  initiate  antifibrotic  and  antitrophic  effects. Am.J.Physiol Heart 

Circ.Physiol 289:H2356‐H2363. 

Kato  T.,  Okada,  M.,  and  Nagatsu,  T.  (1980)  Distribution  of  post‐proline  cleaving 

enzyme in human brain and the peripheral tissues. Mol.Cell Biochem. 32:117‐

121. 

Koida M.  and Walter,  R.  (1976)  Post‐proline  cleaving  enzyme.  Purification  of  this 

endopeptidase by affinity chromatography. J.Biol.Chem. 251:7593‐7599. 

60

Kostenis E., Milligan, G., Christopoulos, A., Sanchez‐Ferrer, C. F., Heringer‐Walther, S., 

Sexton,  P.  M.,  Gembardt,  F.,  Kellett,  E.,  Martini,  L.,  Vanderheyden,  P., 

Schultheiss, H. P., and Walther, T. (2005) G‐protein‐coupled receptor Mas is a 

physiological  antagonist  of  the  angiotensin  II  type  1  receptor.  Circulation 

111:1806‐1813. 

Langeveld  B.,  van  Gilst,  W.  H.,  Tio,  R.  A.,  Zijlstra,  F.,  and  Roks,  A.  J.  (2005) 

Angiotensin‐(1‐7)  attenuates  neointimal  formation  after  stent  implantation 

in the rat. Hypertension 45:138‐141. 

Li P., Chappell, M. C., Ferrario, C. M., and Brosnihan, K. B. (1997) Angiotensin‐(1‐7) 

augments  bradykinin‐induced  vasodilation  by  competing  with  ACE  and 

releasing nitric oxide. Hypertension 29:394‐400. 

Loot A. E., Roks, A. J., Henning, R. H., Tio, R. A., Suurmeijer, A. J., Boomsma, F., and van 

Gilst,  W.  H.  (2002)  Angiotensin‐(1‐7)  attenuates  the  development  of  heart 

failure after myocardial infarction in rats. Circulation 105:1548‐1550. 

Menon, J., Pantoja, D. S., Callahan, M. F., Cline, J. M., Ferrario, C. M., Tallant, E. A., and 

Gallagher,  P.  E.  (2007)  Angiotensin‐(1‐7)  Inhibits  Growth  of  Human  Lung 

Adenocarcinoma  Xenografts  in  Nude  Mice  through  a  Reduction  in 

Cyclooxygenase‐2. Cancer Research In Press: 

Merrill  D.  C.,  Karoly,  M.,  Chen,  K.,  Ferrario,  C.  M.,  and  Brosnihan,  K.  B.  (2002) 

Angiotensin‐(1‐7) in normal and preeclamptic pregnancy. Endocrine. 18:239‐

245. 

61

Nakamoto H., Ferrario, C. M., Fuller, S. B., Robaczewski, D. L., Winicov, E., and Dean, 

R.  H.  (1995)  Angiotensin‐(1‐7)  and  nitric  oxide  interaction  in  renovascular 

hypertension. Hypertension 25:796‐802. 

Oliveira D. R.,  Santos, R. A.,  Santos, G.  F.,  Khosla, M.,  and Campagnole‐Santos, M.  J. 

(1996) Changes  in  the baroreflex control of heart  rate produced by  central 

infusion  of  selective  angiotensin  antagonists  in  hypertensive  rats. 

Hypertension 27:1284‐1290. 

Pantoja, D. S., Tallant, E. A., and Gallagher, P. E.  (2004)  Inhibition of human breast 

cancer cell growth by angiotensin‐(1‐7). 45: 

Paula  R.  D.,  Lima,  C.  V.,  Khosla,  M.  C.,  and  Santos,  R.  A.  (1995)  Angiotensin‐(1‐7) 

potentiates  the  hypotensive  effect  of  bradykinin  in  conscious  rats. 

Hypertension 26:1154‐1159. 

Porsti  I.,  Bara,  A.  T.,  Busse,  R.,  and  Hecker,  M.  (1994)  Release  of  nitric  oxide  by 

angiotensin‐(1‐7)  from  porcine  coronary  endothelium:  implications  for  a 

novel angiotensin receptor. Br.J.Pharmacol. 111:652‐654. 

Qadri  F., Wolf,  A., Waldmann,  T.,  Rascher, W.,  and  Unger,  T.  (1998)  Sensitivity  of 

hypothalamic  paraventricular  nucleus  to  C‐  and  N‐terminal  angiotensin 

fragments: vasopressin release and drinking. J.Neuroendocrinol. 10:275‐281. 

Rodgers K. E., Oliver, J., and diZerega, G. S. (2006) Phase I/II dose escalation study of 

angiotensin  1‐7  [A(1‐7)]  administered  before  and  after  chemotherapy  in 

62

patients with newly diagnosed breast  cancer. Cancer Chemother.Pharmacol. 

57:559‐568. 

Sakima A., Averill, D. B., Gallagher, P. E., Kasper, S. O., Tommasi, E. N., Ferrario, C. M., 

and  Diz,  D.  I.  (2005)  Impaired  heart  rate  baroreflex  in  older  rats:  role  of 

endogenous  angiotensin‐(1‐7)  at  the  nucleus  tractus  solitarii. Hypertension 

46:333‐340. 

Santos R.  A.,  Brosnihan,  K.  B.,  Jacobsen, D. W.,  DiCorleto,  P.  E.,  and  Ferrario,  C. M. 

(1992)  Production  of  angiotensin‐(1‐7)  by  human  vascular  endothelium. 

Hypertension 19:II56‐II61. 

Santos R. A., Castro, C. H., Gava, E., Pinheiro, S. V., Almeida, A. P., Paula, R. D., Cruz, J. 

S., Ramos, A. S., Rosa, K. T., Irigoyen, M. C., Bader, M., Alenina, N., Kitten, G. T., 

and Ferreira, A. J. (2006) Impairment of in vitro and in vivo heart function in 

angiotensin‐(1‐7) receptor MAS knockout mice. Hypertension 47:996‐1002. 

Santos  R.  A.  and  Ferreira,  A.  J.  (2006)  Pharmacological  effects  of  AVE  0991,  a 

nonpeptide angiotensin‐(1‐7) receptor agonist. Cardiovasc.Drug Rev. 24:239‐

246. 

Santos  R.  A.,  Simoes  e  Silva  AC, Maric,  C.,  Silva,  D. M., Machado,  R.  P.,  de,  Buhr,  I, 

Heringer‐Walther,  S.,  Pinheiro,  S.  V.,  Lopes,  M.  T.,  Bader,  M.,  Mendes,  E.  P., 

Lemos,  V.  S.,  Campagnole‐Santos,  M.  J.,  Schultheiss,  H.  P.,  Speth,  R.,  and 

Walther,  T.  (2003)  Angiotensin‐(1‐7)  is  an  endogenous  ligand  for  the  G 

protein‐coupled receptor Mas. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100:8258‐8263. 

63

Schiavone M.  T.,  Santos,  R.  A.,  Brosnihan,  K.  B.,  Khosla,  M.  C.,  and  Ferrario,  C.  M. 

(1988) Release of  vasopressin  from  the  rat hypothalamo‐neurohypophysial 

system by  angiotensin‐(1‐7)  heptapeptide. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 85:4095‐

4098. 

Shaltout H. A., Westwood, B. M., Averill, D. B., Ferrario, C. M., Figueroa, J. P., Diz, D. I., 

Rose,  J.  C.,  and  Chappell,  M.  C.  (2007)  Angiotensin  metabolism  in  renal 

proximal  tubules, urine,  and  serum of  sheep:  evidence  for ACE2‐dependent 

processing of angiotensin II. Am.J.Physiol Renal Physiol 292:F82‐F91. 

Silva D. M.,  Vianna, H. R.,  Cortes,  S.  F.,  Campagnole‐Santos, M.  J.,  Santos, R. A.,  and 

Lemos, V. S. (2006) Evidence for a new angiotensin‐(1‐7) receptor subtype in 

the aorta of Sprague‐Dawley rats. Peptides 

Strawn W.  B.,  Ferrario,  C. M.,  and  Tallant,  E.  A.  (1999)  Angiotensin‐(1‐7)  reduces 

smooth muscle growth after vascular injury. Hypertension 33:207‐211. 

Su E. J., Lombardi, D. M., Siegal, J., and Schwartz, S. M. (1998) Angiotensin II induces 

vascular  smooth  muscle  cell  replication  independent  of  blood  pressure. 

Hypertension 31:1331‐1337. 

Tallant E. A. and Clark, M. A. (2003) Molecular mechanisms of inhibition of vascular 

growth by angiotensin‐(1‐7). Hypertension 42:574‐579. 

64

Tallant E. A.,  Ferrario, C. M.,  and Gallagher, P. E.  (2005) Angiotensin‐(1‐7)  inhibits 

growth  of  cardiac  myocytes  through  activation  of  the  mas  receptor. 

Am.J.Physiol Heart Circ.Physiol 289:H1560‐H1566. 

Tallant E. A., Lu, X., Weiss, R. B., Chappell, M. C.,  and Ferrario, C. M.  (1997) Bovine 

aortic  endothelial  cells  contain  an  angiotensin‐(1‐7)  receptor. Hypertension 

29:388‐393. 

Towler P., Staker, B., Prasad, S. G., Menon, S., Tang, J., Parsons, T., Ryan, D., Fisher, M., 

Williams, D., Dales, N. A., Patane, M. A., and Pantoliano, M. W. (2004) ACE2 X‐

ray  structures  reveal  a  large  hinge‐bending motion  important  for  inhibitor 

binding and catalysis. J.Biol.Chem. 279:17996‐18007. 

Trask  A.  J.,  Averill,  D.  B.,  Ganten,  D.,  Chappell,  M.  C.,  and  Ferrario,  C.  M.  (2007) 

Primary Role of Angiotensin Converting Enzyme 2  in Cardiac Production of 

Angiotensin‐(1‐7) in Transgenic Ren‐2 Hypertensive Rats. Am.J.Physiol Heart 

Circ.Physiol 

Valdes G., Germain, A. M., Corthorn, J., Berrios, C., Foradori, A. C., Ferrario, C. M., and 

Brosnihan, K. B. (2001) Urinary vasodilator and vasoconstrictor angiotensins 

during menstrual cycle, pregnancy, and lactation. Endocrine. 16:117‐122. 

Valdes G., Neves, L. A., Anton, L., Corthorn, J., Chacon, C., Germain, A. M., Merrill, D. C., 

Ferrario,  C.  M.,  Sarao,  R.,  Penninger,  J.,  and  Brosnihan,  K.  B.  (2006) 

Distribution  of  angiotensin‐(1‐7)  and  ACE2  in  human  placentas  of  normal 

and pathological pregnancies. Placenta 27:200‐207. 

65

Vallon  V.,  Heyne,  N.,  Richter,  K.,  Khosla,  M.  C.,  and  Fechter,  K.  (1998)  [7‐D‐ALA]‐

angiotensin  1‐7  blocks  renal  actions  of  angiotensin  1‐7  in  the  anesthetized 

rat. J.Cardiovasc.Pharmacol. 32:164‐167. 

Vickers C., Hales, P., Kaushik, V., Dick, L., Gavin,  J., Tang,  J., Godbout, K., Parsons, T., 

Baronas,  E.,  Hsieh,  F.,  Acton,  S.,  Patane,  M.,  Nichols,  A.,  and  Tummino,  P. 

(2002)  Hydrolysis  of  biological  peptides  by  human  angiotensin‐converting 

enzyme‐related carboxypeptidase. J.Biol.Chem. 277:14838‐14843. 

Wackenfors  A.,  Pantev,  E.,  Emilson,  M.,  Edvinsson,  L.,  and  Malmsjo,  M.  (2004) 

Angiotensin  II  receptor  mRNA  expression  and  vasoconstriction  in  human 

coronary  arteries:  effects  of  heart  failure  and  age.  Basic 

Clin.Pharmacol.Toxicol. 95:266‐272. 

Walter  R.,  Shlank,  H.,  Glass,  J.  D.,  Schwartz,  I.  L.,  and  Kerenyi,  T.  D.  (1971) 

Leucylglycinamide released from oxytocin by human uterine enzyme. Science 

173:827‐829. 

Wang L. J., He, J. G., Ma, H., Cai, Y. M., Liao, X. X., Zeng, W. T., Liu, J., and Wang, L. C. 

(2005)  Chronic  administration  of  angiotensin‐(1‐7)  attenuates  pressure‐

overload  left  ventricular  hypertrophy  and  fibrosis  in  rats.  Di 

Yi.Jun.Yi.Da.Xue.Xue.Bao. 25:481‐487. 

Wei C. C., Ferrario, C. M., Brosnihan, K. B., Farrell, D. M., Bradley, W. E.,  Jaffa, A. A., 

and Dell'Italia, L.  J. (2002) Angiotensin peptides modulate bradykinin levels 

66

in  the  interstitium  of  the  dog  heart  in  vivo.  J.Pharmacol.Exp.Ther. 300:324‐

329. 

Yamada  K.,  Iyer,  S.  N.,  Chappell,  M.  C.,  Ganten,  D.,  and  Ferrario,  C.  M.  (1998) 

Converting  enzyme  determines  plasma  clearance  of  angiotensin‐(1‐7). 

Hypertension 32:496‐502. 

Yamamoto K.,  Chappell, M.  C.,  Brosnihan,  K.  B.,  and  Ferrario,  C. M.  (1992)  In  vivo 

metabolism  of  angiotensin  I  by  neutral  endopeptidase  (EC  3.4.24.11)  in 

spontaneously hypertensive rats. Hypertension 19:692‐696. 

Zisman L. S., Keller, R. S., Weaver, B., Lin, Q., Speth, R., Bristow, M. R., and Canver, C. 

C.  (2003a)  Increased  angiotensin‐(1‐7)‐forming  activity  in  failing  human 

heart  ventricles:  evidence  for  upregulation  of  the  angiotensin‐converting 

enzyme Homologue ACE2. Circulation 108:1707‐1712. 

Zisman L. S., Meixell, G. E., Bristow, M. R., and Canver, C. C. (2003b) Angiotensin‐(1‐

7) formation in the intact human heart: in vivo dependence on angiotensin II 

as substrate. Circulation 108:1679‐1681. 

  

67

      Figure II.1. The chemical structure of the heptapeptide Ang‐(1‐7).  

        

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

68

 

FIGURE II.1 

 

 

69

Figure II.2.  The current view of the RAS shows that Ang‐(1‐7) can be formed 

by  different  enzymes  and  from  different  substrates.    The  actions  of  the  two 

biologically active angiotensin peptides, Ang II and Ang‐(1‐7), are mediated by their 

respective receptors,  the AT1 and mas  receptors,  respectively.   Moreover,  a  recent 

report suggests the existence of another Ang‐(1‐7) receptor, the function of which is 

yet to be determined (Silva et al., 2006).  The ultimate need for a balance of the two 

peptides may lie in the relative activities of the two known enzymes that cleave Ang 

II into Ang‐(1‐7) – ACE2 and POP.   

 

 

 

 

70

 

FIGURE II.2 

71

Figure II.3.   Plasma clearance of Ang‐(1‐7)  in normal SD, and hypertensive 

SHR and Tg(+) rats.  **P < 0.001.  Adapted from Yamada et al., 1998.   

72

 FIGURE II.3 

73

CHAPTER III  

FURTHER EXPANSION OF THE COMPLEXITY OF THE RENIN­ANGIOTENSIN SYSTEM: ANGIOTENSIN­(1­12) 

 

Jasmina Varagic, Aaron J. Trask, Mark C. Chappell, Carlos M. Ferrario   

H  D  ypertension and Vascular Research Centerepart cologyWake icine 

 

ment of Physiology and Pharma Forest Universi y School of MedWinston‐Salem, North Carolina 

t

  

 [This  chapter  is  an  excerpt  from  an  article  published  in  the  Journal  of Molecular Medicine (2008; 86:663­671.) and is reprinted with kind permission from Springer Science+Business Media.   Differences  in  formatting reflect  the requirements of the journal.   Aaron J. Trask prepared the excerpt, while Drs. Jasmina Varagic, Mark C. Chappell, and Carlos M. Ferrario contributed  to  the additional components of the article.]

74

III.1  ANGIOTENSIN­(1­12) 

In  line  with  expanding  data  on  the  newer  angiotensin  peptide,  Ang‐(1‐7), 

Nagata and colleagues [3] recently identified another new angiotensin peptide, the 

dodecapeptide  angiotensin‐(1‐12)  [proangiotensin‐12,  Ang‐(1‐12)].    The  authors 

were probing for analogs of Ang II when they discovered an unidentified peak on an 

HPLC chromatogram, which the authors  found to be a 12‐amino acid derivative of 

angiotensinogen,  two amino acids  larger  than  the  traditional  intermediate peptide 

Ang I.  The dodecapeptide produced pressor responses both in isolated rat aorta and 

acutely in intact Wistar rats – a finding that was abrogated by co‐administration of 

both  an  ACE  inhibitor  or  and  angiotensin  receptor  blocker  (ARB).    These  data 

suggested that “proangiotensin‐12,” as the authors named it, was exerting its actions 

through rapid metabolism into Ang II.   

75

Recent data  from our  laboratory provided  further  evidence  for  a  biological 

role  of Ang‐(1‐12)  as  a  new endogenous peptide  of  the RAS.    Because Ang‐(1‐12) 

was identified endogenously by RIA in different organs and tissues [3] (Figure III.1), 

we  first  undertook  studies  that  investigated  the  immunolocalization  of  the 

dodecapeptide  in  the  hearts  and  kidneys  of  normal  Wistar‐Kyoto  (WKY)  and 

Spontaneously Hypertensive (SHR) rats.  Indeed, Jessup et al. [2] found that Ang‐(1‐

12)  was  localized  by  immunohistochemistry  predominantly  in  cardiac  myocytes, 

while  staining  in  the  medial  and  endothelial  layers  of  the  coronary  arteries 

appeared more faint (Figure III.2).  The distribution of Ang‐(1‐12) within the hearts 

of  SHR  was  more  robust  than  that  assessed  in  WKY.    This  observation  was 

confirmed by  tissue  content  analysis, which  revealed  significantly higher  levels  of 

cardiac Ang‐(1‐12) in SHR compared to WKY.  Renal Ang‐(1‐12) was localized to the 

proximal and distal tubules, as well as the collecting duct.  These data, in accordance 

with  those  from  Nagata,  show  that  Ang‐(1‐12)  is  indeed  localized  endogenously 

within  tissues and  the distribution of  the new angiotensin peptide may reflect  the 

state  of  the health of  that  tissue,  as  shown by differences  in  distribution between 

WKY and SHR.   

Further  enhancements  towards  the  understanding  for  a  biological  role  for 

Ang‐(1‐12)  were  made  by  studies  from  both  our  laboratory  and  those  of  our 

colleague,  Dr. Mark  Chappell, which  illustrated  the metabolic  capacity  for Ang‐(1‐

12)  to  yield  known  downstream  bioactive  angiotensin  peptides.    Intriguingly, 

Chappell et al. [1] found that Ang‐(1‐12) could be degraded into Ang II via Ang I by 

serum  and  renal  ACE,  showing  that  Ang‐(1‐12)  is  a  suitable  substrate  for  ACE 

activity, although renin did not participate in the metabolism of the dodecapeptide.  

Moreover, we [4] showed that Ang‐(1‐12) could be metabolized  into Ang I, Ang II, 

and Ang‐(1‐7) in isolated hearts from Sprague‐Dawley rats.  Collectively, these data 

provide  strong  evidence  that Ang‐(1‐12) may  be  an  alternate  precursor  substrate 

for  the  formation  of  bioactive  angiotensin  peptides  in  the  heart,  kidney,  and 

circulation  that may  depend  on  the  localization  of  one  of  its  processing  enzymes, 

ACE, but not renin. 

 

 

 

 

76

REFERENCES  

  1.   Chappell MC, Westwood BM,  Pendergrass KD,  Jessup  JA,  Ferrario  CM  (2007) 

Distinct Processing Pathways for the Novel Peptide Angiotensin‐(1‐12)  in the 

Serum  and  Kidney  of  the  Hypertensive  mRen2.Lewis  Rat.  Hypertension 

50(4):e139.  Abstract. 

  2.   Jessup  JA,  Chappell  MC,  Nagata  S,  Kato  J,  Kitamura  K,  Ferrario  CM  (2007) 

Localization of the Novel Angiotensin Peptide, Proangiotensin‐12, in the Heart 

and Kidney of Hypertensive and Normotensive Rats. Hypertension 50(4):e101.  

Abstract. 

  3.   Nagata S, Kato J, Sasaki K, Minamino N, Eto T, Kitamura K (2006) Isolation and 

identification  of  proangiotensin‐12,  a  possible  component  of  the  renin‐

angiotensin system. Biochem Biophys Res Commun 350:1026‐1031. 

  4.   Trask AJ,  Jessup JA, Ferrario CM (2007) Angiotensin‐(1‐12) is a Precursor for 

the  Processing  of  Cardiac  Tissue  Angiotensin  Peptides.  Hypertension 

50(4):e154.  Abstract. 

 

  

77

Figure III.1.  Ang‐(1‐12) peptide levels by radioimmunoassay in several 

ale Wistar rats.  Adapted from Nagata et al. [3] tissues from m

   

78

Small In

testin

e

Spleen

Kidneys

Liver

Stomach

Lungs

Adrenal

Heart

Brain

Pancre

asAorta

Plasma

0

200

400

600

800

Angi

oten

sin-

(1-1

2)(fm

ol/g

or f

mol

/mL)

 

FIGURE III.1 

 

79

Figure III.2.  Immunohistochemical localization of Ang‐(1‐12) in the heart of 

WKY  and  SHR  rats.    Note  the  more  robust  distribution  of  Ang‐(1‐12)  within  the 

hearts of SHR than that assessed in WKY.  This observation was confirmed by tissue 

content analysis, which revealed significantly higher levels of cardiac Ang‐(1‐12) in 

SHR compared to WKY.  Adapted from Jessup et al. [2] 

80

 

FIGURE III.2

81

CHAPTER IV 

IV.1  RATIONALE AND AIMS 

Whereas most of the research on the cardioprotective mechanism of cardiac 

drugs  has  focused  on  reducing  the  synthesis  or  activity  of  cardiac  angiotensin  II 

(Ang  II),  studies  from our group showed  first  that angiotensin‐(1‐7)  [Ang‐(1‐7)]  is 

important  in the regulation of cardiac  function and blood pressure by acting as an 

endogenous inhibitor of Ang II (5; 10).  My present interest in the cardioprotective 

effects  of  Ang‐(1‐7)  builds  upon  previous  studies  showing  that  an  eight‐week 

chronic infusion of Ang‐(1‐7) commencing 2 weeks after myocardial infarction was 

associated with restoration of cardiac function and reversal of cardiac hypertrophy 

(8).    These  first  studies  in  Sprague‐Dawley  [SD]  rats  are  in  keeping  with  the 

demonstration of anti‐arrhythmic actions of Ang‐(1‐7)  in  ischemia/reperfusion (6; 

7) that were found by De Mello (3) to result  from activation of the cardiac sodium 

pump with consequent re‐establishment of impulse conduction.   

New and critical evidence for a role of Ang‐(1‐7)  in cardiac remodeling and 

function  follows  the  demonstration  that  a  new  homologue  of  ACE,  angiotensin 

converting enzyme 2 (ACE2), may be critically involved in the regulation of cardiac 

function by facilitating conversion of Ang II into Ang‐(1‐7) (1).  Interest in the role of 

ACE2 in cardiac function has grown since Crackower et al. (1), in collaboration with 

us,  first  demonstrated  that  ACE2  knockout  mice  exhibited  severe  cardiac 

dysfunction  characterized  by  thinning  of  the  left  ventricular  wall,  which  was 

restored when ACE and ACE2 were ablated concurrently.  This study suggested that 

a balance between ACE and ACE2, mediated by their enzymatic products Ang II and 

82

Ang‐(1‐7),  respectively,  is necessary  for normal myocardial  function.   However,  at 

the  time  I  commenced my  studies,  there were no  studies  in  rats  that  had directly 

investigated the role of cardiac ACE2 in hydrolyzing Ang II directly  into Ang‐(1‐7), 

nor  were  there  studies  investigating  the  role  of  endogenous  ACE2  in  cardiac 

function.  

Based  on  these  observations,  and  preliminary  studies  suggesting  a 

differential  role  for  cardiac  ACE2  in  producing  Ang‐(1‐7)  between  normal  and 

hypertensive rats, I evaluated the hypothesis that the metabolic disposition of Ang 

II  conversion  into  Ang­(1­7)  is  significantly  shifted  in  hypertension­induced 

cardiac hypertrophy for the studies outlined in Chapters V and VI.  This hypothesis 

was  evaluated  in  part  by  utilizing  the  Langendorff  isolated  heart  preparation  to 

ascertain  the  relative  contribution  of  cardiac  ACE2  to  Ang‐(1‐7)  production  from 

Ang II between normal and hypertensive rat hearts.  Furthermore, an investigation 

into the role of cardiac ACE2 in serving as an endogenous balance regulator for local 

Ang  II  and  Ang‐(1‐7)  was  conducted  by  chronically  inhibiting  ACE2  in  the 

[mRen2]27 rat.   

Unsuspectingly, an intriguing report from Nagata and colleagues (9) in 2006 

provided  evidence  that  a  new  angiotensin  peptide  may  function  as  an  alternate 

substrate for the production of downstream angiotensin peptides,  including Ang II 

and Ang‐(1‐7).  The incubation of “proangiotensin‐12” [Angiotensin‐(1‐12), Ang‐(1‐

12)] with  isolated  aortas  produced  a  dose‐dependent  pressor  response,  a  finding 

that was confirmed in  intact Wistar rats.   The observed pressor actions of Ang‐(1‐

12) were completely abolished by the co‐administration of either the ACE inhibitor 

83

captopril  or  the AT1  receptor antagonist CV‐11974,  suggesting  to  the authors  that 

Ang‐(1‐12)  was  being  metabolized  into  Ang  II  to  produce  increases  in  blood 

pressure.    Evidence  exists  that  angiotensinogen may be  synthesized  locally  (4)  or 

may be taken up from the circulation (2).   Because the presence of the previously‐

undisputed  precursor,  angiotensinogen,  within  the  heart  is  controversial,  the 

findings by Nagata et al. (9) suggested to us that Ang‐(1‐12) may be a true alternate 

precursor  for  the  production  of  angiotensin  peptides  in  the  heart.    Therefore, we 

hypothesized  that  Ang­(1­12)  may  serve  as  an  alternate  substrate  for  the 

production of angiotensin peptides in the heart in the studies outlined in Chapter 

7.  The potential for Ang‐(1‐12) to yield bioactive angiotensin peptides may add an 

additional  level  of  complexity  to  the balance between Ang  II  and Ang‐(1‐7)  in  the 

heart.    If Ang‐(1‐12)  is a biological substrate  for angiotensin peptides,  then  it may 

preferentially be able to produce either Ang II or Ang‐(1‐7) at differing levels, likely 

depending in part upon enzyme distributions within the heart.  This hypothesis was 

evaluated  by  utilizing  the  Landendorff  isolated  heart  preparation  as  previously 

discussed.   

 

84

REFERENCES 

  1.   Crackower MA, Sarao R, Oudit GY, Yagil C, Kozieradzki  I,  Scanga SE, Oliveira‐

dos‐Santos  AJ,  da  CJ,  Zhang  L,  Pei  Y,  Scholey  J,  Ferrario  CM,  Manoukian  AS, 

Chappell  MC,  Backx  PH,  Yagil  Y  and  Penninger  JM.  Angiotensin‐converting 

enzyme  2  is  an  essential  regulator  of  heart  function.  Nature  417:  822‐828, 

2002. 

  2.   Danser  AH,  van  Kats  JP,  Admiraal  PJ,  Derkx  FH,  Lamers  JM,  Verdouw  PD, 

Saxena PR and Schalekamp MA. Cardiac renin and angiotensins. Uptake  from 

plasma versus in situ synthesis. Hypertension 24: 37‐48, 1994. 

  3.   De Mello WC. Angiotensin  (1‐7)  re‐establishes  impulse  conduction  in  cardiac 

muscle  during  ischaemia‐reperfusion.  The  role  of  the  sodium  pump.  J Renin 

Angiotensin Aldosterone Syst 5: 203‐208, 2004. 

  4.   Dzau VJ, Ellison KE, Brody T, Ingelfinger J and Pratt RE. A comparative study of 

the distributions of renin and angiotensinogen messenger ribonucleic acids in 

rat and mouse tissues. Endocrinology 120: 2334‐2338, 1987. 

  5.   Ferrario  CM,  Chappell  MC,  Tallant  EA,  Brosnihan  KB  and  Diz  DI. 

Counterregulatory  actions  of  angiotensin‐(1‐7).  Hypertension  30:  535‐541, 

1997. 

85

  6.   Ferreira  AJ,  Santos  RA  and  Almeida  AP.  Angiotensin‐(1‐7):  cardioprotective 

effect in myocardial ischemia/reperfusion. Hypertension 38: 665‐668, 2001. 

  7.   Ferreira AJ, Santos RA and Almeida AP. Angiotensin‐(1‐7)  improves the post‐

ischemic function in isolated perfused rat hearts. Braz J Med Biol Res 35: 1083‐

1090, 2002. 

  8.   Loot AE, Roks AJ, Henning RH, Tio RA, Suurmeijer AJ, Boomsma F and van Gilst 

WH.  Angiotensin‐(1‐7)  attenuates  the  development  of  heart  failure  after 

myocardial infarction in rats. Circulation 105: 1548‐1550, 2002. 

  9.   Nagata  S,  Kato  J,  Sasaki K, Minamino N,  Eto T  and Kitamura K.  Isolation  and 

identification  of  proangiotensin‐12,  a  possible  component  of  the  renin‐

angiotensin system. Biochem Biophys Res Commun 350: 1026‐1031, 2006. 

 10.   Nakamura S, Averill DB, Chappell MC, Diz DI, Brosnihan KB and Ferrario CM. 

Angiotensin  receptors  contribute  to  blood  pressure  homeostasis  in  salt‐

depleted SHR. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 284: R164‐R173, 2003. 

 

86

CHAPTER V 

PRIMARY ROLE OF ANGIOTENSIN CONVERTING ENZYME 2 IN CARDIAC PRODUCTION OF ANGIOTENSIN­(1­7) IN TRANSGENIC REN­2 HYPERTENSIVE 

RATS  

Aaron J. Trask1, David B. Averill1, Detlev Ganten2, Mark C. Chappell1, and Carlos M. Ferrario1 

   

tension and Vascular Disease CenterDepartment of Physiology and Pharmacology Wake Forest Universi y School of Medicine 

1The Hyper  

tWinston‐Salem, North Carolina 

 2Max‐Delbrück‐Center for Molecular Medicine, Berlin‐Buch, Germany 

   [This chapter  is published  in  the American  Journal of Physiology – Heart and Circulatory  Physiology  (2007;  292:H3019­H3024.)  and  is  reprinted  with permission.  Differences in formatting reflect the requirements of the journal.  Aaron J. Trask prepared the manuscript, while Dr. Carlos M. Ferrario acted in an  editorial  and  advisory  capacity.   Dr. Detlev  Ganten  provided  the  animal model used  in  these studies.   Dr. Averill provided  initial assistance with  the angendorff  isolated heart preparation and Dr. Chappell provided assistance ith the biochemical analysis outlined in this manuscript.] 

Lw  

87

V.1  ABSTRACT 

Angiotensin‐converting enzyme 2 (ACE2) converts angiotensin II  (Ang II) to 

angiotensin‐(1‐7)  [Ang‐(1‐7)]  and  this  enzyme  may  serve  as  a  key  regulatory 

juncture in various tissues.  Although the heart expresses ACE2, the extent that the 

enzyme participates in the cardiac processing of Ang II and Ang‐(1‐7) is equivocal.  

Therefore,  we  utilized  the  Langendorff  preparation  to  characterize  the  ACE2 

pathway  in  isolated  hearts  from  male  normotensive  Sprague‐Dawley  [Tg(‐)]  and 

hypertensive [mRen2]27 [Tg(+)] rats.  During a 60‐minute recirculation period with 

10 nM Ang II, the presence of Ang‐(1‐7) was assessed in the cardiac effluent.   Ang‐

(1‐7) generation from Ang II was similar in both the normal and hypertensive hearts 

(Tg(‐):  510  ±  55  pM,  n=20  versus  Tg(+):  497  ±  63  pM,  n=14)  with  peak  levels 

occurring at 30 minutes after administration of the peptide.  ACE2 inhibition (MLN‐

4760,  1µM)  significantly  reduced Ang‐(1‐7)  production  by  83%  (57  ±  19  pM, P < 

0.01, n=7) in the Tg(+) rats, whereas the inhibitor had no significant effect in the Tg(‐) 

rats  (285  ±  53  pM,  P  >  0.05,  n=10).    ACE2  activity  was  found  in  the  effluent  of 

perfused  Tg(‐)  and  Tg(+)  hearts  and  it  was  highly  associated  with  ACE2  protein 

expression (r =0.78).  This study is the first demonstration for a direct role of ACE2 

in the metabolism of cardiac Ang II  in the hypertrophic heart of hypertensive rats.  

We conclude that predominant expression of cardiac ACE2 activity in the Tg(+) may 

be a compensatory response to the extensive cardiac remodeling in this strain.  

 

Keywords: angiotensin II, hypertension, isolated heart 

88

V.2  INTRODUCTION 

The involvement of the renin‐angiotensin system (RAS)  in the development 

of hypertension, cardiac hypertrophy, and subsequent transition to heart failure  is 

without question.   However, newer studies suggest that the hypertrophic and pro‐

fibrotic  actions  of  angiotensin  II  (Ang  II)  may  be  facilitated  by  a  reduced 

counterbalancing  action  of  angiotensin‐(1‐7)  [Ang‐(1‐7)]  since  infusion  of  the 

heptapeptide attenuated the cardiac remodeling and the decrease in left ventricular 

pumping ability produced by myocardial infarction in rats (14).  Ang‐(1‐7) may act 

to  counterbalance  the  actions  of  Ang  II  by  reducing  vascular  resistance  (2), 

improving  vascular  endothelial  function  (10),  reversing  cardiac  hypertrophy  (24), 

and  cardiac  collagen  deposition  (17),  as  well  as  ischemia‐induced  cardiac 

arrhythmias (8).  Indeed, Tallant et al. (27) demonstrated that Ang‐(1‐7) attenuated 

the  Ang  II‐dependent  activation  of  MAPK  kinase  in  isolated  cardiomyocytes.  

Moreover,  the  protective  actions  of  Ang‐(1‐7)  were  blocked  by  oligonucleotide‐

directed  inhibition  of  the  mas  protein  providing  further  evidence  that  the 

cardioprotective actions of Ang‐(1‐7) are mediated by the mas receptor (23; 27).    

Angiotensin‐converting  enzyme  2  (ACE2),  a  newly  discovered  enzyme 

member of the RAS, links the two functionally opposing arms of the RAS — the Ang 

II pressor/hypertrophic path of the RAS to the depressor/anti‐proliferative actions 

of  Ang‐(1‐7)  (14).    Zisman  et  al.  (32)  recently  showed  that  exogenous  Ang‐(1‐7) 

formation  in  human  heart  tissue was  dependent  upon  Ang  II.    In  ACE2  knockout 

mice, Crackower et al. (6) reported significantly higher levels of cardiac Ang II that 

were associated with cardiac dilatation.  Given the importance that the new studies 

89

suggest  in  terms  of  the  mechanisms  that  regulate  cardiac  performance  and  may 

mitigate the hypertrophic actions of Ang II, the current study investigated the role of 

ACE2  in  the  production  Ang‐(1‐7)  from  Ang  II  in  intact  hearts  from  both 

normotensive and transgenic hypertensive rats. 

 

V.3  MATERIALS AND METHODS 

Animals 

Twenty 10 ‐ 12‐week‐old male Sprague‐Dawley [(Tg(‐)), Harlan Laboratories, 

Indianapolis,  IN]  rats  and  fourteen  aged‐matched  [mRen2]27  transgenic 

hypertensive  rats  (Tg(+))  bred  from  our  colony  at  the  Hypertension  &  Vascular 

Disease Center were housed in individual cages (12‐hour light/dark cycle) with ad 

libitum  access  to  rat  chow  and  tap water.    Procedures  complied with  the  policies 

implemented by our institutional Animal Care and Use Committee.   

Langendorff Procedure 

Rats were weighed, placed under deep halothane (2.5 ‐ 3%) anesthesia, and 

given  heparin  (300  USP  units)  via  a  catheter  inserted  into  the  jugular  vein.    The 

chest  was  opened  down  the midline  and  the  heart  was  excised  and  immediately 

placed  in  ice‐cold  Krebs  buffer  (NaCl,  118  mM;  KCl,  4.7  mM;  MgSO4,  3.28  mM; 

KH2PO4, 1.18 mM; CaCl2, 2.52 mM; NaHCO3, 25 mM; Glucose, 5.55 mM; Na‐pyruvate, 

4.0 mM).   Rat hearts were then perfused at a constant flow (10  ‐ 12 mL/min) on a 

Langendorff  isolated heart  perfusion  apparatus  (Model  IH‐SR, Harvard Apparatus, 

Holliston,  MA).    Perfusion  pressures  (PP)  were  measured  with  an  ISOTEC  force 

transducer  (Harvard  Apparatus,  Holliston,  MA)  and  flow  rates  were  monitored 

90

using a TS420 flowmeter (Transonic Systems, Inc.,  Ithaca, NY), both of which were 

connected  to  the  Biopac MP100A‐CE  hardware  (Biopac  Systems,  Inc.,  Goleta,  CA).  

Measurements  were  recorded  using  the  Biopac  AcqKnowledge  3.8.1  computer 

software.   

After  a  one‐hour  equilibration  period,  a  baseline  sample  of  the  cardiac 

effluent  (2.5  mL)  was  collected,  and  then  60  mL  of  Krebs  buffer  with  10  nM 

angiotensin II (Ang II, Bachem, Torrance, CA) was recirculated through the heart for 

60  minutes.    All  effluent  samples  were  acid‐matched  1:1  (v:v)  with  1% 

heptafluorobutyric  acid  (HFBA)  to  abolish  metabolism  of  the  peptides  at  the 

following times:  (1) 5 minutes of recirculation, (2) 15 minutes, (3) 30 minutes, (4) 

60  minutes.   Half  of  the  rats  received  1  μM  of  the  ACE2  inhibitor,  MLN‐4760 

(Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, MA), immediately following the collection 

of  the  15‐minute  sample.    Previous  studies  demonstrated  that  MLN‐4760 

specifically inhibits ACE2 at the doses employed here (7).  Furthermore, we directly 

tested the inhibitory action of MLN‐4760 by assaying the conversion of angiotensin 

II into Ang‐(1‐7) in the cardiac effluent by HPLC (see below).   Hearts were weighed 

at the end of the experiment to calculate the heart weight:body weight ratio. 

Biochemical Procedures 

Angiotensin  peptides were  extracted  from  the  acid‐matched  samples  using 

C18 Sep Pak columns (Waters, Milford, MA).  Each Sep Pak was activated with 5 mL 

of  80% methanol  (MeOH)/0.1% HFBA,  followed  by  5 mL  0.1% HFBA.    The  5 mL 

samples were  then  applied  to  the  columns,  followed  by  10 mL  0.1% HFBA.    The 

columns were rinsed with 5 mL of MilliQ water, and the peptides were eluted in 3 

91

mL 80% MeOH/0.1% HFBA.   The eluate was  then analyzed by radioimmunoassay 

(RIA)  for  both  Ang  II  and  Ang‐(1‐7)  as  described  previously  (12;  13),  which was 

coupled with high performance liquid chromatography (HPLC) analysis of the eluate 

to  verify  the  presence  of  Ang‐(1‐7)  as  described  previously  (4).    HPLC  fraction 

numbers  10‐25  were  analyzed  for  immunoreactive  Ang‐(1‐7).    The  minimum 

detectable  limits  of  the  Ang  II  and  Ang‐(1‐7)  RIA  assays were  0.8  pg/mL  and  2.5 

pg/mL, respectively.   

ACE2 Activity by HPLC 

Effluent collected from the hearts of three Tg(‐) and three Tg(+) rats (without 

the  ACE2  inhibitor)  at  the  end  of  the  60‐minute  recirculation  period  were 

concentrated  using  an  Amicon  Ultra  10,000  molecular  weight  cut  off  centrifugal 

filters  (Millipore,  Billerica,  MA)  and  washed  twice  with  15  mL  of  HEPES  buffer 

containing 120 mM NaCl, 10 µM ZnCl2, pH 7.4.  ACE2 activity was determined in the 

concentrate by quantifying the conversion of 125I‐Ang II to Ang‐(1‐7) for 180 min at 

37° C by HPLC as described elsewhere (12).    

Immunoblot 

ACE2  protein  was  determined  in  the  Tg(‐)  and  Tg(+)  cardiac  effluent  by 

immunoblot  using  an  N‐terminally  directed  antibody  (AN1212)  developed  by  us 

that recognizes ACE2, but not ACE or collectrin (15; 26).   We previously confirmed 

that  this  antibody  can  be  blocked  by  the  peptide  with  which  it  was  raised 

(unpublished  observations).    We  applied  25  μL  of  the  concentrated  perfusate  to 

10% SDS polyacrylamide  gels  (BioRad, Hercules,  CA)  for  one hour  at  120 volts  in 

Tris‐Glycine SDS, transferred onto a PVDF membrane and subsequently blocked for 

92

one hour with 5% BioRad Dry Milk and TBS with Tween prior to incubation with the 

ACE2 antibody (1:2,000).  Immunoblots were then resolved with Pierce Super Signal 

West  Pico  Chemiluminescent  substrate  (Chicago,  IL)  as  described  by  the 

manufacturer and exposed to Amersham Hyperfilm ECL (Piscataway, NJ).     

Statistical Analyses 

All  values  are  reported  as  the mean  ±  SEM.    Student’s  t‐test  and  one‐way 

ANOVA  were  used  to  determine  significant  differences  at  a  probability  <0.05.  

Tukey’s  post‐hoc  test  for  multiple  comparisons  was  used  following  the  one‐way 

ANOVA.  For the RIA, values at or below the minimal detectable limits of the assays 

were assigned that value for statistical purposes.  

 

V.4  RESULTS 

The  heart weight:body weight  ratio  (mg/g)  for  the  Tg(+)  rats  (5.13  ±  0.17) 

was 26% higher than those determined in the Tg(‐) hearts (4.08 ± 0.12; P < 0.001), 

verifying  that  the  hypertensive  animals  exhibited  marked  cardiac  hypertrophy.  

Basal  levels of perfusion pressure  (PP)  and heart  rate  (HR) were  similar between 

Tg(‐) and Tg(+) hearts,  although the heart rate was slightly lower in the Tg(+) hearts 

(PP: Tg(‐), 63.8 ± 2.7 mmHg vs. Tg(+), 60.7 ± 3.2 mmHg, P > 0.05; HR: Tg(‐), 254 ± 6.8 

BPM vs P. 219 ± 9.5 BPM,   < 0.05). 

The overall  rate of Ang  II  degradation  in perfused hearts was not different 

between the Tg(‐) and Tg(+) rats.  The calculated half‐life (t1/2) of the peptide was 42 ± 

7 minutes for the Tg(‐) rats and 46 ± 5 minutes (P > 0.05) for the Tg(+) rats (Figure 

V.1A and V.1B).  Moreover, ACE2 inhibition did not change the Ang II levels in either 

93

strain.  Ang‐(1‐7) production from exogenous Ang II as determined in the effluent of 

hearts perfused with Ang II peaked at 30 minutes to an average of 510 ± 55 pM (P < 

0.001 vs.   baseline) and 497 ± 63 pM (P < 0.001 vs. baseline) in Tg(‐) and Tg(+) rats, 

respectively  (Figure V.2A and V.2B).   Addition of  the ACE2  inhibitor MLN‐4760  in 

the Tg(‐) hearts caused no significant changes in Ang‐(1‐7) production at either the 

30‐ or 60‐minute time points.  In contrast, ACE2 inhibition in the Tg(+) rats resulted 

in  a  sustained  reduction  in Ang‐(1‐7)  averaging 54.7%  (P < 0.05)  and 83.1%  (P < 

0.01) at 30 and 60 minutes, respectively.     

HPLC analysis of the heart perfusate confirmed the immunoreactive identity 

of Ang‐(1‐7) that eluted essentially as a single fraction at 18 minutes (Figure V.3A).  

The  immunoreactive  peak  at  24  minutes  corresponds  to  Ang  II  and  most  likely 

represents the cross reactivity of exogenous Ang II with the Ang‐(1‐7) RIA.  Indeed, 

HPLC  analysis  of  the  buffer  containing  Ang  II  revealed  a  similar  peak  of  Ang  II 

(Figure V.3B).  Finally, the analysis of the Krebs buffer without Ang II demonstrated 

no imm vunoreacti e peaks (Figure V.3C).    

Although  ACE2  is  a  membrane  bound  metallopeptidase,  we  examined 

whether ACE2 activity was present in the cardiac effluent.  Following the 60‐minute 

recirculation  period,  the  perfusate  was  concentrated  40  fold  and  incubated  with 

125I‐Ang  II.    As  illustrated  in  Figure  V.4,  the  chromatographs  reveal  significant 

conversion  to Ang‐(1‐7)  in  the effluent collected  from perfused Tg(‐)  (Figure V.4A) 

and  Tg(+)  (Figure  V.4B)  hearts  that  was  completely  abolished  by  addition  of  the 

ACE2  inhibitor MLN‐4760.   The ACE2 activity was  significantly higher  in  the Tg(+) 

perfusate  (1.97  ±  0.26  fmol/mL/min,  n=3)  when  compared  to  the  normal  Tg(‐) 

94

perfusate (0.82 ± 0.19 fmol/mL/min, n=3, P < 0.05).  Consistent with the presence of 

ACE2  activity  in  the  concentrate, we  detected  an  80‐kilodalton  (kDa)  band  in  the 

immunoblot of  the concentrated effluent  from both Tg(‐) hearts  (Lanes 3, 4, and 5, 

Figure V.5A) and Tg(+) hearts (Lanes 3, 4, and 5, Figure V.5C) using an N‐terminally 

directed antibody to rat ACE2.  Both the human ACE2 standard and the 80‐kDa band 

were  blocked  in  the  Tg(‐)  and  Tg(+)  heart  effluent  by  pre‐incubation  of  the  ACE2 

immunogenic  peptide  with  the  antibody  (Figures  V.5B  and  V.5D,  respectively), 

confirming  the  presence  of  endogenous  soluble  ACE2  (sACE2).    Moreover,  the 

densities of the sACE2 band in pooled samples of the Tg(‐) and Tg(+) heart perfusate 

(n=6) were highly associated with ACE2 activity (r=0.78).  Immunoreactive bands at 

220 kDa and 60 kDa were also evident, but  their  intensity was not diminished by 

blockade with the ACE2 peptide.    

 

V.5  DISCUSSION 

Although others have  investigated  the metabolism of Ang  I  in  the heart  (9; 

21),  the  present  study  in  the  isolated  perfused  heart  preparation  is  the  first 

demonstration,  to  our  knowledge,  of  a  direct  contribution  of  cardiac  ACE2  to  the 

metabolism of Ang II into Ang‐(1‐7) in the hearts of hypertensive rats.  In agreement 

with previous studies in human heart tissue (32), we now report that cardiac tissue 

has  a  capacity  to  generate  Ang‐(1‐7)  from  Ang  II  in  normal  and  hypertensive  rat 

hearts — albeit the amounts of peptide production are not different in both normal 

and  hypertrophied  hearts.    In  contrast,  our  study  now  reveals  a  very  significant 

dependence  on  ACE2  in  the  hypertensive  heart  for  Ang‐(1‐7)‐formation,  whereas 

95

ACE2  had  no  major  role  in  Ang‐(1‐7)  formation  in  the  normal  heart.    Likewise, 

studies by Zisman et al. (31) also demonstrated an increase in ACE2‐mediated Ang‐

(1‐7)‐forming activity in human failing heart tissue.   Together,  these studies  imply 

that ACE2 may serve as a compensatory mechanism to preserve Ang‐(1‐7) levels in 

response to hypertension‐induced cardiac hypertrophy and progression  into heart 

failure, although it may not be sufficient to counteract the deleterious effects of Ang 

II.    

We  find  that  a  potent  and  specific  ACE2  inhibitor  (7)  decreased  Ang‐(1‐7) 

formation (>80%) from exogenous Ang II in isolated Tg(+) rat hearts.  The failure of 

this ACE2 inhibitor to reduce cardiac Ang‐(1‐7) formation in Tg(‐) rats suggests that 

ACE2 does not contribute to Ang II metabolism in the perfused normal hearts and 

that other peptidases may be responsible for the production of Ang‐(1‐7) from Ang 

II  in  Tg(‐)  rat  hearts.   While we  did  not  ascertain  the  identity  of  other  Ang‐(1‐7)‐

forming enzymes  in the heart  for normal rats, previous studies  suggest that prolyl 

oligopeptidase (POP) may be a likely candidate as the enzyme cleaves Ang II to Ang‐

(1‐7) and both soluble and particulate fractions of the Tg(‐) heart exhibit activity (5; 

29).  POP may prove to be important in the regulation of angiotensin peptides in the 

normal heart. 

In recently published studies from both our laboratory (19) and others (30), 

it  was  demonstrated  that  cardiac  ACE2 mRNA  and  activity  in  heart  homogenates 

was  reduced  in  rat models  of  hypertension  and  cardiac  hypertrophy.    Studies  by 

Jessup et al. (19) showed that ACE2 mRNA and activity was blunted in response to 

lisinopril or losartan treatment in heart homogenates of mRen2.Lewis rats compared 

96

to their normotensive controls.  Likewise, Zhong et al. (30) reported a reduction in 

both cardiac ACE2 mRNA and protein in SHR rats compared with the normal WKY.  

Collectively,  these  studies  indicated  an  impairment  in  cardiac  homogenate  ACE2 

activity in the hypertensive heart.   The current study investigated the contribution 

of coronary artery ACE2 to the metabolism of Ang II into Ang‐(1‐7) ex vivo utilizing 

the  isolated  heart  preparation, which  is  not  comparable  to  ACE2  activity  in  heart 

homogenate.   It is indeed likely that even though cardiac ACE2 activity is impaired 

in the hypertensive heart, this activity has assumed the role of preserving the Ang‐

(1‐7)  levels,  as  shown  by  the  current  study.    Since  Zisman  et  al.  (31)  showed 

increased ACE2 activity in failing human heart tissue, it may be that ACE2 increases 

as  the heart  progresses  from cardiac hypertrophy  into heart  failure  in  an  ill‐fated 

attempt to protect the heart from demise. 

The  presence  of  ACE2  activity  in  the  effluent  of  the  heart  suggests  that  an 

active  secreted  form  of  the  enzyme may  act  either  locally  or  be  released  into  the 

circulation.  Immunoblots revealed an 80‐kDa band corresponding to sACE2, as well 

as bands of larger and smaller molecular weight (220 kDa and 60 kDa, respectively).  

Newton  et  al.  (22)  showed  the  presence  of  a  72‐kDa  form  of  ACE2  in  normal  rat 

cerebrospinal  fluid.    In  addition,  Warner  et  al.  (28)  showed  that  ACE2  can  be 

secreted  from  polarized  canine  kidney  epithelial  cells,  which  was  blocked  by  a 

metallopeptidase  inhibitor,  suggesting  the  secretion  was  mediated  by  a 

metallosheddase.    In a  similar  study by Lambert  et  al.  (20),  the  authors  identified 

tumor  necrosis  factor‐α  convertase  (ADAM17)  that  cleaves  ACE2  in  human 

embryonic kidney cells.  The truncated form of ACE2 in this study corresponded to 

97

immunoblot  bands  of  105  or  95  kDa,  depending  on  the  glycosylation  state  of  the 

enzyme.   The ADAM17 protein is present in the human heart, and  its expression is 

significantly  increased  in the hearts of patients with cardiomyopathy as compared 

to non‐failing hearts (11).   Importantly,  increased ADAM17 activity was associated 

with human heart failure (25), suggesting that a loss of ACE2 (and potential loss of 

Ang‐(1‐7)  production)  from  the  myocardium  is  may  facilitate  the  progression  of 

heart  failure.    However,  ACE2  gene  expression was  increased  in  both  human  and 

rodent heart failure (3; 16) and the peptidase activity was elevated in the viable and 

border/infarct  zones  of  the  heart.    Additional  studies  are  required  to  address  the 

exact role of ADAM17 in the processing of ACE2 within the heart.  It is possible that  

the  catalytic  activity  of  this  secreted  form  of  ACE2 may  prove  to  supplement  the 

activity of membrane‐bound form, which has been detected in cardiac myocytes, as 

well  as  the  vascular  endothelium,  and  the  vascular  smooth  muscle  cells  of 

intracoronary vessels (3).   Moreover,  the finding that sACE2 activity was higher in 

the Tg(+) perfusate suggests  that either  the rate of ACE2 secretion  is higher or  the 

rate of ACE2 metabolism is lesser in the pathological state of hypertension.  In light 

of these findings, it may be that the 80‐kDa bands found in our studies (Figure V.5) 

correspond to secreted active metabolites of ACE2. 

In summary, that ACE2 Ang‐(1‐7)‐forming activity was increased in the Tg(+) 

hypertensive  strain  suggests  that  this  enzyme  may  constitute  an  important 

compensatory mechanism to pressure and/or RAS‐dependent cardiac hypertrophy 

and  remodeling,  which  supports  our  notion  that  ACE2  may  be  a  critical  feed‐

forward  step  in  the  RAS  pathway  to  limit  the  cardiac  effects  of  Ang  II  as well  as 

98

facilitating the vasodilatory and anti‐proliferative actions of Ang‐(1‐7) (14).   Albeit 

ACE2 was responsible for most of the Ang‐(1‐7)‐forming activity in [mRen2]27 Tg(+) 

rats in this study, it may be insufficient to counteract the deleterious actions of Ang 

II on the heart.   Without  the sustained elevated  levels of Ang‐(1‐7)  to mitigate the 

cardiac  hypertrophy  and  fibrosis  associated  with  elevated  Ang  II,  the  renin‐

dependent hypertension and cardiac hypertrophy will eventually  lead the heart  to 

failure, which may be more exacerbated in the absence of ACE2.  In agreement with 

this notion, Crackower et  al.  (6)  showed  that  genetic deletion  of ACE2  resulted  in 

severe cardiac contractility defects and cardiac dilatation, which was reversed when 

ACE  and  ACE2  were  knocked  out  concomitantly  suggesting  that  the  balanced 

expression of these two enzymes is critical in maintaining normal heart function.   

The discovery of ACE2 and the continual unveiling of its role in the RAS have 

elucidated a need for balance between ACE and ACE2 because they work to regulate 

the net levels of the known biologically active peptides, Ang II and Ang‐(1‐7).  These 

peptide  levels — both  tissue and circulating — may be disrupted  in many disease 

states,  such  as  hypertension,  cardiac  fibrosis,  and  myocardial  infarction.  

Understanding this balance will be key to unravel the ways in which these disease 

tates can be best treated. s

 

99

ACKNOWLEDGEMENTS  

Funding  from  the  NIH  (HL‐51952,  HL‐56973)  provided  support  for  this  project.  

Additionally, the authors gratefully acknowledge grant support  in part provided by 

Unifi,  Inc.,  Greensboro,  NC,  and  Farley‐Hudson  Foundation,  Jacksonville,  NC.    The 

authors would  also  like  to  thank  Drs.  Che‐Ping  Cheng,  R. Mark  Payne,  and  James 

Jordan for their help and counsel in setting up the Langendorff apparatus.  The ACE2 

inhibitor  MLN‐4760  was  obtained  from  Millennium  Pharmaceuticals  (Cambridge, 

A).   M

 

 

100

R EFERENCES 

  1.   Agirregoitia N, Gil J, Ruiz F, Irazusta J and Casis L. Effect of aging on rat tissue 

peptidase activities. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 58: B792‐B797, 2003. 

  2.   Benter  IF,  Ferrario  CM,  Morris  M  and  Diz  DI.  Antihypertensive  actions  of 

angiotensin‐(1‐7) in spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol 269: H313‐

H319, 1995. 

  3.   Burrell LM, Risvanis J, Kubota E, Dean RG, MacDonald PS, Lu S, Tikellis C, Grant 

SL,  Lew  RA,  Smith  AI,  Cooper  ME  and  Johnston  CI.  Myocardial  infarction 

increases ACE2 expression in rat and humans. Eur Heart J 26: 369‐375, 2005. 

  4.   Chappell  MC,  Brosnihan  KB,  Diz  DI  and  Ferrario  CM.  Identification  of 

angiotensin‐(1‐7)  in  rat  brain.  Evidence  for  differential  processing  of 

angiotensin peptides. J Biol Chem 264: 16518‐16523, 1989. 

  5.   Chappell  MC,  Tallant  EA,  Brosnihan  KB  and  Ferrario  CM.  Processing  of 

angiotensin  peptides  by  NG108‐15  neuroblastoma  x  glioma  hybrid  cell  line. 

Peptides 11: 375‐380, 1990. 

  6.   Crackower MA, Sarao R, Oudit GY, Yagil C, Kozieradzki  I,  Scanga SE, Oliveira‐

dos‐Santos  AJ,  da  CJ,  Zhang  L,  Pei  Y,  Scholey  J,  Ferrario  CM,  Manoukian  AS, 

Chappell  MC,  Backx  PH,  Yagil  Y  and  Penninger  JM.  Angiotensin‐converting 

101

enzyme  2  is  an  essential  regulator  of  heart  function.  Nature  417:  822‐828, 

2002. 

  7.   Dales NA,  Gould AE,  Brown  JA,  Calderwood EF,  Guan B, Minor  CA,  Gavin  JM, 

Hales P, Kaushik VK, Stewart M, Tummino PJ, Vickers CS, Ocain TD and Patane 

MA.  Substrate‐based  design  of  the  first  class  of  angiotensin‐converting 

enzyme‐related  carboxypeptidase  (ACE2)  inhibitors.  J  Am  Chem  Soc  124: 

11852‐11853, 2002. 

  8.   De Mello WC. Angiotensin  (1‐7)  re‐establishes  impulse  conduction  in  cardiac 

muscle  during  ischaemia‐reperfusion.  The  role  of  the  sodium  pump.  J Renin 

Angiotensin Aldosterone Syst 5: 203‐208, 2004. 

  9.   Erdos  EG,  Jackman  HL,  Brovkovych  V,  Tan  F  and  Deddish  PA.  Products  of 

angiotensin  I  hydrolysis  by  human  cardiac  enzymes  potentiate  bradykinin.  J 

Mol Cell Cardiol 34: 1569‐1576, 2002. 

 10.   Faria‐Silva R, Duarte FV and Santos RA. Short‐term angiotensin(1‐7) receptor 

MAS  stimulation  improves  endothelial  function  in  normotensive  rats. 

Hypertension 46: 948‐952, 2005. 

 11.   Fedak  PW,  Moravec  CS,  McCarthy  PM,  Altamentova  SM, Wong  AP,  Skrtic  M, 

Verma  S,  Weisel  RD  and  Li  RK.  Altered  expression  of  disintegrin 

102

metalloproteinases  and  their  inhibitor  in  human  dilated  cardiomyopathy. 

Circulation 113: 238‐245, 2006. 

 12.   Ferrario CM, Jessup J, Chappell MC, Averill DB, Brosnihan KB, Tallant EA, Diz DI 

and  Gallagher  PE.  Effect  of  angiotensin‐converting  enzyme  inhibition  and 

angiotensin  II receptor blockers on cardiac angiotensin‐converting enzyme 2. 

Circulation 111: 2605‐2610, 2005. 

 13.   Ferrario CM,  Jessup  J, Gallagher PE, Averill DB, Brosnihan KB, Ann TE,  Smith 

RD  and  Chappell  MC.  Effects  of  renin‐angiotensin  system  blockade  on  renal 

angiotensin‐(1‐7)  forming  enzymes and  receptors. Kidney  Int  68: 2189‐2196, 

2005. 

 14.   Ferrario CM, Trask AJ  and  Jessup  JA. Advances  in biochemical  and  functional 

roles of angiotensin‐converting enzyme 2 and angiotensin‐(1‐7)  in regulation 

of cardiovascular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol 289: H2281‐H2290, 

2005. 

 15.   Gallagher PE, Chappell MC, Ferrario CM and Tallant EA. Distinct roles for ANG 

II and ANG‐(1‐7)  in  the  regulation of angiotensin‐converting enzyme 2  in  rat 

astrocytes. Am J Physiol Cell Physiol 290: C420‐C426, 2006. 

 16.   Goulter AB, Goddard MJ, Allen  JC  and Clark KL. ACE2  gene  expression  is  up‐

regulated in the human failing heart. BMC Med 2: 19, 2004. 

103

 17.   Grobe  JL,  Mecca  AP,  Mao  H  and  Katovich  MJ.  Chronic  angiotensin‐(1‐7) 

prevents  cardiac  fibrosis  in  DOCA‐salt  model  of  hypertension.  Am  J  Physiol 

Heart Circ Physiol 290: H2417‐H2423, 2006. 

 18.   Huentelman  MJ,  Zubcevic  J,  Katovich  MJ  and  Raizada  MK.  Cloning  and 

characterization of a secreted form of angiotensin‐converting enzyme 2. Regul 

Pept 122: 61‐67, 2004. 

 19.   Jessup  JA,  Gallagher  PE  Chappell  MC  Ferrario  CM.  Impaired  Counter‐

Regulatory  Response  of  Angiotensin  Converting  Enzyme 

2  (ACE2)  and  Angiotensin‐(1–7)  [Ang‐(1–7)]  in  the  Heart  of  a  New 

Congenic  Model  of  Hypertension  Derived  from  [mRen2]27  Transgenic  Rats. 

Hypertension 48(4), e74‐e75. 2006. Abstract. 

 20.   Lambert DW, Yarski M, Warner FJ, Thornhill P, Parkin ET, Smith AI, Hooper NM 

and  Turner  AJ.  Tumor  necrosis  factor‐alpha  convertase  (ADAM17)  mediates 

regulated  ectodomain  shedding  of  the  severe‐acute  respiratory  syndrome‐

coronavirus  (SARS‐CoV) receptor, angiotensin‐converting enzyme‐2 (ACE2).  J 

Biol Chem 280: 30113‐30119, 2005. 

 21.   Neves LA, Almeida AP, Khosla MC and Santos RA. Metabolism of angiotensin I 

in  isolated  rat  hearts.  Effect  of  angiotensin  converting  enzyme  inhibitors. 

Biochem Pharmacol 50: 1451‐1459, 1995. 

104

 22.   Newton, Steven J. Tallant E. Ann Chappell Mark C. Ferrario Carlos M. Gallagher 

Patricial E. Evidence of a Secreted and Active Form of ACE2  in  Cerebrospinal 

Fluid. Hypertension 46, 875‐887. 2005. Abstract. 

 23.   Santos  RA,  Castro  CH,  Gava  E,  Pinheiro  SV,  Almeida  AP,  Paula  RD,  Cruz  JS, 

Ramos AS, Rosa KT,  Irigoyen MC, Bader M, Alenina N, Kitten GT and Ferreira 

AJ.  Impairment  of  in  vitro  and  in  vivo  heart  function  in  angiotensin‐(1‐7) 

receptor MAS knockout mice. Hypertension 47: 996‐1002, 2006. 

 24.   Santos RA, Ferreira AJ, Nadu AP, Braga AN, de Almeida AP, Campagnole‐Santos 

MJ,  Baltatu  O,  Iliescu  R,  Reudelhuber  TL  and  Bader  M.  Expression  of  an 

angiotensin‐(1‐7)‐producing  fusion  protein  produces  cardioprotective  effects 

in rats. Physiol Genomics 17: 292‐299, 2004. 

 25.   Satoh M, Nakamura M, Saitoh H, Satoh H, Maesawa C, Segawa I, Tashiro A and 

Hiramori  K.  Tumor  necrosis  factor‐alpha‐converting  enzyme  and  tumor 

necrosis factor‐alpha in human dilated cardiomyopathy. Circulation 99: 3260‐

3265, 1999. 

 26.   Shaltout HA, Westwood BM, Averill DB, Ferrario CM, Figueroa JP, Diz DI, Rose 

JC and Chappell MC. Angiotensin metabolism in renal proximal tubules, urine, 

and serum of sheep: evidence for ACE2‐dependent processing of angiotensin II. 

Am J Physiol Renal Physiol 292: F82‐F91, 2007. 

105

 27.   Tallant EA, Ferrario CM and Gallagher PE. Angiotensin‐(1‐7) inhibits growth of 

cardiac myocytes  through  activation  of  the mas  receptor.  Am  J Physiol Heart 

Circ Physiol 289: H1560‐H1566, 2005. 

 28.   Warner  FJ,  Lew  RA,  Smith  AI,  Lambert  DW,  Hooper  NM  and  Turner  AJ. 

Angiotensin‐converting  enzyme  2  (ACE2),  but  not  ACE,  is  preferentially 

localized to the apical surface of polarized kidney cells. J Biol Chem 280: 39353‐

39362, 2005. 

 29.   Wilk S. Prolyl endopeptidase. Life Sci 33: 2149‐2157, 1983. 

 30.   Zhong JC, Huang DY, Yang YM, Li YF, Liu GF, Song XH and Du K. Upregulation of 

angiotensin‐converting  enzyme  2  by  all‐trans  retinoic  acid  in  spontaneously 

hypertensive rats. Hypertension 44: 907‐912, 2004. 

 31.   Zisman  LS,  Keller  RS, Weaver  B,  Lin Q,  Speth R,  Bristow MR  and  Canver  CC. 

Increased angiotensin‐(1‐7)‐forming activity in failing human heart ventricles: 

evidence  for  upregulation  of  the  angiotensin‐converting  enzyme  Homologue 

ACE2. Circulation 108: 1707‐1712, 2003. 

 32.   Zisman LS, Meixell GE, Bristow MR and Canver CC. Angiotensin‐(1‐7) formation 

in the  intact human heart:  in vivo dependence on angiotensin II as substrate. 

Circulation 108: 1679‐1681, 2003. 

 

106

Figure V.1.  Ang II degradation was not different between Tg(‐) hearts (n=10, 

Graph A) and Tg(+) hearts  (n=7, Graph B) over  the course of  the recirculation (P > 

0.05), and ACE2 inhibition had no effect on the decay of recirculating Ang II in either 

strain (P > 0.05).   

       

       

 

 

 

107

 

 FIGURE V.1 

108

Figure V.2.  Ang‐(1‐7) formation from Ang II measured by RIA in Tg(‐) (n=10, 

Graph  A)  and  Tg(+)  (n=7,  Graph  B)  hearts.  Ang‐(1‐7)  production  from  Ang  II  was 

significant from baseline values (represented at time=0)  in both the Tg(‐) and Tg(+) 

rat  strains, however  there was no difference  in Ang‐(1‐7) generation between  the 

two  strains.    The  Tg(‐)  hearts  that  received  the  ACE2  inhibitor  at  15  minutes 

exhibited  no  significant  reduction  of  Ang‐(1‐7)  generation  at  30 minutes,  but  the 

Tg(+)  Ang‐(1‐7)  production  at  30  minutes  decreased  by  54.7%.    ACE2  inhibition 

reduced Ang‐(1‐7) levels by 83.1% (57.3 ± 18.6 pM, P < 0.01) in the Tg(+) hearts at 

60 minutes but had no significant effect in the Tg(‐) hearts.  * P < 0.05 vs. baseline, ** P 

< 0.001 vs. baseline, † P < 0.05 vs. respective control times, †† P < 0.01 vs. respective 

control times. 

109

 FIGURE V.2 

 

110

Figure V.3.   HPLC/RIA  analysis  of  immunoreactive  Ang‐(1‐7)  in  the  heart 

perfusate.   Panel A:  immunoreactive peaks  corresponding  to Ang‐(1‐7) and Ang  II 

following perfusion of the heart with exogenous Ang II.   Panel B:    immunoreactive 

peak  of  Ang  II  in  the  perfusate  buffer  containing  Ang  II.    Panel  C:    absence  of 

immunoreactive peaks in the perfusion buffer alone.  

 

111

 

FIGURE V.3  

 

112

  Figure  V.4.    Representative  chromatographs  of  cardiac  perfusate 

demonstrates  that  125I‐Ang‐(1‐7)  formation  from  125I‐Ang  II was  abolished  by  the 

ACE2  inhibitor  MLN‐4760  in  both  the  Tg(‐)  (Panel  A)  and  Tg(+)  (Panel  B)  cardiac 

effluent.    sACE2  activity  was  significantly  higher  in  the  Tg(+)  perfusate  when 

compared  to  the  normal  Tg(‐)  perfusate  (Tg(+):  1.97  ±  0.26  fmol/mL/min  vs.  Tg(‐): 

0.82 ± 0.19 fmol/mL/min, P < 0.05). 

113

 FIGURE V.4 

 

114

Figure V.5.    ACE2  immunoblots  reveals  an  80  kDa  protein  in  the  cardiac 

effluent collected at the end of the 60‐minute recirculation period.   Panels A and B 

are  the  Tg(‐)  and  Tg(+)  concentrated  perfusates,  respectively.    Panels  C  and  D  are 

immunoblots blocked with the immunogenic ACE2 peptide.  Lane 1, Magic Markers; 

Lane 2, ACE2  standard  (20 ng);  Lanes 3, 4,  and 5,  cardiac perfusate  (25 μL).   The 

arrow indicates the 120 kDa ACE2 standard.  

115

 

FIGURE V.5  

116

CHAPTER VI  

DISRUPTION OF CARDIAC ANGIOTENSIN PEPTIDES BY ANGIOTENSIN CONVERTING ENZYME 2 INHIBITION EXACERBATES CARDIAC HYPERTROPHY 

INAND FIBROSIS   REN­2 HYPERTENSIVE RATS  

Aaron J. Trask1,2, Leanne Groban2,3, Brian M. Westwood1, Jasmina Varagic1,2, Detlev Ganten4, Patricia E. Gallagher1,2, Mark C. Chappell1,2, Carlos M. Ferrario1,2 

   

1Hypert Center ension and Vascular Research 2D y epartment of Physiology and Pharmacolog

Wake icine 3Department of Anesthesiology  Forest Universi y School of MedWinston‐Salem, North Carolina 

t

 AND  

niversity MediciBerlin, Germany 

4Charité‐U ne Berlin 

   [This chapter will be submitted to Hypertension for publication.  Differences in formatting reflect  the requirements of  the  journal.   Aaron  J. Trask prepared the manuscript, while Dr. Carlos M. Ferrario acted in an editorial and advisory capacity.  Dr. Detlev Ganten provided the animal model used in these studies.  Drs. Groban and Varagic provided assistance with the cardiac function studies, and  Brian Westwood  and  Drs.  Gallagher  and  Chappell  provided  assistance with the molecular and biochemical experiments outlined in this manuscript.]  

117

VI.1  ABSTRACT 

Emerging  evidence  suggests  that  cardiac  angiotensin  converting  enzyme  2 

(ACE2) may contribute to the regulation of heart function and hypertension‐induced 

remodeling.    We  tested  the  hypothesis  that  inhibition  of  ACE2  in  the  hearts  of 

(mRen2)27  hypertensive  rats  may  accelerate  progression  of  cardiac  hypertrophy 

and fibrosis by preventing conversion of angiotensin II (Ang II) into the anti‐fibrotic 

peptide,  angiotensin‐(1‐7)  [Ang‐(1‐7)].    Fourteen  male  (mRen2)27  transgenic 

hypertensive rats (12 weeks old, 401 ± 7 g) were administered either vehicle (0.9% 

saline)  or  the ACE2  inhibitor, MLN‐4760,  subcutaneously  via mini‐osmotic pumps 

for 28 days (30 mg/kg/day).   Chronic administration of the ACE2 inhibitor had no 

effect  on  average  24  h  blood  pressure  throughout  the  experiment  as  assessed  by 

radiotelemetry  probes.    In  contrast,  left  ventricular  (LV)  Ang  II  content  was 

significantly augmented by 24% in rats chronically treated with the ACE2 inhibitor.  

Chronic ACE2 inhibition had no effect on plasma Ang II or Ang‐(1‐7) levels, although 

it  did  reduce  cardiac  Ang‐(1‐7)/Ang  II  by  28%.    The  imbalance  in  cardiac  Ang 

peptides was associated with significant increases in both LV anterior and posterior 

wall  thicknesses,  as  well  as  interstitial  collagen  fraction  area  and  cardiomyocyte 

hypertrophy in the transgenic animals chronically treated with the ACE2 inhibitor.  

Despite  these  biochemical  and  structural  changes  observed with  ACE2  inhibition, 

cardiac function was preserved.  These studies show that chronic inhibition of ACE2 

causes an accumulation of cardiac Ang II,  imparting an imbalance in cardiac Ang II 

and  Ang‐(1‐7),  which  exacerbates  cardiac  hypertrophy  and  fibrosis  without 

affecting blood pressure or cardiac function. 

118

Key Words:  angiotensin  II,  angiotensin‐(1‐7),  angiotensin  converting  enzyme  2, cardiac hypertrophy 

119

V INTRODUCTION 

  According  to  the most  recent  Causes  of Death Report  from  the  Centers  for 

Disease  Control,  heart  disease  continues  to  account  for  the  most  deaths  in  the 

United States,

I.2 

1  and an alarming  report  from  the World Health Organization  states 

that cardiovascular disease, including heart disease, is the leading cause of mortality 

worldwide.2  Hypertension and cardiac hypertrophy are two of the most critical risk 

factors contributing to heart disease,3 and the involvement of the renin‐angiotensin 

system  (RAS)  to  the  pathophysiology  of  hypertension  and  cardiac  hypertrophy  is 

undisputed.4, 5  Undeniably, enhanced activity of the mitogenic and pressor peptide, 

angiotensin  (Ang)  II,  causes  elevations  in  blood  pressure  and  contributes 

significantly to the development of cardiac hypertrophy and fibrosis.6‐8 

Contrary  to  the  actions  of  Ang  II  on  the  cardiovascular  system,  Ang‐(1‐7) 

elicits  actions  that  oppose  those  of  the  octapeptide,9‐13  lending  to  our  continuing 

hypothesis  that  Ang‐(1‐7)  acts  to  counter‐balance  the  deleterious  actions  of 

increased Ang  II  in pathological states.14    In support of  this, newer studies show a 

compensatory  action  of  Ang‐(1‐7)  as  an  anti‐proliferative,  anti‐fibrotic,  and  anti‐

hypertrophic  agent  in  the  heart.15‐19    These  Ang‐(1‐7)  properties  correct  cardiac 

functional deficits induced by myocardial ischemia.20‐23 

An emerging key to the regulation of the balance of Ang II and Ang‐(1‐7) in 

the heart is angiotensin converting enzyme 2 (ACE2).  This enzyme was identified as 

a critical regulator of cardiac function because ACE2 knockout mice exhibited severe 

cardiac dysfunction that was associated with thinning of the left ventricular wall.24  

ACE2  was  discovered  by  two  independent  laboratories,25,  26  and  Vickers  et  al.27 

120

demonstrated  that  ACE2  hydrolyzes  Ang  II  into  Ang‐(1‐7)  with  high  efficiency.  

These studies suggested to us that ACE2 may limit the effects of Ang II by facilitating 

its  conversion  to  the  anti‐hypertrophic  peptide,  Ang‐(1‐7).14    Moreover,  previous 

studies from our laboratory showed a dependence on ACE2 for the cardiac Ang‐(1‐

7) production from Ang II in Ren‐2 hypertensive rats.28  Studies investigating the in 

vivo  importance  of  ACE2  on  the  heart  have  largely  involved  genetic  knock‐out 

mice,24, 29, 30 the results of which may have been dependent upon genetic differences 

in  the  background  strains  used  in  those  studies.31    Furthermore,  ACE2 

overexpression  in  the  heart  reversed  cardiac  hypertrophy  and  fibrosis.32‐35    In 

previous  studies,  no  attempt  was  made  to  directly  assess  the  effects  of  ACE2 

inhibition or overexpression on plasma and cardiac  levels of angiotensin peptides.  

Therefore, this study sought to determine whether blockade of endogenous ACE2 in 

the Ren‐2 hypertensive rat would shift the balance of cardiac Ang II and Ang‐(1‐7) 

towards the pressor Ang II, and to determine whether this shift was associated with 

tructural and functional changes within the myocardium.   s

 

VI.3  ALS AND METHODS MATERI

  Animals 

  Fourteen  male  hemizygous  (mRen2)27  transgenic  hypertensive  rats  were 

obtained  from  the  colony maintained at  the Wake Forest University Hypertension 

and Vascular Research Center (Winston‐Salem, NC).  All animals were housed paired 

in cages until 10 weeks of age  (12‐hour  light/dark cycle)  in an AAALAC‐approved 

facility with ad  libitum  access  to  rat  chow and  reverse osmosis  (RO) water.   After 

121

this time, all rats were housed singly for continuous monitoring of arterial pressure 

and heart rate using radiotelemetry probes implant at 10 weeks of age (see methods 

below).    Procedures  were  approved  by  our  institutional  Animal  Care  and  Use 

Committee. 

Pr  Radiotelemetry  ocedure 

  Radiotelemetry  probes  (Model  PhysioTel  PA‐C40,  Data  Sciences 

International,  St.  Paul,  MN)  were  implanted  in  14  ten‐week  old  (mRen2)27 

transgenic  rats  using  aseptic  surgical  techniques  in  animals  anesthetized  with 

isoflurane (2%) and given atropine sulfate (intramuscular, 0.12 mg).    Immediately 

prior to probe implantation, animals were medicated with ampicillin (subcutaneous, 

150 mg/kg),  and  buprenorphine  (subcutaneous,  0.05 mg/kg).    Body  temperature 

was monitored  using  a  rectal  probe  and maintained  at  37°C.    The  abdomen was 

opened and the catheter tip of the radiotelemetry probe was inserted into the aorta 

just  superior  to  the  iliac  arteries  using  an  angled‐tip  23‐guage  needle  as  an 

introducer.   A Dacron patch was slipped around the insertion site, and VetBond (< 

5μL)  was  used  to  seal  the  catheter  in  the  aorta.    The  radiotelemetry  transmitter 

attached to the catheter was secured to the abdominal muscle using 3‐0 silk suture 

during closure.   The skin was closed using a  cruciate knot with 4‐0 stainless steel 

suture.  Animals were monitored for ambulation and were allowed to recover from 

surgery for 14 days prior to the commencement of treatment.   Blood pressure and 

heart  rate  data  were  acquired  every  15  minutes  continuously  until  the  end  of 

treatment using Dataquest A.R.T. 4.1 software (Data Sciences International, St. Paul, 

MN). 

122

  Experimental Protocol 

  Fourteen  days  after  the  radiotelemetry  probe  implant,  (mRen2)27 

hypertensive  rats  (401  ±  7  g) were  randomly  divided  into  two  treatment  groups: 

one  group  (n  =  7)  received  vehicle  (0.9%  saline  subcutaneously)  and  the  other 

group  (n  =  7)  was  administered  the  ACE2  inhibitor,  MLN‐4760  (30  mg/kg/day 

subcutaneously)  via Alzet mini  osmotic  pumps  (Durect  Corporation, Model  2ML4, 

Cupertino,  CA)  implanted  in  the  rats  for  28  days.    Previous  studies  showed  that 

MLN‐4760 specifically inhibits ACE228, 36 and that in vivo treatment at a similar dose 

gnificant renal hypertrophy in diabetic mice.and duration resulted in si

 

37 

Echocardiography 

Echocardiography  was  performed  by  an  experienced  echocardiographer 

(L.G.) who was blinded from the treatment groups.  After 28 days of treatment, the 

rats  were  lightly  anesthetized  with  isoflurane  (2%)  via  a  nose  cone  during 

spontaneous  ventilation.    Animals  were  imaged  in  a  shallow  left  lateral  supine 

position using a 12 MHz phased‐array transducer and Philips 5500 (Philips Medical 

Systems,  Bothell, WA)  sector  scanner.    Real‐time  images were  stored  digitally  for 

subsequent  offline  analysis.    In  short‐axis  views,  using  2‐D  and  M‐mode  images, 

anterior  (AWTd)  and  posterior  wall  thicknesses  (PWTd)  during  diastole,  end‐

systolic  (ESDd)  and  end‐diastolic  dimensions  (EDDd)  during  diastole,  and  % 

fractional shortening (FS) were measured and averaged from 5 cardiac cycles.  2‐D 

guided pulsed‐wave Doppler spectra of mitral inflow were recorded from an apical 

4‐chamber  view.    Tissue  Doppler,  an  index  of  diastolic  function  that  is  relatively 

insensitive  to  the  effects  of  heart  rate  and  preload,38 was  also  obtained  using  the 

123

Philips 5500 scanner.  Transmitral and tissue Doppler imaging were obtained from 

the  apical  4‐chamber  view  to  assess  early  left  ventricular  filling  and  septal mitral 

annular velocities, respectively.   The following Doppler parameters were obtained: 

E  =  transmitral  early  filling  velocity  (cm/sec)  e′  =  early  mitral  annular  descent 

(cm/sec), and E/e′ = transmitral early filling to mitral annular descent ratio, which 

is  an  index  of  left  ventricular  filling  pressure.    All  data  were  averaged  from  5 

consecutive cardiac cycles.  

  Pressure‐Volume Loop Assessment of Cardiac Function 

Direct  hemodynamic  measures  of  cardiac  function  were  performed 

immediately  following  echocardiographic  analysis  as  previously  described.39‐41  

During  the  experiment,  animals  were  continued  on  isoflurane  anesthesia  (2%) 

followed by  tracheotomy and respired with a positive‐pressure respirator with an 

air/O2  mixture  (75%/25%).    The  right  jugular  vein  was  cannulated  for  fluid 

administration  and a 2F  combined  conductance  catheter‐micromanometer  (Model 

SPR‐869,  Millar  Instruments,  Houston,  TX)  connected  to  a  pressure‐conductance 

unit (MPVS 300, Millar Instruments, Houston, TX) was inserted into the right carotid 

artery  and  advanced  into  the  left  ventricle.    The  left  femoral  artery  was  also 

cannulated with a 1.4F cathether tip pressure transducer to monitor blood pressure 

simultaneously  (Model  SPR‐671,  Millar  Instruments,  Houston,  TX).    Pressure‐

volume  loops  were  recorded  off  the  ventilator  for  ≤10  seconds  at  baseline  and 

during  unloading  by  gently  occluding  the  inferior  vena  cava  with  a  cotton  swab.  

Parallel  conductance  from  surrounding  structures  was  calculated  by  injecting  a 

small bolus (100 μL) of hypertonic NaCl through the heart via the jugular vein.  Data 

124

was  acquired  and  analyzed  using  iox2  (version  2.4)  data  acquisition  and  analysis 

software (emka TECHNOLOGIES USA, Falls Church, VA).  The following parameters 

were  obtained:  end‐systolic  pressure  (ESP),  end‐diastolic  pressure  (EDP),  end‐

systolic  volume  (ESV),  end‐diastolic  volume  (EDV),  stroke  volume  (SV), maximum 

and minimum dP/dt  (±dP/dt),  tau  (τ),  end‐systolic PV  relation  (ESPVR),  and end‐

diastoli . c PV relation (EDPVR)

Biochemical Analyses 

Immediately  following  the  cardiac  catheterization,  blood  was  collected  in 

pre‐chilled  tubes  containing peptidase  inhibitors  (25 mmol/L EDTA, 0.44 mmol/L 

1,2‐orthophenanthrolene  monohydrate,  1  mmol/L  sodium  para‐chloro‐

mercuribenzoate  (PCMB),  and  3  µmol/L  of  the  rat  renin  inhibitor,  WFML‐1)  as 

described  by  us  previously.42,  43    Blood  cells  were  isolated  by  centrifugation  at 

3,000g  for  20  minutes,  and  aliquots  of  plasma  were  stored  at  ‐80°C  until 

radioimmunoassay (RIA) measurements.  Left ventricular (LV) tissues were rapidly 

collected and snap frozen in liquid N2 and stored at ‐80°C until assayed.  Angiotensin 

peptides  were  extracted  from  the  plasma  and  tissue  samples  using  C18  Sep  Pak 

columns (Waters, Milford, MA), and the eluate was analyzed by RIA for Ang II and 

Ang‐(1–7) as described.42, 43  The minimum detectable limits of the Ang II and Ang‐

(1‐7)  assays  were  0.8  pg/mL  and  2.5  pg/mL,  respectively.    The  intra‐  and  inter‐

assay coefficients of variability were 12% and 22% for Ang II, and 8% and 20% for 

Ang‐(1‐7), respectively. 

 

 

125

  Histology 

  A cross‐section of the heart was collected at the end of treatment and placed 

in  4%  paraformaldehyde  for  24  hours,  after  which  the  tissue  was  transferred  to 

70%  ethanol  until  paraffin  embedding  for  histological  analysis.    Picrosirius  red 

staining  was  performed  as  modified  from  Junqueira  et  al.44    Briefly,  4  μm  heart 

sections  were  deparaffinized  and  rehydrated  prior  to  placement  in  filtered  0.1% 

picrosirius red  for 60 minutes.    Sections were washed  twice  in  0.5% glacial acetic 

acid, dehydrated, cleared, and mounted.   Eight  interstitial and perivascular  images 

(200x) per section were captured under both bright field and polarized light using 

Spot  Advanced  software  4.0.9  (Diagnostic  Instruments,  Inc.,  Sterling  Heights,  MI) 

connected  to an Olympus BX60 microscope (Olympus America,  Inc., Center Valley, 

PA).  The polarized RGB color images were converted to grayscale and analyzed by a 

blinded  individual  for  both  interstitial  and  perivascular  collagen  using  Adobe 

Photoshop CS2 (Adobe Systems, San Jose, CA).  Hematoxylin and eosin staining was 

also performed using standard methods.   Briefly, LV sections were deparaffinized, 

rehydrated and stained with Hematoxylin  for 5 minutes.   After a quick dip  in acid 

alcohol  (0.5%  HCl  in  70%  ethanol),  sections  were  rinsed  in  water  and  placed  in 

eosin  for  2  minutes.    Sections  were  dehydrated,  cleared  and  mounted.    100 

cardiomyocytes from each section (25 from each of LV anterior wall, posterior wall, 

free wall and septum) were analyzed by a blinded individual at 400x magnification 

using Simple PCI 6.0 software (Hamamatsu Corporation, Sewickley, PA) connected 

to a Leica DM4000B microscope (Leica Microsystems, Bannockburn, IL) for myocyte 

cross‐sectional area (mCSA).   

126

  Statistical Analyses 

  All data are expressed as mean ± SEM.   All  statistics were performed using 

GraphPad Prism 5.01 software (GraphPad Software, La  Jolla, CA).   Radiotelemetric 

data  was  analyzed  using  a  2‐way  ANOVA  to  determine  differences  between 

treatments and over time at a probability < 0.05.  All other data was analyzed using 

a  student’s  t‐test  at  a  probability  <  0.05.    For  the  RIAs,  values  at  or  below  the 

detectable limits were assigned those values for statistical purposes.     

 

VI.4  RESULTS 

  Body  weights  were  not  different  between  Vehicle‐  and  ACE2  inhibitor‐

treated Ren‐2 rats at the end of treatment (Vehicle: 504 ± 10 g vs. MLN‐4760: 507 ± 

6  g,  p  >  0.05).    Administration  of  the  ACE2  inhibitor  in  Ren‐2  rats  did  not  alter 

systolic,  diastolic,  mean  arterial,  or  pulse  pressures  at  the  end  of  the  four‐week 

treatment  (Figure  VI.1  and  Table  VI.1).    ACE2  inhibition  for  28  days  was 

accompanied by mild tachycardia (Figure VI.1 and Table VI.1, p < 0.05).   

Circulating plasma Ang II and Ang‐(1‐7) concentrations did not change in the 

animals  chronically  treated  with  the  ACE2  inhibitor  (Figure  VI.2,  Left,  p  >  0.05).  

However, an augmentation in cardiac Ang II (Figure VI.2, Right, p < 0.01) was found 

in  the  ACE2‐inhibitor‐treated  animals.    Cardiac  Ang‐(1‐7)  concentrations  did  not 

change (Figure VI.2, Right, p > 0.05).  Administration of the ACE2 inhibitor did reveal 

a significant reduction in the Ang‐(1‐7)/Ang II ratio (Figure VI.2, Bottom Right, p < 

0.05), a finding that was not observed in the circulation (Figure VI.2, Bottom Left, p 

127

> 0.05).    These data  indicate  that ACE2 blockade  imparts  an  imbalance  in  cardiac 

angiotensin peptides independent of the circulation. 

Because  treatment with  the  ACE2  inhibitor  resulted  in  an  accumulation  of 

cardiac Ang II, heart sections were stained for collagen using picrosirius red.  ACE2 

blockade  resulted  in  a  significant  elevation  in  interstitial  collagen  fraction  area 

(Figure  VI.3,  Left,  p  <  0.05),  but  the  perivascular  collagen/lumen  ratio  was 

unchanged (Figure VI.3, Right, p > 0.05).   Likewise, the administration of the ACE2 

inhibitor resulted in an increase in cardiomyocyte cross‐sectional area (Figure VI.4, 

p < 0.01). 

Echocardiographic  analysis  of  heart  structure  and  function  revealed 

significant increases in both anterior and posterior wall thicknesses during diastole 

in  the  animals  chronically  treated  with  the  ACE2  inhibitor,  while  all  other 

echocardiographic  indices  of  cardiac  function  were  preserved  (Table  VI.2).   

Moreover, cardiac function as measured by direct cardiac catheterization revealed a 

tendency  for  increased  intra‐cardiac  pressures  associated  with  MLN‐4760 

treatment, although the  increases  in ESP and EDP were not statistically significant 

(Table VI.2; p = 0.15 and 0.10, respectively).  Other indices of direct cardiac function 

were unchanged between vehicle‐ and MLN‐4760‐treated Ren‐2 rats (Table VI.2 and 

Figure VI.5).   

 

V DISCUSSION 

  The current study documents for the first time a contribution of endogenous 

cardiac ACE2  to  the  regulation of  tissue and plasma concentrations of angiotensin 

I.5 

128

peptides  and  their  resultant  actions  on  cardiac  structure  and  function.    Chronic 

ACE2  blockade  in  (mRen2)27  hypertensive  rats  resulted  in  a  significant  24% 

augmentation  in  cardiac Ang  II, with  associated  elevations  in  LV wall  thickness,  a 

17% increase in the cardiac interstitial collagen fraction area, and a 26% increase in 

cardiomyocyte  cross‐sectional  area.    Although  cardiac  function  was  preserved 

between  the  two  groups,  the  observed  biochemical  and  structural  abnormalities 

were independent of changes in blood pressure.  The 28% reduction of the Ang‐(1‐

7)/Ang II ratio in the MLN‐4760‐treated rats suggests that cardiac ACE2 contributes 

significantly to the balance of cardiac Ang II and Ang‐(1‐7).   

Our  approach  in  studying  the  critical  importance  of  myocardial  ACE2  in 

regulating cardiac structure and  function differs  from currently published reports.  

While other studies investigating the role of ACE2 in the heart have utilized genetic 

knock‐out or overexpression techniques, our current study aimed to investigate the 

role of native, endogenous cardiac ACE2  in the regulation of cardiac structure and 

function and document the effects of ACE2 inhibition on cardiac Ang II and Ang‐(1‐

7).  However, our data are in agreement with previous studies that show a reduction 

in cardiac fibrosis and hypertrophy as a result of cardiac ACE2 overexpression32‐35 

or vent n n n C c uricular e largeme t i  the A E2 kno ko t mice.24, 30 

Genetic  ablation  of  ACE2  results  in  increased  cardiac  Ang  II24,  30  and 

enhanced oxidative  stress.45   The deleterious  actions of  elevated  cardiac Ang  II  as 

observed  in  our  study  on  structure  and  function  are  well  documented.    Ang  II 

promotes  cardiac  fibrosis  and  hypertrophy,6‐8,  46  possibly  mediated  in  part  by 

elevated oxidative stress,47 whereas cardiac Ang‐(1‐7) reverses cardiac fibrosis and 

129

hypertrophy.16‐19  Studies by us19 and others48 have shown that the anti‐fibrotic and 

anti‐hypertrophic  actions  of  Ang‐(1‐7)  are  mediated  by  its  binding  to  the  Mas 

receptor.   Moreover,  studies  are emerging  that Ang‐(1‐7) or ACE2 overexpression 

mitigates the Ang II‐induced hypertrophic response.  Grobe et al.17 showed that 100 

ng/kg/min of Ang‐(1‐7) administration prevented cardiac fibrosis induced by Ang II 

in Sprague‐Dawley rats.  Likewise, cardiac ACE2 overexpression in Sprague‐Dawley 

rats protected hearts from Ang II‐induced cardiac hypertrophy.35  Additionally, Loot 

et  al.23  showed  that  chronic  administration  of  Ang‐(1‐7)  two  weeks  after  the 

induction  of myocardial  infarction  in  rats  preserved  cardiac  function.    Finally,  the 

alteration in cardiac Ang II in our study was independent of the circulating system, 

as plasma Ang II and Ang‐(1‐7) remained unchanged in response to ACE2 blockade.  

This finding adds to the growing body of evidence supporting tissue RAS regulation, 

independent or inter‐dependent, upon the circulating system.   Shifting the balance 

of  these  two  regulatory  Ang  peptides  toward  the mitogen  Ang  II  has  deleterious 

actions on the myocardium.   

Because cardiac fibrosis and hypertrophy are associated with impairments in 

diastolic  function  resulting  from a  stiffening of  the myocardium,49 we  expected  to 

find worsening diastolic performance in the rats chronically treated with the ACE2 

inhibitor.    Although  we  found  significant  exaggerated  structural  changes  in  the 

hearts of Ren‐2 rats chronically treated with the ACE2 inhibitor, we did not observe 

any  overt  functional  deficits.    While  the  direction  of  change  for  many  of  our 

functional  parameters  were  consistent  with  diastolic  dysfunction  (Emax,  e′,  ESP, 

EDP), the insignificant elevation in end‐diastolic pressure in the MLN‐4760‐treated 

130

rats was the only close trend of any further diastolic impairment in the Ren‐2 rats.  

Cardiac  hypertrophy  is  a  pre‐existing  compensatory  response  observed  in  the 

concentric  hypertrophic  hearts  of  Ren‐2  rats  as  shown  both  in  our28  and  other 

laboratories.39,  50   However, global  cardiac  function  in  the hypertrophied hearts  of 

the  (mRen2)27  strain  remains  normal  or  slightly  improved  when  compared  to 

normal  age‐matched  Sprague‐Dawley  rats  at  18  weeks  of  age.39    In  our  current 

study,  the mild elevation  in heart  rate  in  the absence of cardiac  functional deficits 

after four weeks of ACE2 blockade suggest that the Ren‐2 hearts are still in a state of 

compensated  hypertrophy.    While  ACE2  inhibition  had  a  significant  impact  on 

cardiac  Ang  peptides  and  their  ratios,  it  may  not  have  been  sufficient  to  reach  a 

tipping point transitioning from compensated hypertrophy to diastolic dysfunction 

and then to overt heart failure.  Although isoflurane is a well‐accepted choice for the 

study of cardiac function due to its ease of use and control,41 Janssen et al.51 showed 

that  isoflurane  suppressed  cardiac  output  and  heart  rate  in  rodents,  although  its 

cardio‐suppressive  actions  were  relatively  less  than  those  of  other  anesthetic 

agents.    Therefore,  a  mild  suppression  in  cardiac  function  due  to  isoflurane may 

have  also  hindered  our  ability  to  discern minor  changes  in  cardiac  function  as  a 

result of ACE2 blockade. 

Although beyond the scope of this study, it is important to mention that ACE2 

can  act  on  other  substrates  affecting  cardiac  function.    Apelin  can  impart 

cardioprotective  actions  on  the  heart,52  and  ACE2  has  been  shown  to  inactivate 

apelin by cleaving the C‐terminal phenylalanine27 that is required for its binding to 

the  APJ  receptor  and  physiological  responses.53,  54    Chronic  pharmacological 

131

blockade  of  ACE2  in  our  study  may  have  caused  an  additional  accumulation  of 

apelin, which may compensate for some of the cardiac functional parameters in our 

study.    Alternatively,  ACE2  overexpression  has  also  been  shown  to  downregulate 

connexins 40 and 43,55 which are necessary  for normal gap  junction  function and 

electrical  conduction  in  the  heart.    Therefore,  a  reduction  in  ACE2  may  have 

improved  electrical  conductance,  although  we  did  not  observe  any  alterations  in 

cardiac contractility in our current study.  The ultimate role of apelin and connexins 

as they relate to ACE2 remain to be clarified.   

In conclusion, we show here that chronic ACE2 blockade imparts a significant 

accumulation of cardiac Ang II, resulting in an imbalance in the two known bioactive 

Ang  peptides,  Ang  II  and  Ang‐(1‐7).    The  accumulation  of  myocardial  Ang  II  in 

response  to  ACE2  blockade  was  associated  with  significant  interstitial  collagen 

deposition and cardiomyocyte hypertrophy, while cardiac  function was preserved.  

These findings show that ACE2 is crucial in maintaining the conversion of Ang II into 

Ang‐(1‐7)  in  the  heart.    The  lack  or  even  a  mild  reduction  in  this  enzyme  may 

accelerate  the  progression  of  cardiac  hypertrophy,  which  may  preclude  the 

rogre ion to heart failure.   p ss

     

ACKNOWLEDGEMENTS 

The authors would like to thank Drs. Michael Callahan and Dawn Delo for their 

helpful  suggestions  for  pressure‐volume  assessment  of  cardiac  function.    The 

authors  also  acknowledge  the  technical  assistance of Ms.  Jessica VonCannon.   The 

132

ACE2  inhibitor  MLN‐4760  was  obtained  from  Millennium  Pharmaceuticals 

(Cambridge, MA).  

 

SOURCES OF FUNDING 

  This  work was  supported  in  part  by  the  American  Heart  Association Mid‐

Atlantic  Affiliate  Grants  0715249U  (to  AJT)  and  0765308U  (to  JV),  as  well  as 

National Institutes of Health Grants HL‐51952 (to CMF), HL‐56973 (to MCC), and a 

KO8‐AG026764‐04 Paul Beeson Award (to LG).  Additionally, the authors gratefully 

acknowledge grant support in part provided by Unifi, Inc., Greensboro, NC, and the 

Farley‐Hudson Foundation, Jacksonville, NC. 

 

OSURES DISCL

one N

  

133

REFERENCES    1.   Kung  HC,  Hoyert  DL,  Xu  JQ,  Murphy  SL.  Deaths:  Final  Data  for  2005.  56  ed. 

Hyattsville, MD: National Center for Health Statistics; 2008. 

  2.   Preventing Chronic Diseases: A Vital Investment.   World Health Organization; 

2008.  

  3.   Lloyd‐Jones  DM,  Larson  MG,  Leip  EP,  Beiser  A,  D'Agostino  RB,  Kannel  WB, 

Murabito  JM,  Vasan  RS,  Benjamin  EJ,  Levy  D.  Lifetime  risk  for  developing 

congestive  heart  failure:  the  Framingham  Heart  Study.  Circulation. 

2002;106:3068‐72. 

  4.   Effects  of  ramipril  on  cardiovascular  and microvascular  outcomes  in  people 

with diabetes mellitus: results of the HOPE study and MICRO‐HOPE substudy. 

Heart  Outcomes  Prevention  Evaluation  Study  Investigators.  Lancet. 

2000;355:253‐9. 

  5.   Dahlof  B,  Devereux  RB,  Kjeldsen  SE,  Julius  S,  Beevers  G,  de  FU,  Fyhrquist  F, 

Ibsen H,  Kristiansson K,  Lederballe‐Pedersen  O,  Lindholm  LH,  Nieminen MS, 

Omvik  P,  Oparil  S,  Wedel  H.  Cardiovascular  morbidity  and  mortality  in  the 

Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension study (LIFE): a 

randomised trial against atenolol. Lancet. 2002;359:995‐1003. 

  6.   Baker  KM,  Aceto  JF.  Angiotensin  II  stimulation  of  protein  synthesis  and  cell 

growth in chick heart cells. Am J Physiol. 1990;259:H610‐H618. 

134

  7.   Bohm  M,  Lippoldt  A,  Wienen  W,  Ganten  D,  Bader  M.  Reduction  of  cardiac 

hypertrophy  in TGR(mREN2)27 by angiotensin  II  receptor blockade. Mol Cell 

Biochem. 1996;163‐164:217‐21. 

  8.   Zolk  O,  Quattek  J,  Seeland  U,  El‐Armouche  A,  Eschenhagen  T,  Bohm  M. 

Activation  of  the  cardiac  endothelin  system  in  left  ventricular  hypertrophy 

before  onset  of  heart  failure  in  TG(mREN2)27  rats.  Cardiovasc  Res. 

2002;53:363‐71. 

  9.   Chappell  MC.  Emerging  evidence  for  a  functional  angiotensin‐converting 

enzyme 2‐angiotensin‐(1‐7)‐MAS receptor axis: more than regulation of blood 

pressure? Hypertension. 2007;50:596‐9. 

 10.   Ferrario CM, Chappell MC, Tallant EA, Brosnihan KB, Diz DI. Counterregulatory 

actions of angiotensin‐(1‐7). Hypertension. 1997;30:535‐41. 

 11.   Santos  RA,  Ferreira  AJ.  Angiotensin‐(1‐7)  and  the  renin‐angiotensin  system. 

Curr Opin Nephrol Hypertens. 2007;16:122‐8. 

 12.   Trask AJ, Ferrario CM. Angiotensin‐(1‐7): pharmacology and new perspectives 

in cardiovascular treatments. Cardiovasc Drug Rev. 2007;25:162‐74. 

 13.   Varagic  J,  Trask AJ,  Jessup  JA,  Chappell MC,  Ferrario CM. New angiotensins.  J 

Mol Med. 2008;86:663‐71. 

 14.   Ferrario CM, Trask AJ, Jessup JA. Advances in biochemical and functional roles 

of  angiotensin‐converting  enzyme  2  and  angiotensin‐(1‐7)  in  regulation  of 

135

cardiovascular  function.  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol.  2005;289:H2281‐

H2290. 

 15.   Benter  IF,  Yousif MH,  Anim  JT,  Cojocel  C,  Diz  DI.  Angiotensin‐(1‐7)  prevents 

development of severe hypertension and end‐organ damage in spontaneously 

hypertensive  rats  treated  with  L‐NAME.  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol. 

2006;290:H684‐H691. 

 16.   Grobe  JL, Mecca AP, Mao H,  Katovich MJ.  Chronic  angiotensin‐(1‐7)  prevents 

cardiac  fibrosis  in  DOCA‐salt model  of  hypertension.  Am  J Physiol Heart Circ 

Physiol. 2006;290:H2417‐H2423. 

 17.   Grobe  JL,  Mecca  AP,  Lingis  M,  Shenoy  V,  Bolton  TA,  Machado  JM,  Speth  RC, 

Raizada  MK,  Katovich  MJ.  Prevention  of  angiotensin  II‐induced  cardiac 

remodeling  by  angiotensin‐(1‐7).  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol. 

2007;292:H736‐H742. 

 18.   Iwata M,  Cowling  RT,  Gurantz  D,  Moore  C,  Zhang  S,  Yuan  JX,  Greenberg  BH. 

Angiotensin‐(1‐7) binds to specific receptors on cardiac  fibroblasts to  initiate 

antifibrotic  and  antitrophic  effects.  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol. 

2005;289:H2356‐H2363. 

 19.   Tallant  EA,  Ferrario  CM,  Gallagher  PE.  Angiotensin‐(1‐7)  inhibits  growth  of 

cardiac myocytes  through  activation  of  the mas  receptor.  Am  J Physiol Heart 

Circ Physiol. 2005;289:H1560‐H1566. 

136

 20.   De Mello WC. Angiotensin  (1‐7)  re‐establishes  impulse  conduction  in  cardiac 

muscle  during  ischaemia‐reperfusion.  The  role  of  the  sodium  pump.  J Renin 

Angiotensin Aldosterone Syst. 2004;5:203‐8. 

 21.   Ferreira AJ, Santos RA, Almeida AP. Angiotensin‐(1‐7): cardioprotective effect 

in myocardial ischemia/reperfusion. Hypertension. 2001;38:665‐8. 

 22.   Ferreira  AJ,  Santos  RA,  Almeida  AP.  Angiotensin‐(1‐7)  improves  the  post‐

ischemic  function  in  isolated  perfused  rat  hearts.  Braz  J  Med  Biol  Res. 

2002;35:1083‐90. 

 23.   Loot  AE,  Roks  AJ,  Henning  RH,  Tio  RA,  Suurmeijer  AJ,  Boomsma  F,  van  Gilst 

WH.  Angiotensin‐(1‐7)  attenuates  the  development  of  heart  failure  after 

myocardial infarction in rats. Circulation. 2002;105:1548‐50. 

 24.   Crackower MA, Sarao R, Oudit GY, Yagil C, Kozieradzki  I,  Scanga SE, Oliveira‐

dos‐Santos  AJ,  da  CJ,  Zhang  L,  Pei  Y,  Scholey  J,  Ferrario  CM,  Manoukian  AS, 

Chappell MC, Backx PH, Yagil Y, Penninger JM. Angiotensin‐converting enzyme 

2 is an essential regulator of heart function. Nature. 2002;417:822‐8. 

 25.   Donoghue M, Hsieh F, Baronas E, Godbout K, Gosselin M, Stagliano N, Donovan 

M, Woolf B, Robison K, Jeyaseelan R, Breitbart RE, Acton S. A novel angiotensin‐

converting enzyme‐related carboxypeptidase (ACE2) converts angiotensin I to 

angiotensin 1‐9. Circ Res. 2000;87:E1‐E9. 

137

 26.   Tipnis  SR,  Hooper  NM,  Hyde  R,  Karran  E,  Christie  G,  Turner  AJ.  A  human 

homolog of angiotensin‐converting enzyme. Cloning and functional expression 

as a captopril‐insensitive carboxypeptidase. J Biol Chem. 2000;275:33238‐43. 

 27.   Vickers  C,  Hales  P,  Kaushik  V,  Dick  L,  Gavin  J,  Tang  J,  Godbout  K,  Parsons T, 

Baronas  E, Hsieh  F,  Acton  S,  Patane M, Nichols  A,  Tummino  P.  Hydrolysis  of 

biological  peptides  by  human  angiotensin‐converting  enzyme‐related 

carboxypeptidase. J Biol Chem. 2002;277:14838‐43. 

 28.   Trask  AJ,  Averill  DB,  Ganten  D,  Chappell  MC,  Ferrario  CM.  Primary  role  of 

angiotensin‐converting enzyme‐2 in cardiac production of angiotensin‐(1‐7) in 

transgenic  Ren‐2  hypertensive  rats.  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol. 

2007;292:H3019‐H3024. 

 29.   Gurley SB, Allred A, Le TH, Griffiths R, Mao L, Philip N, Haystead TA, Donoghue 

M, Breitbart RE, Acton SL, Rockman HA, Coffman TM. Altered blood pressure 

responses  and  normal  cardiac  phenotype  in  ACE2‐null  mice.  J  Clin  Invest. 

2006;116:2218‐25. 

 30.   Yamamoto K, Ohishi M, Katsuya T, Ito N, Ikushima M, Kaibe M, Tatara Y, Shiota 

A, Sugano S, Takeda S, Rakugi H, Ogihara T. Deletion of angiotensin‐converting 

enzyme  2  accelerates  pressure  overload‐induced  cardiac  dysfunction  by 

increasing local angiotensin II. Hypertension. 2006;47:718‐26. 

 31.   Gurley  SB,  Coffman  TM.  Angiotensin‐converting  enzyme  2  gene  targeting 

studies in mice: mixed messages. Exp Physiol. 2008;93:538‐42. 

138

 32.   Der SS, Grobe JL, Yuan L, Narielwala DR, Walter GA, Katovich MJ, Raizada MK. 

Cardiac overexpression of angiotensin converting enzyme 2 protects the heart 

from ischemia‐induced pathophysiology. Hypertension. 2008;51:712‐8. 

 33.   ez‐Freire C, Vazquez  J, Correa de Adjounian MF, Ferrari MF, Yuan L, Silver X, 

Torres  R,  Raizada  MK.  ACE2  gene  transfer  attenuates  hypertension‐linked 

pathophysiological changes in the SHR. Physiol Genomics. 2006;27:12‐9. 

 34.   Grobe  JL,  Der  SS,  Stewart  JM,  Meszaros  JG,  Raizada  MK,  Katovich  MJ.  ACE2 

overexpression  inhibits  hypoxia‐induced  collagen  production  by  cardiac 

fibroblasts. Clin Sci (Lond). 2007;113:357‐64. 

 35.   Huentelman  MJ,  Grobe  JL,  Vazquez  J,  Stewart  JM,  Mecca  AP,  Katovich  MJ, 

Ferrario  CM,  Raizada  MK.  Protection  from  angiotensin  II‐induced  cardiac 

hypertrophy  and  fibrosis  by  systemic  lentiviral  delivery  of  ACE2  in  rats. Exp 

Physiol. 2005;90:783‐90. 

 36.   Dales NA,  Gould AE,  Brown  JA,  Calderwood EF,  Guan B, Minor  CA,  Gavin  JM, 

Hales P, Kaushik VK, Stewart M, Tummino PJ, Vickers CS, Ocain TD, Patane MA. 

Substrate‐based  design  of  the  first  class  of  angiotensin‐converting  enzyme‐

related carboxypeptidase (ACE2) inhibitors.  J Am Chem Soc. 2002;124:11852‐

3. 

 37.   Soler  MJ,  Wysocki  J,  Ye  M,  Lloveras  J,  Kanwar  Y,  Batlle  D.  ACE2  inhibition 

worsens  glomerular  injury  in  association  with  increased  ACE  expression  in 

streptozotocin‐induced diabetic mice. Kidney Int. 2007;72:614‐23. 

139

 38.   Groban L, Pailes NA, Bennett CD, Carter CS, Chappell MC, Kitzman DW, Sonntag 

WE.  Growth  hormone  replacement  attenuates  diastolic  dysfunction  and 

cardiac angiotensin II expression in senescent rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 

2006;61:28‐35. 

 39.   Connelly KA, Prior DL, Kelly DJ, Feneley MP, Krum H, Gilbert RE. Load‐sensitive 

measures  may  overestimate  global  systolic  function  in  the  presence  of  left 

ventricular  hypertrophy:  a  comparison with  load‐insensitive measures. Am  J 

Physiol Heart Circ Physiol. 2006;290:H1699‐H1705. 

 40.   Connelly KA, Kelly DJ, Zhang Y, Prior DL, Martin J, Cox AJ, Thai K, Feneley MP, 

Tsoporis J, White KE, Krum H, Gilbert RE. Functional, structural and molecular 

aspects of diastolic heart failure in the diabetic (mRen‐2)27 rat. Cardiovasc Res. 

2007;76:280‐91. 

 41.   Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai  S, Kass DA. Measurement of 

cardiac  function  using  pressure‐volume  conductance  catheter  technique  in 

mice and rats. Nat Protoc. 2008;3:1422‐34. 

 42.   Ferrario CM,  Jessup  J, Gallagher PE, Averill DB, Brosnihan KB, Ann TE,  Smith 

RD,  Chappell  MC.  Effects  of  renin‐angiotensin  system  blockade  on  renal 

angiotensin‐(1‐7)  forming  enzymes  and  receptors. Kidney  Int.  2005;68:2189‐

96. 

 43.   Ferrario CM,  Jessup  J, Chappell MC, Averill DB, Brosnihan KB, Tallant EA, Diz 

DI,  Gallagher  PE.  Effect  of  angiotensin‐converting  enzyme  inhibition  and 

140

angiotensin  II receptor blockers on cardiac angiotensin‐converting enzyme 2. 

Circulation. 2005;111:2605‐10. 

 44.   Junqueira  LC,  Bignolas  G,  Brentani  RR.  Picrosirius  staining  plus  polarization 

microscopy,  a  specific  method  for  collagen  detection  in  tissue  sections. 

Histochem J. 1979;11:447‐55. 

 45.   Oudit GY, Kassiri  Z,  Patel MP,  Chappell M, Butany  J,  Backx PH,  Tsushima RG, 

Scholey JW, Khokha R, Penninger JM. Angiotensin II‐mediated oxidative stress 

and  inflammation  mediate  the  age‐dependent  cardiomyopathy  in  ACE2  null 

mice. Cardiovasc Res. 2007;75:29‐39. 

 46.   Villarreal  FJ,  Kim  NN,  Ungab  GD,  Printz  MP,  Dillmann  WH.  Identification  of 

functional  angiotensin  II  receptors  on  rat  cardiac  fibroblasts.  Circulation. 

1993;88:2849‐61. 

 47.   Whaley‐Connell A, Govindarajan G, Habibi J, Hayden MR, Cooper SA, Wei Y, Ma 

L, Qazi M, Link D, Karuparthi PR, Stump C, Ferrario C, Sowers JR. Angiotensin 

II‐mediated  oxidative  stress  promotes  myocardial  tissue  remodeling  in  the 

transgenic  (mRen2)  27  Ren2  rat.  Am  J  Physiol  Endocrinol  Metab. 

2007;293:E355‐E363. 

 48.   Santos RA, Simoes E Silva AC, Maric C, Silva DM, Machado RP, de B, I, Heringer‐

Walther  S,  Pinheiro  SV,  Lopes  MT,  Bader  M,  Mendes  EP,  Lemos  VS, 

Campagnole‐Santos MJ, Schultheiss HP, Speth R, Walther T. Angiotensin‐(1‐7) 

141

is an endogenous ligand for the G protein‐coupled receptor Mas. Proc Natl Acad 

Sci U S A. 2003;100:8258‐63. 

 49.   Zile  MR,  Brutsaert  DL.  New  concepts  in  diastolic  dysfunction  and  diastolic 

heart  failure:  Part  II:  causal  mechanisms  and  treatment.  Circulation. 

2002;105:1503‐8. 

 50.   Ohta  K,  Kim  S, Wanibuchi  H,  Ganten  D,  Iwao  H.  Contribution  of  local  renin‐

angiotensin  system  to  cardiac  hypertrophy,  phenotypic  modulation,  and 

remodeling in TGR (mRen2)27 transgenic rats. Circulation. 1996;94:785‐91. 

 51.   Janssen  BJ,  De  CT,  Debets  JJ,  Brouns  AE,  Callahan  MF,  Smith  TL.  Effects  of 

anesthetics on systemic hemodynamics in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 

2004;287:H1618‐H1624. 

 52.   Kuba K, Zhang L, Imai Y, Arab S, Chen M, Maekawa Y, Leschnik M, Leibbrandt A, 

Markovic  M,  Schwaighofer  J,  Beetz  N,  Musialek  R,  Neely  GG,  Komnenovic  V, 

Kolm U, Metzler B, Ricci R, Hara H, Meixner A, Nghiem M, Chen X, Dawood F, 

Wong  KM,  Sarao  R,  Cukerman  E,  Kimura  A,  Hein  L,  Thalhammer  J,  Liu  PP, 

Penninger  JM.  Impaired  heart  contractility  in  Apelin  gene‐deficient  mice 

associated with aging and pressure overload. Circ Res. 2007;101:e32‐e42. 

 53.   El  MS,  Iturrioz  X,  Fassot  C,  De  MN,  Roesch  D,  Llorens‐Cortes  C.  Functional 

dissociation of apelin receptor signaling and endocytosis:  implications for the 

effects of apelin on arterial blood pressure. J Neurochem. 2004;90:1290‐301. 

142

 54.   Lee DK, Saldivia VR, Nguyen T, Cheng R, George SR, O'Dowd BF. Modification of 

the  terminal  residue  of  apelin‐13  antagonizes  its  hypotensive  action. 

Endocrinology. 2005;146:231‐6. 

 55.   Donoghue M, Wakimoto H, Maguire CT, Acton S, Hales P, Stagliano N, Fairchild‐

Huntress  V,  Xu  J,  Lorenz  JN,  Kadambi  V,  Berul  CI,  Breitbart  RE.  Heart  block, 

ventricular  tachycardia,  and  sudden  death  in  ACE2  transgenic  mice  with 

downregulated connexins. J Mol Cell Cardiol. 2003;35:1043‐53. 

143

Table VI.1.   24‐hour Average Blood Pressures and Heart Rate Measured by 

Radiotelemetry on the last day of Treatment. 

144

Table VI.1        Vehicle     MLN‐4760     p   value             Systolic (mm Hg)  

 Hg) 

  205 ± 6    207 ± 3    >0.05              Mean Arterial (mm   181 ± 5 

153 ± 5 

  185 ± 2 

158 ± 2 

  >0.05              Diastolic (mm Hg) 

g) 

      >0.05              Pulse Pressure (mmH

eart Rate (mm Hg) 

  56 ± 2 

376 ± 3 

  53 ± 3 

387 ± 2 

  >0.05 

<0.05  H  

    

 

 

    

 

 

    

 

  

145

Table  VI.2.    Echocardiographic  and  Hemodynamic  Analysis  of  Cardiac 

unction in Vehicle‐ and ACE2 inhibitor‐treated Ren‐2 Rats. F

 

146

Table VI.2        Vehicle     MLN‐4760     p value              Heart Rate (BPM)    384 ± 11    387 ± 8     0.83              AWTd (cm) 

 

  0.224 ± 0.002    0.245 ± 0.006    ** 0.009 

03              PWTd (cm)   0.231 ± 0.003    0.257 ± 0.006    ** 0.0             ESDd (cm) 

cm) 

  0.564 ± 0.012 

 0.009 

  0.547 ± 0.034 

 0.031 

  0.65              EDDd (   0.885 ±   0.849 ±   0.28              FS (%) 

/s) 

  36 ± 1    36 ± 2    0.86              Emax (cm

/s) 

  98 ± 4    92 ± 5    0.39              e' (cm   6.13 ± 0.39 

28 

  5.77 ± 0.30 

.35 

  0.47              E/e'    16.24 ± 0.

0 

  16.35 ± 1

 

  0.94              ESP (mmHg) 

Hg) 

  144 ± 1   164 ± 6   0.15              EDP (mm   17 ± 4    28 ± 5    0.10              ESV (μL) 

) 

  135 ± 16 

5 

  140 ± 19 

8 

  0.87              EDV (μL

) 

  212 ± 1   209 ± 1   0.88              SV (μL

max

  83 ± 7    80 ± 5    0.79              dP/dt   (mmHg/s) 

/s) 

  8654 ± 487 

06 

  9177 ± 154 

02 

  0.36              dP/dt min (mmHg

iss, ms) 

  ‐7855 ± 5   ‐8102 ± 3   0.70              tau (We   8.6 ± 0.2    8.2 ± 0.2    0.16              ESPVR 

DPVR 

  0.87 ± 0.27 

.13 ± 0.05 

  1.25 ± 0.31 

.14 ± 0.08 

  0.98 

.65  E  

    

 0  

    

 0  

    

 0  

  

 

147

Figure VI.1.   Radiotelemetric blood pressure and heart rate in Vehicle‐ and 

MLN‐4760‐treated  Ren‐2  rats.    Systolic,  MAP,  diastolic,  nor  pulse  pressures were 

altered  as  a  result  of  ACE2 blockade  (p  >  0.05).    ACE2 blockade  did  cause  a mild 

elevation in heart rate (p < 0.05). 

148

­4 ­2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 280

100

200

300

400

Control

Systolic

DiastolicMAP

PulsePressure

HeartRate

MLN­4760

Treatment Days

Blood  Pressure (mmHg) or

Heart Rate (BPM)

 

FIGURE VI.1 

149

Figure VI.2.   Plasma  (left)  and  cardiac  (right)  angiotensin  peptides.   MLN‐

4760  treatment did not  change plasma Ang  II  or Ang‐(1‐7)  concentrations,  or  the 

plasma  Ang‐(1‐7)/Ang  II  ratio  (p  >  0.05).    However,  ACE2  inhibition  did  cause  a 

significant accumulation of myocardial Ang II (Vehicle: 2.11 ± 0.12 fmol/mg protein 

vs. MLN‐4760: 2.61 ± 0.09 fmol/mg protein, p < 0.01), while the reduction in cardiac 

Ang‐(1‐7) was not statistically significant (Vehicle: 7.19 ± 0.52 fmol/mg protein vs. 

MLN‐4760:  6.50  ±  0.56  fmol/mg  protein,  p  >  0.05).    Moreover,  ACE2  blockade 

revealed a significant decrease in the cardiac Ang‐(1‐7)/Ang II ratio (Vehicle: 3.46 ± 

0.30 vs. MLN‐4760: 2.49 ± 0.19, p < 0.05). 

150

 

FIGURE VI.2 

151

Figure VI.3.   Brightfield (top) and polarized (bottom) photomicrographs of 

collagen staining by picrosirius red in both treated and untreated Ren‐2 rats.  ACE2 

inhibition  caused  a  significant  elevation  in  interstitial  collagen  fraction  area  (Left, 

Vehicle: 1.02 ± 0.03% vs. MLN‐4760: 1.19 ± 0.04%, p < 0.05), whereas the elevation 

in perivascular collagen/lumen ratio did not achieve statistical  significance (Right, 

Vehicle: 1.92 ± 0.15 vs. MLN‐4760: 2.36 ± 0.33, p > 0.05).   

152

 

 

FIGURE VI.3 

153

Figure VI.4.   Photomicrographs of cardiac sections showing cardiomyocyte 

cross‐sectional area.  ACE2 blockade elicited significant cardiomyocyte hypertrophy 

(Vehicle: 664 ± 23 μm2 vs. MLN‐4760: 836 ± 33 μm2, p < 0.01).  Scalebar represents 

50 μm. 

154

FIGURE VI.4 

155

Figure VI.5.  Pressure‐Volume loops of both Vehicle‐ and MLN‐4760‐treated 

Ren‐2  rats  illustrate  that  chronic  pharmacological  ACE2  blockade  did  not  change 

cardiac function (numerical data in Table VI.2).   

156

FIGURE VI.5 

157

 CHAPTER VII  

ANGIOTENSIN­(1­12) IS AN ALTERNATE SUBSTRATE FOR ANGIOTENSIN PEPTIDE PRODUCTION IN THE HEART 

 

Aaron J. Trask, Jewell A. Jessup, Mark C. Chappell, Carlos M. Ferrario 

 

H  D  ypertension and Vascular Research Centerepart cologyWake icine 

ment of Physiology and Pharma Forest University School of MedWinston‐Salem, North Carolina 

   [This chapter was published in the American Journal of Physiology – Heart and Circulatory  Physiology  (2008;  294:H2242­H2247.)  and  is  reprinted  with permission.  Differences in formatting reflect the requirements of the journal.  Aaron J. Trask prepared the manuscript, while Dr. Carlos M. Ferrario acted in n editorial and advisory capacity.  Dr. Chappell provided assistance with the iochemical analysis outlined in this manuscript.] ab 

 

 

 

 

 

 

 

   

 

 

158

VII.1  ABSTRACT 

Identification  of  angiotensin‐(1‐12),  as  an  intermediate  precursor  derived 

directly from angiotensinogen, led us to explore whether the heart has the capacity 

to process angiotensin‐(1‐12) into the biologically‐active angiotensin peptides.  The 

generation  of  angiotensin  I,  angiotensin  II,  and  angiotensin‐(1‐7)  from  exogenous 

angiotensin‐(1‐12)  was  evaluated  in  the  effluent  of  isolated  perfused  hearts 

mounted on a Langendorff apparatus in three normotensive and two hypertensive 

strains  –  the  Sprague‐Dawley,  Lewis,  congenic  mRen2.Lewis,  Wistar‐Kyoto,  and 

Spontaneously Hypertensive rats.  Hearts were perfused with Krebs solution for 60 

minutes  before  and  after  the  addition  of  angiotensin‐(1‐12)  (10  nmol/L).  

Angiotensin‐(1‐12)  caused  the  rapid  appearance  of  both  angiotensin  I  and 

angiotensin  II  in  the  perfusate  that  peaked  between  30  and  60  minutes  of 

recirculation.    Production of  angiotensin‐(1‐7)  from exogenous  angiotensin‐(1‐12) 

rose  steadily  over  the  course  of  the  60‐minute  experiment.    These  data  directly 

demonstrate that angiotensin‐(1‐12) is a substrate for the formation of angiotensin 

peptides in cardiac tissue.   This finding further suggests that this angiotensinogen‐

derived  product  is  a  previously  unrecognized  important  precursor  peptide  to  the 

renin‐angiotensin system cascade. 

 

Ka 

ey  Words:  angiotensinogen,  angiotensin‐(1‐12),  angiotensin  I,  angiotensin  II, ngiotensin‐(1‐7), renin, hypertension 

 

 

159

VII.2  INTRODUCTION 

The  renin‐angiotensin  system  (RAS)  was  originally  thought  to  be  a  linear 

system  with  the  cleavage  of  angiotensinogen  by  renin  as  the  first  step  in  the 

biochemical  cascade  leading  to  the  production  of  biologically‐active  peptides.  

Studies  over  the  past  twenty  years  have  uncovered  a  more  complex  processing 

cascade primarily from studies that demonstrated a functional role of angiotensin‐

(1‐7)  [Ang‐(1‐7)],  which  can  be  generated  by  various  peptidases  from  either 

angiotensin I (Ang I) or angiotensin II (Ang II) (1; 15; 17; 18). 

In  keeping  with  the  idea  of  a  non‐linear  RAS,  Nagata  and  colleagues  (10) 

recently  identified  a  pro‐peptide  hormone  of  the  RAS,  proangiotensin‐12 

[angiotensin‐(1‐12), Ang‐(1‐12)]  in plasma and all  tissues  investigated.   Biological 

actions of this propeptide as a substrate for Ang II formation were demonstrated by 

showing  that  administration  of  Ang‐(1‐12)  in  isolated  vessels  produced  a 

vasopressor  response  that  could  be  blocked  by  both  an  angiotensin  converting 

enzyme  (ACE)  inhibitor  and  an  angiotensin  receptor  blocker  (ARB).    The  current 

study  determined whether  Ang‐(1‐12),  a  peptide  upstream  of  the  traditional  RAS 

cascade, can lead to the generation of Ang II and Ang‐(1‐7) in the isolated hearts of 

both normal and genetically‐diverse hypertensive rat strains.  To confirm the role of 

Ang‐(1‐12)  as  a  suitable  substrate  for  angiotensin  peptide  formation  in  the  heart, 

data were obtained in five different rat strains.   

 

 

160

VII.3  MATERIALS AND METHODS 

Animals 

To examine whether the rat heart has the capacity to process Ang‐(1‐12) into 

the  downstream  angiotensin  peptides  Ang  I,  Ang  II,  and  Ang‐(1‐7),  initial  studies 

focused  on  employing  11‐  to  12‐week‐old  male  Sprague‐Dawley  (SD,  Harlan 

Laboratories, Indianapolis, IN, n = 6) rats to the Langendorff isolated heart protocol 

outlined below.  To determine whether the Ang‐(1‐12) is differentially processed in 

the  hearts  of  hypertensive  animals  versus  their  normal  counterparts,  we  also 

employed both a targeted model of Ang II‐driven hypertension and a genetic model 

of  hypertension  using  the  Langendorff  method  in  separate  experiments.  

Normotensive  Lewis  (Charles  River  Laboratories,  Wilmington,  MA,  n  =  4),  and 

hypertensive  mRen2.Lewis  (Congenic,  Hypertension  &  Vascular  Research  Center, 

Wake Forest University  School of Medicine, Winston‐Salem, NC,  n = 4)  rats 11‐  to 

12‐week‐old  served  as  the  Ang  II‐driven  hypertensive  model.    Aged‐matched 

Wistar‐Kyoto  (WKY,  Charles  River  Laboratories,  Wilmington,  MA,  n  =  6)  and 

Spontaneously‐Hypertensive (SHR, Charles River Laboratories, Wilmington, MA, n = 

6) rats served as the genetic model.   All animals were housed paired in cages (12‐

hour light/dark cycle) in an AAALAC‐approved facility with ad libitum access to rat 

chow and  tap water.   Procedures were approved by our  institutional Animal Care 

and Use Committee.   

Langendorff Procedure 

The  isolated  heart  preparation  was  performed  as  previously  described  by 

our laboratory (15).  Briefly, rats were weighed, placed under deep isoflurane (2.5‐

161

3%) anesthesia, and given heparin (300 USP units) via a catheter inserted into the 

jugular vein.  The heart was excised and immediately placed in ice‐cold Krebs buffer.  

Rat hearts were then perfused at a constant flow (10 ‐ 12 mL/min) on a Langendorff 

isolated heart perfusion apparatus.  Heart rates, perfusion pressures, and flow rates 

were m r d uonito e  continuo sly throughout the experiment.     

After  a  one‐hour  equilibration  period,  a  baseline  sample  of  the  cardiac 

effluent  (2.5 mL) was  collected,  and  then  60 mL  of  Krebs  buffer with  10  nmol/L 

angiotensin‐(1‐12)  [Asp1‐Arg2‐Val3‐Tyr4‐Ile5‐His6‐Pro7‐Phe8‐His9‐Leu10‐Leu11‐Tyr12, 

Peptide  Institute,  Inc.,  Osaka,  Japan]  was  recirculated  through  the  heart  for  60 

minutes.   This dose was chosen based on previous studies  from Nagata et al.  (10) 

who  showed  that 10 nmol/L of Ang‐(1‐12) was  just  below  the  concentration  that 

elicited  marked  vasoconstriction  in  isolated  rat  aortae.    Moreover,  previous 

experience  investigating Ang  II metabolism  in  the  isolated heart  preparation  is  in 

keeping with the employed dose of Ang‐(1‐12) (15).  All effluent samples were acid‐

matched 1:1 (v:v) with 1% heptafluorobutyric acid (HFBA) to abolish metabolism of 

the peptides at the following times:  (1) 5 minutes of recirculation, (2) 15 minutes, 

(3)  30 minutes,  (4)  60 minutes.   Half  of  the WKY  and  SHR  rat  hearts  received  1 

μmol/L  of  the  renin  inhibitor,  WFML‐1  (AnaSpec,  San  Jose,  CA),  immediately 

following  the  collection  of  the  15‐minute  sample.    Previous  studies  from  our 

laboratory demonstrated that WFML‐1 specifically inhibits rat renin (11). 

Biochem

162

ical Procedures 

Angiotensin  peptides were  extracted  from  the  acid‐matched  samples  using 

C18 Sep Pak columns (Waters, Milford, MA).  Each Sep Pak was conditioned with 5 

mL of 80% methanol (MeOH)/0.1% HFBA, followed by 5 mL 0.1% HFBA.  The 5 mL 

samples were  then  applied  to  the  columns,  followed  by  10 mL  0.1% HFBA.    The 

columns were rinsed with 5 mL of MilliQ water, and the peptides were eluted in 3 

mL 80% MeOH/0.1% HFBA.   The eluate was  then analyzed by radioimmunoassay 

(RIA) for Ang I, Ang II and Ang‐(1‐7) as described previously by our laboratory (4; 

5).   The minimum detectable  limits of  the Ang I, Ang II and Ang‐(1‐7) assays were 

1.0  pg/mL,  0.8  pg/mL  and  2.5  pg/mL,  respectively.    The  intra‐  and  inter‐assay 

coefficients of variability were 18% and 22% for Ang I, 12% and 22% for Ang II, and 

8% and 20% for Ang‐(1‐7), respectively. 

Renin Assay 

Effluent  collected  from  the  hearts  of  WKY  and  SHR  rats  (with  no  renin 

inhibitor)  was  concentrated  using  Amicon  Ultra  10,000  molecular  weight  cut  off 

centrifugal filters (Millipore, Billerica, MA) and washed thrice with HEPES buffer (25 

mmol/L  HEPES,  125 mmol/L  NaCl,  10  μmol/L  ZnCl2,  pH  =  7.4).    In  addition,  left 

ventricles  from both  isolated perfused  (n = 3) and non‐perfused  (n = 3) WKY and 

SHR rats were homogenized in 500 μL of HEPES buffer using the Qiagen TissueLyser 

for  1 minute  at  25  Hz.    The  homogenate was  then  centrifuged  for  10 minutes  at 

28,000 x g, and 25 μL of either the resulting supernatant or the concentrated cardiac 

effluent  was  incubated  at  pH  6.5  in  the  presence  of  excess  exogenous 

angiotensinogen substrate at 37°C for 90 minutes.  Renin activity was measured as 

the  difference  in  Ang  I  generated  at  37°C  minus  that  present  at  0°C.    Additional 

studies were also conducted in the presence of 3 μmol/L of WFML‐1 to verify that 

163

the Ang I‐generating activity in the heart was indeed renin.  Ang I was measured by 

radioimmunoassay (DiaSorin, Stillwater, MN). 

Statistical Analyses 

All  values  are  reported  as  the mean  ±  SEM.    Student’s  t‐test  and  repeated 

measures  ANOVA  followed  by  a  Tukey’s  post‐hoc  test  for  multiple  comparisons 

were  used  to  determine  significant  differences  at  a  probability  <0.05  using 

GraphPad Prism 5.0 software (San Diego, CA).   For the RIA, values at or below the 

minimal  detectable  limits  of  the  assays  were  assigned  that  value  for  statistical 

purposes. 

 

VII.4  RESULTS 

Heart rates were not different between normal and hypertensive  rat hearts 

neither at baseline, nor during the 60‐minute experiment (P > 0.05).  Administration 

of  Ang‐(1‐12)  to  isolated  hearts  did  not  change  heart  rates  throughout  the 

experiment  (Table  VII.1)  in  all  but  SD  hearts;  in  this  strain,  mild  bradycardia 

occurred after 60 minutes (P = 0.02).   

Perfusion pressures were not different between normal and hypertensive rat 

hearts neither at baseline, nor over the course of the experiment (P > 0.05).  Ang‐(1‐

12) caused a small increase in perfusion pressures in SD and WKY hearts only at the 

end of the experiment (60 minutes) after the metabolism had stabilized (Table VII.2, 

P = 0.004 and P = 0.005, respectively), while perfusion pressures in Lewis, congenic, 

or SHR rat hearts did not change over the time course of the experiment (P > 0.05).   

164

At baseline, the effluent from the isolated heart of all strains investigated did 

not contain detectable concentrations of Ang I, Ang II, or Ang‐(1‐7).  The addition of 

Ang‐(1‐12)  to  the perfusate of  isolated rat hearts  from SD animals was associated 

with  rapid  and  sustained  increases  in  the  concentrations  of  Ang  I  and  Ang  II; 

increases in these peptides were then followed by the slow appearance of Ang‐(1‐7) 

[Figure  VII.1].    Ang  I  production  from  exogenous  Ang‐(1‐12)  peaked  at  28  ±  3 

minutes (191 ± 34 pmol/L, P < 0.0001), followed by Ang II at 45 ± 7 minutes (364 ± 

81 pmol/L, P < 0.0001), while Ang‐(1‐7) production steadily increased to an average 

of 97 ± 31 pmol/L (P = 0.0003) at 55 ± 5 minutes.   

In other experiments, addition of Ang‐(1‐12) to the isolated hearts of Lewis 

and congenic rats resulted in similar production of Ang I, Ang II, and Ang‐(1‐7) of a 

magnitude and time course comparable to those obtained in SD rats (Figure VII.2).  

Ang I production in the Lewis and congenic hearts peaked at 26 ± 4 minutes and 30 

± 0 minutes (P > 0.05), respectively, followed by Ang II at 53 ± 8 and 53 ± 8 minutes, 

respectively  (P  >  0.05),  while  Ang‐(1‐7)  production  again  peaked  after  60  ±  0 

minutes in both strains (P > 0.05).   

Correlation  analysis  of  the  peptides  in  SD,  Lewis,  and  congenic  cardiac 

effluent  revealed  highly  significant  correlations  between  Ang  I  and  Ang  II  values 

(Table VII.3).   Moreover, Ang  II values were also highly  correlated with Ang‐(1‐7) 

values in all rat hearts. 

 

 

165

Evaluation of Renin in the Metabolism of Ang­(1­12) 

A  final  set  of  experiments  in  WKY  and  SHR  rat  hearts  expanded  our 

characterization of Ang‐(1‐12) metabolism and evaluated a potential role of cardiac 

renin  in  cleaving  Ang‐(1‐12)  into  Ang  I.    The  application  of  Ang‐(1‐12)  to  the 

perfusate  of  isolated  hearts  from  WKY  and  SHR  rats  resulted  in  similar  and 

sustained production of Ang  I, Ang  II,  and Ang‐(1‐7)  [Figure VII.3].    Similar  to  the 

previous experiments, Ang I production in the WKY and SHR hearts peaked at 40 ± 

10 and 25 ± 5 minutes (P > 0.05), respectively, followed by Ang II at 50 ± 10 minutes 

in both strains, respectively (P > 0.05), while Ang‐(1‐7) production peaked after 60 

± 0 and 50 ± 10 minutes, respectively (P > 0.05).  Addition of the rat renin inhibitor 

WFML‐1  to  the  perfusate  did  not  alter  the  time‐to‐peak  values  for  any  of  the 

angiotensin  peptides  (P  >  0.05).    The  addition  of  the  WKY  and  SHR  angiotensin 

peptide values  to  the other  strains’  correlation  analyses did not  significantly  alter 

the Pearson correlations, although the correlations remained remarkably significant 

[Ang I:Ang II, 0.77, P < 0.0001; Ang I:Ang‐(1‐7), 0.61, P < 0.0001; Ang II:Ang‐(1‐7), 

0.62, P < 0.0001]. 

166

Addition  of  the  renin‐specific  inhibitor,  WFML‐1,  to  the  perfusate  did  not 

alter the production of any of the angiotensin peptides measured in either WKY or 

SHR rat hearts  (Figure VII.3).   Renin activity measured  in  the  effluent of WKY and 

SHR rats averaged 1.74 ± 0.15 ng Ang I/mL/hour and 2.24 ± 0.56 ng Ang I/mL/hour 

(P  >  0.05),  verifying  its  presence  in  the  cardiac  effluent.    In  addition,  tissue  renin 

activity  in  the  perfused WKY  and  SHR  hearts  averaged  1.18  ±  0.15  ng  Ang  I/mg 

protein/hour  and  4.43  ±  2.79  ng  Ang  I/mg  protein/hour,  respectively  (P  >  0.05); 

these values were similar to those measured in freshly homogenized WKY and SHR 

hearts  (0.656  ±  0.056  ng Ang  I/mg  protein/hour  and  0.716  ±  0.096  ng Ang  I/mg 

protein/hour,  respectively,  P  >  0.05).    Addition  of  WFML‐1  to  the  renin  assay 

completely  abolished  Ang  I‐generating  activity  from  excess  exogenous 

angiotensinogen,  confirming  that  the  activity  was  indeed  due  to  the  presence  of 

renin  in  these  tissues.    Therefore,  the  failure  of  endogenous  renin  inhibition  in 

altering the pattern and magnitude of peptides generated by the addition of Ang‐(1‐

12) demonstrates that renin has no catalytic activity on Ang‐(1‐12).   

 

VII.5  DISCUSSION 

Building  upon  the  initial  findings  by  Nagata  et  al.  (10),  as  well  as  our 

preliminary observations (3; 6; 16), we report here for the first time that Ang‐(1‐12) 

functions as a precursor for the downstream generation of angiotensin peptides in 

the hearts of both normal and hypertensive rats.   Addition of the dodecapeptide to 

the  perfusate  of  isolated  hearts  from  five  different  rat  strains  revealed  similar 

profiles  of  angiotensin  peptide  production.    Both  Ang  I  and  Ang  II  appeared  in 

apparent  sequence  at  similar  levels  in  the  perfusate.    Moreover,  the  biologically‐

active  heptapeptide Ang‐(1‐7) was produced  from exogenous Ang‐(1‐12)  steadily, 

although the overall values of Ang‐(1‐7) found in the perfusate were less than those 

found  for Ang  I and Ang  II.   The delayed appearance of Ang‐(1‐7)  in  the perfusate 

compared  to  the  pattern  of  Ang  I  and  Ang  II  production  suggests  that  Ang‐(1‐7) 

formation  did  not  arise  directly  from  Ang‐(1‐12).    In  agreement  with  this 

167

interpretation,  we  previously  showed  that  Ang‐(1‐7)  is  produced  from  Ang  II  by 

angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) in isolated rat hearts (15).   

Because baseline levels of Ang I, Ang II, and Ang‐(1‐7) were not detectable in 

the  perfusate  prior  to  addition  of  Ang‐(1‐12),  endogenous  production  of  these 

peptides  cannot  account  for  the  findings  reported  here.    Lindpaintner  et  al.  (7) 

showed non‐detectable levels of Ang I and Ang II in the effluent from the coronary 

sinus  of  isolated  perfused  rat  heart  prior  to  the  addition  of  purified  hog  renin.  

Addition  of  renin  resulted  in  a  time‐dependent  generation  of  Ang  I  and  Ang  II.  

Therefore, it is not surprising that in our current experiments and in those reported 

by  us  previously  (15),  baseline  levels  of  angiotensins were  not  detectable.    Their 

experiments  also  argue  for  the  possibility  that  the  effect  of  Ang‐(1‐12)  may  be 

accounted  for by  release of pools of preformed (free and/or bound) Ang  I, Ang  II, 

and Ang‐(1‐7).  In both situations, either addition of renin or the addition of Ang‐(1‐

12) was required to stimulate the formation of the angiotensins.   

In  our  experiments,  a  10  nmol/L  dose  of  Ang‐(1‐12)  was  required  since 

Nagata and colleagues (10) found that higher concentrations (≥ 30 nmol/L) of Ang‐

(1‐12)  elicited  significant  vasoconstriction  in  the  isolated  rat  aorta.    Since  there 

were no differences  in any of  the angiotensin peptides generated  from Ang‐(1‐12) 

between Lewis and congenic, nor WKY and SHR hearts, neither targeted nor genetic 

hypertension appear to substantially influence the processing of Ang‐(1‐12) in these 

isolated  hearts  when  compared  to  their  background  strains.    The  proportionally 

similar  generation  of  angiotensin  peptides  from  Ang‐(1‐12)  among  the  tested 

168

strains does not negate the possibility  that endogenous generation of  the peptides 

may not differ among various normotensive and hypertensive strains.   

The  capacity  of  cardiac  tissue  to  use  Ang‐(1‐12)  as  a  substrate  for  the 

production of angiotensin peptides  is  further  illustrated by  the existence of highly 

significant correlations for Ang I and Ang II values.   Indeed, Chappell et al. (3), in a 

preliminary report, demonstrated that Ang‐(1‐12) can be metabolized efficiently by 

rat  serum ACE  into Ang  I, which  can  then be  sequentially  cleaved by ACE  to  form 

Ang II.  Furthermore, we observed highly significant correlations between Ang‐(1‐7) 

and both Ang I and Ang II in all five rat strain hearts utilized, suggesting that Ang‐(1‐

7) was produced from both Ang I and Ang II.  Collectively, these data suggest that in 

the heart, Ang‐(1‐12) is processed into Ang I, which can then be processed into both 

Ang  II  and  Ang‐(1‐7),  although  a  direct  cleavage  of  Ang‐(1‐12)  into  Ang  II, 

particularly in SD hearts, cannot be excluded.   

In the study reported by Nagata et al. (10), the cardiac content of Ang‐(1‐12), 

Ang  I,  and Ang  II  averaged 151 ± 11 pmol/L,  85 ± 8 pmol/L,  and  42 ± 7 pmol/L, 

respectively.  In other words, the content of Ang‐(1‐12) is about twice as large that 

of  Ang  I.   We measured  peak  concentrations  of  Ang  I  and  Ang  II  in  the  coronary 

effluent that averaged 531.5 ± 48.4 pmol/L and 594.8 ± 72.6 pmol/L, respectively, 

across all strains, which represents no more than 6‐14 fold higher than was found 

endogenously by Nagata and colleagues.  These data suggest that studies in isolated 

hearts reflect to a significant degree what may be the tissue dynamics in vivo.   

169

Because others have found that the tetradecapeptide [Ang‐(1‐14)] is cleaved 

by  renin  (8;  9;  13),  we  administered  a  rat  renin‐specific  inhibitor  concomitantly 

with  Ang‐(1‐12)  to  the  perfusate  of  WKY  and  SHR  isolated  hearts  to  determine 

whether Ang‐(1‐12), like Ang‐(1‐14), was a suitable substrate for renin activity.  As 

indicated  above,  renin  inhibition  did  not  alter  the  production  of  any  of  the 

angiotensin  peptides,  nor  did  it  affect  heart  rate  or  perfusion  pressures.  

Additionally, we verified, in both perfused and non‐perfused hearts, that renin was 

present  in  the  heart  by measuring  its  tissue  activity  as well  as  the  activity  in  the 

cardiac effluent.  Therefore, our data show that Ang‐(1‐12), unlike Ang‐(1‐14), is not 

cleaved  by  renin,  which  corroborates  recent  studies  from  our  group  (3).    Renin 

specifically cleaves the Leu10‐Leu11 bond of rat angiotensinogen to form Ang I, while 

the cleavage between the two aromatic residues Tyr12‐Tyr13 liberates Ang‐(1‐12).  A 

lack  of  differential  processing  of  Ang‐(1‐12)  between  the  Lewis  and  congenic 

mRen2.Lewis rats also supports a non‐renin role for the metabolism of Ang‐(1‐12) 

in the heart, as the mRen2.Lewis rats express elevated cardiac renin levels (2).   

Further  support  for a biological  role of Ang‐(1‐12)  in  the heart  stems  from 

studies  that showed that Ang‐(1‐12) was robustly present  in ventricular myocytes 

of  both  WKY  and  SHR  (6).    Evidence  of  functionality  is  further  illustrated  by 

increased  cardiac  content  of  Ang‐(1‐12)  in  the  SHR  compared  to WKY.    That  this 

peptide was found in most tissues at higher levels than both Ang I and Ang II (10) — 

in concert with the findings of the current study — asserts that Ang‐(1‐12) may be a 

readily‐available substrate for angiotensin peptide production.   

170

 

LIMITA NTIO S OF STUDY 

  The  data  presented  herein  is  a  critical  first  step  to  understanding  the 

ultimate role that Ang‐(1‐12) may play  in cardiovascular physiology.   The purpose 

of  this  initial  study was  to determine whether  the dodecapeptide could serve as a 

substrate  for  the  formation  of  Ang  I,  Ang  II,  and  Ang‐(1‐7)  in  the  hearts  of  five 

different  rat  strains,  and  as  such,  the  enzymatic  mechanisms  accounting  for  the 

formation  of  Ang‐(1‐12)  from  angiotensinogen  were  outside  the  scope  of  the 

present study.  While not designed to determine enzymatic mechanisms, the current 

study undertook steps to exclude renin in the metabolism of Ang‐(1‐12) into any of 

the  three  downstream  angiotensin  peptides  measured.    Moreover,  based  on 

preliminary studies from our group (3), the direct enzymatic conversion of Ang‐(1‐

12) into Ang I and Ang‐(1‐7) appears to be mediated by serum ACE and renal NEP, 

respectively.  Further studies will be required to determine how exactly Ang‐(1‐12) 

can be metabolized in not only the heart, but in other tissues critical in physiological 

egulation. r

 

CONCLUSIONS 

In  the  century  since  Tigerstedt  and  Bergmann  first  described  renin  (14), 

many advances have be made regarding the contributions of the renin‐angiotensin 

system to  the regulation of cardiovascular processes.    Indeed,  the effective clinical 

treatment of hypertension and heart  failure arrived almost 100 years after renin’s 

discovery —  first  with  the  introduction  of  ACE  inhibitors  in  1981,  later  with  the 

advent of ARBs in 1995, and most currently with the development and arrival of the 

171

renin  inhibitor,  aliskiren,  in  2007.    The  identification  of  an  angiotensin  peptide 

upstream  of  Ang  I  that  can  serve  as  a  substrate  to  produce  bioactive  angiotensin 

peptides  is  a  novel  and  important  finding.    Although  it  is  not  yet  known  what 

enzyme(s)  can  cleave  Ang‐(1‐12)  from  its  parent  protein,  angiotensinogen,  the 

possibility  that  this  process may occur  in  a  renin‐independent manner holds high 

potential  to change our evolving understanding of the renin‐angiotensin system in 

the  regulation  of  physiological  processes.    In  support  of  a  renin‐independent 

pathway  for  angiotensin  peptide  formation,  Oparil  and  colleagues  (12)  recently 

showed  that  in  patients  treated  with  maximal  doses  of  both  the  renin  inhibitor 

aliskiren  and  the  AT1  antagonist  valsartan,  there  were  additive  blood  pressure 

reductions —  an  unexpected  finding  if  renin  is  the  sole  liberator  of  angiotensin 

peptides.    Indeed,  we  suggest  that  Ang‐(1‐12)  may  serve  as  a  “quick‐release” 

substrate for the immediate production of the RAS components as necessary, which 

may  likely  be  more  efficient  than  the  cell  making  the  almost  500‐amino  acid 

angiotensinogen for the production of angiotensin peptides.   The unraveling of the 

functional significance of Ang‐(1‐12), as well as the pathways  for its formation and 

degradation, should bear considerable importance.     

 

ACKNOWLEDGEMENTS 

This  work  was  supported  by  the  National  Institutes  of  Health  (HL‐51952,  HL‐

56973).    Aaron  J.  Trask  was  supported  by  an  award  from  the  American  Heart 

Association, Mid‐Atlantic Affiliate (#0715249U).  Additionally, the authors gratefully 

172

acknowledge  grant  support  in  part  provided  by  Unifi,  Inc.,  Greensboro,  NC,  and 

Farley‐Hudson Foundation, Jacksonville, NC. 

173

REFERENCES 

   1.   Chappell  MC.  Emerging  evidence  for  a  functional  angiotensin‐converting 

enzyme 2‐angiotensin‐(1‐7)‐MAS receptor axis: more than regulation of blood 

pressure? Hypertension 50: 596‐599, 2007. 

  2.   Chappell MC, Gallagher PE, Averill DB, Ferrario CM and Brosnihan KB. Estrogen 

or  the  AT1  antagonist  olmesartan  reverses  the  development  of  profound 

hypertension  in  the  congenic  mRen2.Lewis  rat.  Hypertension  42:  781‐786, 

2003. 

  3.   Chappell, M. C., Westwood, B. M., Pendergrass, K. D., Jessup, J. A., and Ferrario, 

C. M. Distinct Processing Pathways for the Novel Peptide Angiotensin‐(1‐12) in 

the Serum and Kidney of the Hypertensive mRen2.Lewis Rat. Hypertension 50: 

e139, 2007.  Abstract. 

  4.   Ferrario CM, Jessup J, Chappell MC, Averill DB, Brosnihan KB, Tallant EA, Diz DI 

and  Gallagher  PE.  Effect  of  angiotensin‐converting  enzyme  inhibition  and 

angiotensin  II receptor blockers on cardiac angiotensin‐converting enzyme 2. 

Circulation 111: 2605‐2610, 2005. 

  5.   Ferrario CM,  Jessup  J, Gallagher PE, Averill DB, Brosnihan KB, Ann TE,  Smith 

RD  and  Chappell  MC.  Effects  of  renin‐angiotensin  system  blockade  on  renal 

174

angiotensin‐(1‐7)  forming  enzymes and  receptors. Kidney  Int  68: 2189‐2196, 

2005. 

  6.   Jessup, J. A., Chappell, M. C., Nagata, S., Kato, J., Kitamura, K., and Ferrario, C. M. 

Localization of the Novel Angiotensin Peptide, Proangiotensin‐12, in the Heart 

and  Kidney  of  Hypertensive  and  Normotensive  Rats. Hypertension  50:  e101, 

2007.  Abstract. 

  7.   Lindpaintner  K,  Jin  MW,  Niedermaier  N, Wilhelm  MJ  and  Ganten  D.  Cardiac 

angiotensinogen and its local activation in the isolated perfused beating heart. 

Circ Res 67: 564‐573, 1990. 

  8.   Mendelsohn FA and Johnston CI. A radiochemical renin assay. Biochem  J 121: 

241‐244, 1971. 

  9.   Montague  D,  Riniker  B,  Brunner  H  and  Gross  F.  Synthesis  and  biological 

activities  of  a  tetradecapeptide  renin  substrate.  Am  J  Physiol  210:  591‐594, 

1966. 

 10.   Nagata  S,  Kato  J,  Sasaki K, Minamino N,  Eto T  and Kitamura K.  Isolation  and 

identification  of  proangiotensin‐12,  a  possible  component  of  the  renin‐

angiotensin system. Biochem Biophys Res Commun 350: 1026‐1031, 2006. 

175

 11.   Nakamura S, Averill DB, Chappell MC, Diz DI, Brosnihan KB and Ferrario CM. 

Angiotensin  receptors  contribute  to  blood  pressure  homeostasis  in  salt‐

depleted SHR. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 284: R164‐R173, 2003. 

 12.   Oparil S, Yarows SA, Patel S, Fang H, Zhang J and Satlin A. Efficacy and safety of 

combined  use  of  aliskiren  and  valsartan  in  patients  with  hypertension:  a 

randomised, double‐blind trial. Lancet 370: 221‐229, 2007. 

 13.   Skeggs  LT,  Jr.,  Lentz  KE,  Kahn  JR  and  Shumway  NP.  The  synthesis  of  a 

tetradecapeptide renin substrate. J Exp Med 108: 283‐297, 1958. 

 14.   Tigerstedt R. and Bergman P.G. Niere und Kreislauf. Scan Arch Physiol 8, 223‐

271. 1898.  

 15.   Trask AJ, Averill DB, Ganten D, Chappell MC and Ferrario CM. Primary role of 

angiotensin‐converting enzyme‐2 in cardiac production of angiotensin‐(1‐7) in 

transgenic  Ren‐2  hypertensive  rats.  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  292: 

H3019‐H3024, 2007. 

 16.   Trask, A.  J.,  Jessup,  J. A., and Ferrario, C. M. Angiotensin‐(1‐12)  is a Precursor 

for  the  Processing  of  Cardiac  Tissue  Angiotensin  Peptides.  Hypertension  50: 

e154. 2007.  Abstract. 

176

 17.   Welches WR, Brosnihan KB and Ferrario CM. A comparison of  the properties 

and enzymatic activities of three angiotensin processing enzymes: angiotensin 

converting  enzyme,  prolyl  endopeptidase  and  neutral  endopeptidase  24.11. 

Life Sci 52: 1461‐1480, 1993. 

 18.   Zisman LS, Meixell GE, Bristow MR and Canver CC. Angiotensin‐(1‐7) formation 

in the  intact human heart:  in vivo dependence on angiotensin II as substrate. 

Circulation 108: 1679‐1681, 2003. 

 

 

177

Table VII.1.  Time course of heart rates (BPM) in all strains studied. 

178

Table VII.1          5 Min     15 Min     30 Min     60 Min     P SD    253 ± 10    210 ± 16    238 ± 10    228 ± 9    * 0.02 Lewis    251 ± 15 

 

  234 ± 14   

  223 ± 10    205 ± 26       0.06 Congenic    219 ± 8 

237 ± 24  200 ± 19231 ± 12

  212 ± 14 186 ± 17 

  211 ± 20 181 ± 13 

     0.69    0.28 WKY   

SHR     234 ± 9    206 ± 9    203 ± 15    195 ± 16        0.27  

179

Table  VII.2.    Time  course  of  perfusion  pressures  (mmHg)  in  all  strains 

studied. 

 

 

180

Table VII.2 

      5 Min    15 Min    30 Min    60 Min     P SD    64 ± 9  83 ± 18  105 ± 27  170 ± 48    † 0.004Lewis    64 ± 4  64 ± 8    74 ± 13  131 ± 48       0.13 Congenic    63 ± 5 

66 ± 5 67 ± 8 66 ± 4 

  74 ± 13   74 ± 6 

109 ± 39 113 ± 12 

     0.22 † 0.005WKY   

SHR     72 ± 5  73 ± 7    80 ± 14  110 ± 22        0.09  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

181

Table VII.3.   Pooled  angiotensin  peptide  correlations  from  SD,  Lewis,  and 

congenic rat cardiac effluent.  All Pearson correlation values (r) are P < 0.0001. 

 

182

Table VII.3 

      Ang I    Ang II    Ang­(1­7) Ang I    ‐    0.72    0.51 Ang II    0.72    ‐    0.71 Ang­(1­7)     0.51    0.71    ‐ 

 

 

 

 

 

 

183

Figure VII.1.   Ang I, Ang II, and Ang‐(1‐7) production from exogenous Ang‐

(1‐12) in isolated SD rat hearts (n = 6).  Both Ang I and Ang II peaked at 30 minutes 

of recirculation (Ang I: 191 ± 34 pmol/L; Ang II: 364 ± 81 pmol/L), while Ang‐(1‐7) 

steadily increased until 60 minutes of recirculation (97 ± 31 pmol/L).  * P = 0.0003, 

and † P < 0.0001 vs. baseline.   

184

 FIGURE VII.1 

 

185

Figure VII.2.   Ang I, Ang II, and Ang‐(1‐7) production from exogenous Ang‐

(1‐12) in isolated Lewis (A, n = 4) and mRen2.Lewis congenic (B, n = 4) rat hearts.  

Ang I peaked at 30 minutes of recirculation in both Lewis and congenic (489 ± 112 

pmol/L  and  625  ±  116  pmol/L,  respectively),  while  both  Ang  II  and  Ang‐(1‐7) 

steadily  increased  until  60  minutes  of  recirculation  [Ang  II:  493  ±  190  pmol/L 

(Lewis), 628 ± 133 pmol/L (congenic); Ang‐(1‐7): 126 ± 39 pmol/L (Lewis), 96 ± 13 

pmol/L  (congenic)].    There was  no  statistical  difference  in  any  of  the  angiotensin 

peptides between Lewis and congenic rat hearts.   * P < 0.01, † P < 0.001, and ‡ P < 

0.0001 vs. baseline. 

186

 FIGURE VII.2 

 

187

Figure  VII.3.    Ang  I  (Top  panels),  Ang  II  (Middle  panels),  and  Ang‐(1‐7) 

[Bottom  panels]  production  from  exogenous  Ang‐(1‐12)  in  isolated  WKY  (Left 

panels, n = 6) and SHR (Right panels, n = 6) hearts.  Ang I and Ang II both peaked at 

30 minutes of recirculation in both WKY and SHR (Ang I: 676 ± 49 pmol/L and 644 ± 

68  pmol/L,  respectively;  Ang  II:  620  ±  139  pmol/L  and  808  ±  216  pmol/L, 

respectively), while Ang‐(1‐7)  steadily  increased  until  60 minutes  of  recirculation 

[228  ±  58  pmol/L  (WKY),  204  ±  54  pmol/L  (SHR)].    There  was  no  statistical 

difference in any of the angiotensin peptides between WKY and SHR hearts, nor did 

renin  inhibition  alter  the production of  any of  the  angiotensin peptides measured 

(represented by open circles/dotted lines).  * P < 0.05 and † P < 0.01 vs. baseline. 

 

188

 FIGURE VII.3 

189

CHAPTER VIII 

 

VIII.1  SUMMARY AND GENERAL DISCUSSION 

 

  Knowledge on the existence of the renin‐angiotensin system (RAS) as a major 

physiological  regulator  has  been  growing  since  Tigerstedt  and  Bergman  first 

discovered the enzyme renin over a century ago (36).  In 1934, Dr. Harry Goldblatt 

and  colleagues  (17),  as  recounted  by  Basso  and Terragno  (3),  developed  the  first 

successful experimental model of hypertension by clipping the renal artery in dogs.  

Using  this  experimental model nearly 60 years after  the  initial discovery of  renin, 

Irvine  Page  from  the  United  States  and  Braun  Menendez  from  Argentina 

independently discovered a pressor hormone, “angiotonin” or “hypertensin”, which 

was  later  agreeably  called  “angiotensin”  (Ang)  due  to  its  relative  ease  of 

pronunciation  in  different  accents  (4).    We  now  know  this  hormone  to  be  the 

octapeptide  pressor  hormone,  Ang  II,  which  is  produced  from  the  sequential 

cleavage of the protein angiotensinogen into Ang I by renin, and Ang I into Ang II by 

angiotensin converting enzyme (ACE). 

Knowledge on the expansion of the renin‐angiotensin system has been on the 

rise since the discovery of Ang‐(1‐7) in 1988 (33).  Twelve years later, the discovery 

by  two  independent  laboratories  (12;  37)  of  an  enzyme  that  can  directly  and 

efficiently convert Ang II  into Ang‐(1‐7) accelerated acceptance of a critical role of 

Ang‐(1‐7)  in  cardiovascular  regulation.   Because angiotensin  converting enzyme 2 

(ACE2)  links  the  two  functionally‐opposing  arms  of  the  RAS,  we  evaluated  first 

190

whether  cardiac  ACE2  can  directly  cleave  Ang  II  into  Ang‐(1‐7)  and  to  further 

determine  whether  a  regulatory  shift  in  the  enzyme  may  disrupt  the  balance  of 

these  two  opposing  Ang  peptides.    Moreover,  we  also  hypothesized  that  the 

inhibition  of  endogenous  cardiac  ACE2  would  shift  the  balance  between  the  two 

peptides towards the pro‐hypertrophic peptide, Ang II, resulting in the accelerated 

progression of cardiac hypertrophy and  fibrosis.   Unexpectedly,  the discovery of a 

new  angiotensin  peptide,  Ang‐(1‐12),  adds  an  additional  dimension  to  the 

understanding of the biochemical processes leading to the formation of angiotensin 

peptides as this substrate may serve as an alternate pathway for the production of 

downstream angiotensin peptides, including Ang II and Ang‐(1‐7) (39).  The studies 

outlined in this dissertation firstly investigated the role of  cardiac ACE2 in directly 

cleaving  Ang  II  into  Ang‐(1‐7),  with  further  examination  revealing  a  shift  in  the 

balance of  the  two peptides  in response  to chronic ACE2  inhibition.   Furthermore, 

additional  studies  included  in  this dissertation show that Ang‐(1‐12) can generate 

downstream bioactive angiotensin peptides in the heart.   

  Studies  utilizing  the  isolated  heart  preparation  first  showed  a  differential 

role for the production of Ang‐(1‐7) from Ang II by ACE2 (38).   In these studies, the 

production of Ang‐(1‐7)  from exogenous Ang  II was not different between normal 

Sprague‐Dawley  and  hypertensive  [mRen2]27  transgenic  rat  hearts;  however,  the 

administration  of  MLN‐4760,  the  ACE2‐specific  inhibitor,  almost  completely 

abolished Ang‐(1‐7) production in the hypertensive hearts only.  These studies were 

the  first  to  show  that  the  hypertensive  heart  is  heavily  reliant  upon ACE2  for  the 

generation of Ang‐(1‐7) from Ang II.  In keeping with these findings, work by others 

191

showed  increased  ACE2  expression  and/or  activity  in  human  and  rodent  heart 

failure  (5;  18;  43).    Moreover,  Pendergrass  et  al.  (30)  found  that  cardiac  ACE2 

activity  tended  to  be  elevated  in  the  hypertrophic  hearts  of  the  congenic  rats, 

although  one  other  study  suggested  that  ACE2  expression  was  attenuated  in  the 

hearts  of  SHR  rats  (42).    Because  of  the  results  of  our  study,  together  with  the 

aforementioned  findings, we postulated  that ACE2 may be part of a compensatory 

mechanism  by  which  the  heart  adapts  to  allow  it  to  shift  the  production  of 

angiotensins  from  the  pro‐hypertrophic  and  pro‐fibrotic  Ang  II  into  the  anti‐

hypertrophic and anti‐fibrotic Ang‐(1‐7).  

Because ACE2 was critical  in maintaining Ang‐(1‐7) production  from Ang II 

only  in the Ren‐2 hypertensive rats, we investigated the direct role of endogenous 

ACE2 in mediating the balance of Ang II and Ang‐(1‐7) in the heart and we further 

determined  its  role  in  cardiac  structure  and  function  in  this  strain.    For  these 

experiments, we administered an ACE2‐specific inhibitor, MLN‐4760, to [mRen2]27 

hypertensive rats chronically  for 4 weeks.   As expected,  four‐week treatment with 

the ACE2  inhibitor resulted  in a significant 28% reduction  in the Ang‐(1‐7)/Ang II 

ratio—data  that  show  for  the  first  time  a  direct  imbalance  of  these  local  cardiac 

angiotensin peptides.   Of critical  importance, the resultant accumulation of cardiac 

Ang II observed with chronic ACE2 blockade was associated with marked increases 

in  left  ventricular  wall  thickness,  myocyte  cross‐sectional  area,  and  interstitial 

fibrosis.    Cardiac  function  remained  unchanged.    These  studies  coincide with  our 

previous  observation  showing  significant  dependence  on  cardiac  ACE2  in 

metabolizing Ang  II  into Ang‐(1‐7).   However,  these  studies  go  a  step  further  and 

192

show  that  the  imbalance  of  these  two  peptides  may  facilitate  the  progression  of 

cardiac hypertrophy, and eventually the development of heart failure.  These studies 

illustrate  the  ability  of  ACE2  blockade  to  exacerbate  cardiac  remodeling  in  the 

absence  of  changes  in  blood  pressure  or  cardiac  function  (illustrated  in  Figure 

VIII.1),  although  a  longer  duration  of  treatment  may  have  expedited  the 

development of cardiac dysfunction.  When interpreted together with other studies, 

our  research  supports  an  increasing  role  of  cardiac ACE2  in  compensated  cardiac 

hypertrophy through heart failure, although based on these studies and those from 

other  laboratories,  the  ability  of  the  enzyme  to  produce  Ang‐(1‐7)  may  be 

insufficient  to  counteract  the  deleterious  overactivity  of  Ang  II  on  the  heart.  

Moreover, the finding that Ang‐(1‐7) is degraded by ACE may suggest a disconnect 

between ACE2 and Ang‐(1‐7) because although ACE2 may be  increased  in  cardiac 

hypertrophy and heart failure, its efforts may be tempered by elevated ACE activity 

to degrade Ang‐(1‐7) in these disease states.   

One  of  the  more  unexpected  findings  of  our  initial  study  (38)  was  the 

demonstration that ACE2 was secreted from the heart.  This secreted form of ACE2 

(sACE2), as shown on a western blot at ~80 kDa, appeared to a lesser extent in the 

normal  Sprague‐Dawley  cardiac  effluent,  whereas  sACE2  protein  expression 

appeared  markedly  increased  in  the  effluent  from  the  hypertensive  rat  heart.  

Perhaps more importantly, we also showed that this sACE2 was more active in the 

effluent  from hearts  isolated  from hypertensive  rats.   Based on  these  findings, we 

first postulated that the loss of ACE2 from the heart may contribute, at least in part, 

to  the hypertrophic  response  seen  in  the hypertensive  rats,  and may  facilitate  the 

193

progression to heart failure.  This postulate was recently supported by a study that 

reported  increasing circulating sACE2  in patients with  increasing severity of heart 

failure  (14).    Further  support  for  these  findings  stems  from data  that  showed  the 

tumor  necrosis  factor  convertase,  ADAM17,  can  shed  ACE2  from  the  membrane 

(25),  and  that  the  enzyme  is  increased  in  human  heart  failure  (15).    Collectively, 

these studies show that in the stages of compensated cardiac hypertrophy through 

later stages of heart failure, the loss of ACE2 by shedding from the heart may have 

deleterious effects on the organ in terms of its ability to generate local Ang‐(1‐7) in a 

tissue with elevated  local Ang  II.   Future studies may support  a  role  for  inhibiting 

ADAM17 in heart failure so that the heart may retain ACE2.  

The  finding  that  ACE2  blockade  in  hearts  isolated  from  normal  Sprague‐

Dawley  rats  did  not  reduce  Ang‐(1‐7)  production  from  Ang  II  (38)  led  us  to 

determine what  other  enzymes may  be  responsible  for  Ang‐(1‐7)  formation  from 

Ang II in this strain.  In 1971, Walter et al. (40) discovered an enzyme found in the 

human uterus  that  cleaved oxytocin  at  the  carboxy‐terminal proline‐leucine bond.  

Thus, the enzyme was named post‐proline cleaving enzyme for its action.  Since its 

discovery, the enzyme was renamed prolyl oligopeptidase 21.26 (POP).   Koida and 

Walter (23) later discovered that this enzyme cleaved the post‐proline bond of not 

only  oxytocin  and  bradykinin,  but  also  Ang  II,  yielding  Ang‐(1‐7).    Furthermore, 

studies  from  our  laboratory  first  showed  that  POP  could  produce  Ang‐(1‐7)  from 

Ang  I  in  brain  and  vascular  endothelial  cells  (32;  41).    Kato  and  colleagues  (22) 

investigated  the  tissue  and  brain  distribution  of  POP  and  found  that  POP  activity 

was found in all tissues, including the heart.  Although little is known about POP and 

194

its  role  in  the  heart,  POP  activity was  higher  in  normal  atria  of male Wistar  rats 

compared  to  rats with one‐kidney,  one‐clip hypertension,  providing  evidence  that 

POP may be  important  in Ang  II processing  in  the heart  (8).    Based on  the  above 

findings, we  perfused  normal  Sprague‐Dawley  hearts with  Ang  II  in  the  presence 

and  absence  of  the  POP  inhibitor  ZPP,  on which my  advisor  holds  a  patent,  (U.S. 

Patent  Number  5,451,571).    In  these  experiments,  we measured  Ang‐(1‐7)  in  the 

cardiac effluent before and following inhibition of POP.  As expected, Ang‐(1‐7) was 

produced from Ang II  in the normal heart (Figure A.1) at  levels comparable to our 

previous study (38).   However,  the addition of ZPP did not alter  the magnitude or 

pattern of Ang‐(1‐7) production (Figure A.1).  These studies suggest that POP is not 

involved in the production of Ang‐(1‐7) from Ang II in hearts isolated from normal 

rats.   

Because ZPP  is not  entirely  specific  to POP  (35),  and because  it  is possible 

that the lysosomal serine protease Pro‐X carboxypeptidase (PCP, E.C. 3.4.16.2) may 

contribute  to  Ang  II  metabolism  in  the  arterial  circulation  (34),  we  conducted 

additional  isolated heart  studies  in  the presence  and  absence  of  the  non‐selective 

serine  protease  inhibitor,  4‐(2‐Aminoethyl)benzenesulfonyl  fluoride  (AEBSF).  

AEBSF  did  not  reduce  the  level  of  Ang‐(1‐7)  produced  from Ang  II  in  the  cardiac 

effluent  (Figure  A.2).    Collectively,  these  studies  show  that  ACE2,  POP,  nor  other 

serine  proteases  contribute  to  the  direct  formation  of  Ang‐(1‐7)  from  Ang  II  in 

hearts isolated from normal Sprague‐Dawley rats.   The identity of another enzyme 

that may  cleave  the  Pro7‐Phe8  bond  of  Ang  II  remains  to  be  clarified.    One  of  the 

candidates may be a little‐known enzyme called membrane Pro‐X carboxypeptidase 

195

(carboxypeptidase P, EC 3.4.17.16), which can cleave the Pro7‐Phe8 bond of Ang II to 

produce  Ang‐(1‐7)  in  vascular  smooth  muscle  cells  (28).    This  membrane‐bound 

enzyme  is  distinct  from  the  lysosomal  PCP  as  described  by  Dr.  Ervin  Erdös’ 

laboratory  and  above.    Although  this  enzyme  is  a  metallopeptidase  that  can  be 

inhibited  by  ethylenediaminetetraacetic  acid  (EDTA),  its  use  in  isolated  heart 

studies  is  not  optimal  due  to  the  chelation  of  Ca2+  by  EDTA.    Further  studies  are 

warranted  to  investigate  the  contribution  of  an  unknown  enzyme(s)  to  the 

hydroly  sis of Ang II into Ang‐(1‐7) in normal hearts.  

The  potential  for  an  alternate  precursor  that  may  yield  downstream 

bioactive  angiotensin  peptides  is  indeed  intriguing.    Our  finding  that  Ang‐(1‐12) 

serves  as  a  biological  precursor  peptide  for  downstream  angiotensin  peptide 

production  is  a  novel  and  exciting  piece  of  a  puzzle  that  has  been  under 

investigation  for  well  over  a  century.    Given  the  propensity  of  studies  that  have 

investigated  angiotensin  peptides  within  the  realm  of  the  heart,  there  have  been 

some unexplainable observed phenomena.   For example, many studies report  that 

the  cardiac  RAS  is  very  minimally  expressed  based  on  studies  that  showed  little 

angiotensinogen  and/or  renin  mRNA  (13;  21).    Moreover,  some  studies  have 

reported  the  production  of  angiotensin  peptides  from  the  parent  protein 

angiotensinogen only when renin was added to the perfusate of isolated rat hearts 

(11).    There  are  also  studies  showing  that  cardiac  angiotensins  fall  dramatically 

after  bilateral  nephrectomy  (6;  10),  a  maneuver  long  used  to  determine  the 

contribution  of  renal  renin  to  physiological  processes.    Collectively,  these  studies 

argue that cardiac angiotensins are derived from the circulation.  However, Leenen 

196

and  colleagues  (26)  showed  that  after  coronary  artery  ligation  in  rats  that  were 

bilaterally‐nephrectomized,  local  cardiac  angiotensin  peptides  were  actually 

augmented.    This  raises  the  question,  “from  where  did  the  angiotensin  peptides 

originate?”    If  several  studies  showed  that  cardiac angiotensins  fall  in  response  to 

bilateral nephrectomy,  the  local peptides observed  in Dr. Leenen’s study are  likely 

not der o e nived fr m th  circulatio .   

Other  data  involving  renin  inhibition  provide  further  evidence  for  a 

disconnect in the cardiac renin‐angiotensin system physiology.  For example, Oparil 

and  colleagues  (29)  found  additive  reductions  in  blood  pressure  in  patients 

chronically  treated with maximal  doses  of  both  the  angiotensin  receptor  blocker, 

valsartan,  and  the  renin  inhibitor,  aliskiren,  versus  each  treatment  alone.    This 

finding  is  unexpected  if  renin  is  the  sole  liberator  of  angiotensin  peptides.  

Furthermore,  preliminary  data  from  our  laboratory  show  that  the  acute 

administration  of  the  rat  renin  inhibitor,  WFML‐1,  to  SHR  rats  reduced  blood 

pressure  and  plasma  Ang  II,  but  unexpectedly,  plasma  Ang  I  was  augmented  in 

response  to  renin  inhibition.    Again,  if  renin  is  the  rate‐limiting  step  for  the 

formation of angiotensin peptides, then Ang I should have been reduced in response 

to renin inhibition.  It is for all of the above unexplained findings that we postulated 

that Ang‐(1‐12) may be an  intermediate storage depot  that  is readily available  for 

the production of downstream Ang II and/or Ang‐(1‐7).  In this regard, we showed 

(39) that Ang I, Ang II, and Ang‐(1‐7) could be produced from exogenous Ang‐(1‐12) 

in hearts  isolated  from three normotensive and two hypertensive rat strains.   One 

possibility is that, depending on the tissue distribution of processing enzymes, Ang‐

197

(1‐12) may be able to preferentially produce Ang peptides to either Ang II or Ang‐

(1‐7).    For  example,  Jessup  et  al.  in  our  laboratory  (20)  found  that  Ang‐(1‐12) 

concentration  and  immunolocalization  was  actually  augmented  in  the  hearts  of 

hypertensive  SHR  rats  compared  to  normal  WKY.    In  that  same  study,  it  was 

reported that local cardiac Ang II was augmented in the SHR heart (20).  Chappell et 

al. (7), in a preliminary report, suggested that ACE rapidly and sequentially cleaves 

Ang‐(1‐12) into Ang I and again into Ang II.  The finding of elevated cardiac Ang‐(1‐

12) in SHR may contribute, at least in part, to the elevated concentration of local Ang 

II  in  this  hypertensive  model.    Moreover,  in  the  same  abstract,  Chappell  and 

colleagues also reported that neprilysin can directly cleave Ang‐(1‐12) into Ang‐(1‐

7) in kidneys (7).  Because NEP is higher in kidneys relative to other tissues (27; 31), 

this  may  represent  a  preferential  cleavage  of  Ang‐(1‐12)  to  Ang‐(1‐7).    Further 

studies  to address  these  issues are of  the utmost  importance as  they may provide 

better,  salternative treatments for hypertension and/or heart disea e. 

The  findings  outlined  in  this  dissertation  on  the  cardiac  renin‐angiotensin 

system relative to what is known or supported by us and others are highlighted in 

blue in Figure VIII.2.  We showed that the coronary circulation can process peptides, 

including  Ang‐(1‐12)  and  Ang  II  into  bioactive  metabolites.    This  processing  is 

dependent upon the localization and distribution of the enzymes that arbitrate their 

hydrolysis.  Moreover, we found that ACE2 and renin can both be secreted from the 

heart  either  from  the  vasculature  directly  or  from  the  surrounding  cells  and/or 

interstitial  space.   Within  the  local  tissue, we also showed  that a disruption  in  the 

balance of Ang II and Ang‐(1‐7) results in response to ACE2 blockade.  Because we 

198

did  not  observe  any  changes  in  circulating  Ang  II  or  Ang‐(1‐7),  but  there  was  a 

significant  imbalance  in  the Ang‐(1‐7)/Ang  II  ratio within  the  cardiac  tissue  itself, 

these data suggest that the imbalance was created in an extra‐coronary space, likely 

the  interstitium,  as  ACE2  activity  is  only  reported  in  cardiomyocytes,  and  not 

fibroblasts (16; 19).   The augmentation of cardiac Ang II caused significant cardiac 

hypertrophy,  as  indicated  by  increases  in  both  anterior  and  posterior  wall 

thicknesses,  as well  as  increased  cardiomyocyte  cross‐sectional  area.    Our  finding 

that ACE2 blockade resulted in increased collagen expression further suggests that 

the  mechanism  of  blockade  occurred  at  cardiomyocytes  in  the  interstitium,  as 

cardiac fibroblasts lack ACE2 activity (16; 19).  It is my belief that the future of the 

treatment  of  heart  disease  lies  in  determining  the  mechanism(s)  by  which  these 

different  RAS  component  move  and  act  amongst  compartments,  i.e.  among  the 

corona n pry circulation, i terstitial s ace, and the intracellular space.   

The  successes  of  current  treatment  regimens  for  patients  diagnosed  with 

heart  failure,  as  well  as  in  animal  models,  are  focused  on  blocking  the  synthesis 

and/or actions of Ang II (1; 9), lending to the notion that the action of cardiac Ang II 

is elevated in these patients.   The studies completed in this dissertation show that 

alternative mechanisms may  lend  to  alternative  therapeutic  approaches.    Despite 

the  successes  of  ACE  inhibitors  and ARBs,  heart  disease  remains  the  number  one 

cause of mortality in both the United States (24) and worldwide (2).  Further strides 

on  the ultimate role of ACE2 and more recently, Ang‐(1‐12) must be made so  that 

patients can be afforded longer, high‐quality lives.  

 

199

R EFERENCES 

  1.    Effects  of  ramipril  on  cardiovascular  and microvascular  outcomes  in  people 

with diabetes mellitus: results of the HOPE study and MICRO‐HOPE substudy. 

Heart Outcomes Prevention Evaluation Study  Investigators. Lancet  355: 253‐

259, 2000. 

  2.   Preventing  Chronic  Diseases:  A  Vital  Investment.    2008.    World  Health 

Organization.  Report. 

  3.   Basso N and Terragno NA. History about the discovery of the renin‐angiotensin 

system. Hypertension 38: 1246‐1249, 2001. 

  4.   Braun‐Menendez  E  and  Page  IH.  Suggested  Revision  of  Nomenclature‐‐

Angiotensin. Science 127: 242, 1958. 

  5.   Burrell LM, Risvanis J, Kubota E, Dean RG, MacDonald PS, Lu S, Tikellis C, Grant 

SL,  Lew  RA,  Smith  AI,  Cooper  ME  and  Johnston  CI.  Myocardial  infarction 

increases ACE2 expression in rat and humans. Eur Heart J 26: 369‐375, 2005. 

  6.   Campbell  DJ,  Kladis  A  and  Duncan  AM.  Nephrectomy,  converting  enzyme 

inhibition, and angiotensin peptides. Hypertension 22: 513‐522, 1993. 

200

  7.   Chappell, M. C., Westwood, B. M., Pendergrass, K. D., Jessup, J. A., and Ferrario, 

C. M. Distinct Processing Pathways for the Novel Peptide Angiotensin‐(1‐12) in 

the  Serum  and  Kidney  of  the  Hypertensive  mRen2.Lewis  Rat.  Hypertension 

50(4), e139. 2007.  Abstract. 

  8.   Cicilini MA, Ramos PS, Vasquez EC and Cabral AM. Heart prolyl endopeptidase 

activity in one‐kidney, one clip hypertensive rats. Braz J Med Biol Res 27: 2821‐

2830, 1994. 

  9.   Dahlof  B,  Devereux  RB,  Kjeldsen  SE,  Julius  S,  Beevers  G,  de  FU,  Fyhrquist  F, 

Ibsen H,  Kristiansson K,  Lederballe‐Pedersen  O,  Lindholm  LH,  Nieminen MS, 

Omvik P, Oparil S and Wedel H. Cardiovascular morbidity and mortality in the 

Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension study (LIFE): a 

randomised trial against atenolol. Lancet 359: 995‐1003, 2002. 

 10.   Danser  AH,  van  Kats  JP,  Admiraal  PJ,  Derkx  FH,  Lamers  JM,  Verdouw  PD, 

Saxena PR and Schalekamp MA. Cardiac renin and angiotensins. Uptake  from 

plasma versus in situ synthesis. Hypertension 24: 37‐48, 1994. 

 11.   de  Lannoy  LM,  Danser  AH,  van  Kats  JP,  Schoemaker  RG,  Saxena  PR  and 

Schalekamp MA. Renin‐angiotensin system components in the interstitial fluid 

of  the  isolated  perfused  rat  heart.  Local  production  of  angiotensin  I. 

Hypertension 29: 1240‐1251, 1997. 

201

 12.   Donoghue M, Hsieh F, Baronas E, Godbout K, Gosselin M, Stagliano N, Donovan 

M,  Woolf  B,  Robison  K,  Jeyaseelan  R,  Breitbart  RE  and  Acton  S.  A  novel 

angiotensin‐converting  enzyme‐related  carboxypeptidase  (ACE2)  converts 

angiotensin I to angiotensin 1‐9. Circ Res 87: E1‐E9, 2000. 

 13.   Dzau VJ, Ellison KE, Brody T, Ingelfinger J and Pratt RE. A comparative study of 

the distributions of renin and angiotensinogen messenger ribonucleic acids in 

rat and mouse tissues. Endocrinology 120: 2334‐2338, 1987. 

 14.   Epelman  S,  Tang  WH,  Chen  SY,  Van  LF,  Francis  GS  and  Sen  S.  Detection  of 

soluble  angiotensin‐converting  enzyme  2  in  heart  failure:  insights  into  the 

endogenous counter‐regulatory pathway of the renin‐angiotensin‐aldosterone 

system. J Am Coll Cardiol 52: 750‐754, 2008. 

 15.   Fedak  PW,  Moravec  CS,  McCarthy  PM,  Altamentova  SM, Wong  AP,  Skrtic  M, 

Verma  S,  Weisel  RD  and  Li  RK.  Altered  expression  of  disintegrin 

metalloproteinases  and  their  inhibitor  in  human  dilated  cardiomyopathy. 

Circulation 113: 238‐245, 2006. 

 16.   Gallagher  PE,  Ferrario  CM  and  Tallant  EA.  Regulation  of  ACE2  in  Cardiac 

Myocytes and Fibroblasts. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008. 

202

 17.   Goldblatt H, Lynch J, Hanzal RF, and Summerville WW. Studies on experimental 

hypertension,  I:  the  production  of  persistent  elevation  of  systolic  blood 

pressure by means of renal ischemia. J Exp Med 59, 347‐379. 1934.  

 18.   Goulter AB, Goddard MJ, Allen  JC  and Clark KL. ACE2  gene  expression  is  up‐

regulated in the human failing heart. BMC Med 2: 19, 2004. 

 19.   Grobe JL, Der SS, Stewart JM, Meszaros JG, Raizada MK and Katovich MJ. ACE2 

overexpression  inhibits  hypoxia‐induced  collagen  production  by  cardiac 

fibroblasts. Clin Sci (Lond) 113: 357‐364, 2007. 

 20.   Jessup JA, Trask AJ, Chappell MC, Nagata S, Kato J, Kitamura K and Ferrario CM. 

Localization of the novel angiotensin peptide, angiotensin‐(1‐12), in heart and 

kidney of hypertensive and normotensive rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol 

294: H2614‐H2618, 2008. 

 21.   Kalinyak  JE  and  Perlman  AJ.  Tissue‐specific  regulation  of  angiotensinogen 

mRNA accumulation by dexamethasone. J Biol Chem 262: 460‐464, 1987. 

 22.   Kato T, Okada M and Nagatsu T. Distribution of post‐proline cleaving enzyme 

in human brain and the peripheral tissues. Mol Cell Biochem 32: 117‐121, 1980. 

 23.   Koida  M  and  Walter  R.  Post‐proline  cleaving  enzyme.  Purification  of  this 

endopeptidase by affinity chromatography. J Biol Chem 251: 7593‐7599, 1976. 

203

 24.   Kung  HC,  Hoyert  DL,  Xu  JQ  and  Murphy  SL.  Deaths:  Final  Data  for  2005.  

Hyattsville, MD: National Center for Health Statistics, 2008. 

 25.   Lambert DW, Yarski M, Warner FJ, Thornhill P, Parkin ET, Smith AI, Hooper NM 

and  Turner  AJ.  Tumor  necrosis  factor‐alpha  convertase  (ADAM17)  mediates 

regulated  ectodomain  shedding  of  the  severe‐acute  respiratory  syndrome‐

coronavirus  (SARS‐CoV) receptor, angiotensin‐converting enzyme‐2 (ACE2).  J 

Biol Chem 280: 30113‐30119, 2005. 

 26.   Leenen  FH,  Skarda  V,  Yuan  B  and  White  R.  Changes  in  cardiac  ANG  II 

postmyocardial  infarction  in  rats: effects of nephrectomy and ACE  inhibitors. 

Am J Physiol 276: H317‐H325, 1999. 

 27.   Llorens C and Schwartz JC. Enkephalinase activity in rat peripheral organs. Eur 

J Pharmacol 69: 113‐116, 1981. 

 28.   Mentlein R and Roos T. Proteases involved in the metabolism of angiotensin II, 

bradykinin,  calcitonin  gene‐related  peptide  (CGRP),  and  neuropeptide  Y  by 

vascular smooth muscle cells. Peptides 17: 709‐720, 1996. 

 29.   Oparil S, Yarows SA, Patel S, Fang H, Zhang J and Satlin A. Efficacy and safety of 

combined  use  of  aliskiren  and  valsartan  in  patients  with  hypertension:  a 

randomised, double‐blind trial. Lancet 370: 221‐229, 2007. 

204

 30.   Pendergrass  KD,  Pirro  NT,  Westwood  BM,  Ferrario  CM,  Brosnihan  KB  and 

Chappell  MC.  Sex  differences  in  circulating  and  renal  angiotensins  of 

hypertensive  mRen(2).Lewis  but  not  normotensive  Lewis  rats.  Am  J  Physiol 

Heart Circ Physiol 295: H10‐H20, 2008. 

 31.   Ronco  P,  Pollard  H,  Galceran  M,  Delauche  M,  Schwartz  JC  and  Verroust  P. 

Distribution  of  enkephalinase  (membrane  metalloendopeptidase,  E.C. 

3.4.24.11) in rat organs. Detection using a monoclonal antibody. Lab Invest 58: 

210‐217, 1988. 

 32.   Santos  RA,  Brosnihan  KB,  Jacobsen  DW,  DiCorleto  PE  and  Ferrario  CM. 

Production of angiotensin‐(1‐7) by human vascular endothelium. Hypertension 

19: II56‐II61, 1992. 

 33.   Schiavone MT, Santos RA, Brosnihan KB, Khosla MC and Ferrario CM. Release 

of  vasopressin  from  the  rat  hypothalamo‐neurohypophysial  system  by 

angiotensin‐(1‐7) heptapeptide. Proc Natl Acad Sci U S A 85: 4095‐4098, 1988. 

 34.   Tamaoki  J,  Sugimoto  F,  Tagaya  E,  Isono  K,  Chiyotani  A  and  Konno  K. 

Angiotensin  II  1  receptor‐mediated  contraction  of  pulmonary  artery  and  its 

modulation by prolylcarboxypeptidase. J Appl Physiol 76: 1439‐1444, 1994. 

 35.   Tan F, Morris PW, Skidgel RA and Erdos EG. Sequencing and cloning of human 

prolylcarboxypeptidase  (angiotensinase  C).  Similarity  to  both  serine 

205

carboxypeptidase  and prolylendopeptidase  families.  J Biol Chem  268:  16631‐

16638, 1993. 

 36.   Tigerstedt R. and Bergman P.G. Niere und Kreislauf. Scan Arch Physiol 8, 223‐

271. 1898. 

 37.   Tipnis SR, Hooper NM, Hyde R, Karran E, Christie G and Turner AJ. A human 

homolog of angiotensin‐converting enzyme. Cloning and functional expression 

as  a  captopril‐insensitive  carboxypeptidase.  J  Biol  Chem  275:  33238‐33243, 

2000. 

 38.   Trask AJ, Averill DB, Ganten D, Chappell MC and Ferrario CM. Primary role of 

angiotensin‐converting enzyme‐2 in cardiac production of angiotensin‐(1‐7) in 

transgenic  Ren‐2  hypertensive  rats.  Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  292: 

H3019‐H3024, 2007. 

 39.   Trask  AJ,  Jessup  JA,  Chappell  MC  and  Ferrario  CM.  Angiotensin‐(1‐12)  is  an 

alternate  substrate  for  angiotensin  peptide  production  in  the  heart.  Am  J 

Physiol Heart Circ Physiol 294: H2242‐H2247, 2008. 

 40.   Walter R, Shlank H, Glass  JD, Schwartz  IL and Kerenyi TD. Leucylglycinamide 

released from oxytocin by human uterine enzyme. Science 173: 827‐829, 1971. 

206

 41.   Welches WR,  Santos RA,  Chappell MC, Brosnihan KB, Greene  LJ  and Ferrario 

CM. Evidence that prolyl endopeptidase participates in the processing of brain 

angiotensin. J Hypertens 9: 631‐638, 1991. 

 42.   Zhong JC, Huang DY, Yang YM, Li YF, Liu GF, Song XH and Du K. Upregulation of 

angiotensin‐converting  enzyme  2  by  all‐trans  retinoic  acid  in  spontaneously 

hypertensive rats. Hypertension 44: 907‐912, 2004. 

 43.   Zisman  LS,  Keller  RS, Weaver  B,  Lin Q,  Speth R,  Bristow MR  and  Canver  CC. 

Increased angiotensin‐(1‐7)‐forming activity in failing human heart ventricles: 

evidence  for  upregulation  of  the  angiotensin‐converting  enzyme  Homologue 

ACE2. Circulation 108: 1707‐1712, 2003. 

 

 

 

207

Figure VIII.1.  Diagrammatic representation illustrating the increasing role 

for ACE2 in cardiac remodeling, but not cardiac function in our studies, as it relates 

to blood pressure and different heart conditions from normal through overt heart 

failure.  DD = diastolic dysfunction.   

208

 

FIGURE VIII.1 

 

209

Figure VIII.2.  Diagrammatic representation how the studies outlined in this 

dissertation  (highlighted  in  blue)  fit  into what  is  known  about  the  cardiac  renin‐

angiotensin system.  Dotted lines represent unknown potential enzymatic pathways; 

Dotted  interrupted  lines  represent  the  potential  movement  of  proteins  and/or 

peptides among compartments within the heart.   

 

210

 

FIGURE VIII.2 

 

211

APPENDIX 

  

Figure A.1.   Ang‐(1‐7) formation from Ang II measured by RIA in SD hearts 

(n  =  8).  Ang‐(1‐7)  production  from  Ang  II  was  significant  from  baseline  values 

(represented  at  time=0).    The  addition  of  the  POP  inhibitor,  ZPP,  at  15  minutes 

exhibited  no  significant  reduction  of  Ang‐(1‐7)  generation  throughout  the  60‐

minute recirculation experiment. 

            

212

0 20 40 600

200

400

600ControlZPP

Recirculation Time (Min)

SD Ang­(1­7) [pM]

FIGURE A.1              

 

 

 

 

213

Figure A.2.   Ang‐(1‐7) formation from Ang II measured by RIA in SD hearts 

(n  =  8).  Ang‐(1‐7)  production  from  Ang  II  was  significant  from  baseline  values 

(represented at time=0).  The addition of the serine protease inhibitor, AEBSF, at 15 

minutes exhibited no significant reduction of Ang‐(1‐7) generation  throughout  the 

60‐minute recirculation experiment. 

214

0 20 40 600

200

400

600

ControlAEBSF

Recirculation Time (Min)

SD Ang­(1­7) [pM]

FIGURE A.2  

    

  

  

215

CURRICULUM VITAE  

AARON J. TRASK  

April 24, 1980 Richmond, Indiana, U.S.A. 

B  

ORN: 

EDUCATION: 

004‐Present  e School of Arts and Sciences  

ty Graduat2 Wake Forest Universi  Winston‐Salem, North Carolina 

logy   Doctor of Philosophy   Graduate Program: Physiology and Pharmaco

Laboratory Advisor: Dr. Carlos M. Ferrario r Research Center 

   Hypertension and Vascula 999‐2003 1 Ohio Northern University 

Ada, Ohio Bachelor of Science, Biology 

   EMPLOYMENT

004‐Present 

:  

gram 2 Graduate Fellow 

raduate Prof Medicine 

  Physiology and Pharmacology GWake Forest University School o

orth Carolina    Winston‐Salem, N 001‐2003   2 Nurse’s Assistant

Wayne Hospital Greenville, Ohio 

   R S:   ESEARCH SKILL 

Isolatean

  d vessel ring bath preparations ations 

n v  L gendorff isolated heart prepar

I ivo   cardiac catheterization for measurement of dP/dt,      pressure‐volume relationship   In vivo blood vessel catheterization (carotid, femoral , jugular) for  

d pressure and administration of drugs n of  

    measurement of bloo  Surgical procedure for subcutaneous and intravenous insertio

otic pumps essure surgery, measurements, and  

    mini‐osm  Radiotelemetry blood pr    analysis 

216

  Immunohistochemistry   Western blot hybridization   Peptide extraction and preparation for HPLC 

  

Radioimmunoassay 

FELLOWSHIP

007‐Present  l  

S:  2 American Heart Association Mid‐Atlantic Affiliate Pre‐Doctora

715249U).  Aaron J. Trask, PI.  “The  ‐(1‐7) Axis in Heart Failure.”  Total Award  

  Fellowship (AHA 0ACE2/Angiotensin 

  Amount: $40,000 

004‐2007  ship, Wake Forest University Graduate School of Arts   

Dean’s Fellowand Sciences 

2  HONO ARDS: RS AND AW 009  d Professionals 2 Marquis Who’s Who Among Executives an2008  Merck New Investigator Award, American Heart Association  

ressure Research el  

  Council for High Blood P2007  American Heart Association Hypertension Summer School Trav

l Award   Award 

ol Alumni Trave2006‐2007 Wake Forest University Graduate Scho2000‐2003 Ohio Northern University Arts & Sciences Scholarship 

n’s List rship Award  

1999‐2003 Ohio Northern University Dea2003 1999‐ Ohio Northern University Achievement/Leade

ship   Scholarship 

n’s Scholarholarship 

1999  Ohio Northern University Dea999  Tiffany Furgason Memorial Sc999  Arcanum Alumni Scholarship 11 PROFESSIONA LIATIONS: L AFFI 

rch 2005‐Present  American Heart Association  

ressure Resea  Council for High Blood P2005‐Present  American Physiological Society (APS)   Cardiovascular Section 2005‐Present  Consortium for Southeastern Hypertension Control 001‐Present  Beta Beta Beta National Biology Honor Society 001‐Present  Omicron Delta Kappa National Leadership Honor Society 22 PROF  

ssure  

ESSIONAL DEVELOPMENT: 

22008  6 nd American Heart Association Council for High Blood Pre

uate    Research Annual Meeting, Atlanta, Georgia 2008  3rd Annual National Institutes of Health National Grad

217

  Student Research Festival, Bethesda, Maryland 2008  Experimental Biology Meeting, San Diego, California 2007  61st American Heart Association Council for High Blood Pressure  

  Research Annual Meeting, Tucson, Arizona ool, Fort  2007  6th American Heart Association Hypertension Summer Sch

  Collins, Colorado f Hypertension / Consortium for  2007  Inter‐American Society o

  Southeast Hypertension Control Annual Meeting, Miami Beach,  

006  igh Blood Pressure    Florida 

60th American Heart Association Council for HResearch Annual Meeting, San Antonio, Texas 

2  TEACHING  RIENCE: 

007‐2008  

EXPE

2 Lecturer, Winston‐Salem State University Physical Therapy  ‐Salem, North Carolina.  Lectures on cardiac  ular exercise physiology, hemorrhagic shock,  

  Program, Winstonoutput, cardiovasc 

  and heart failure   

006  t of Physiology   

Graduate Tutor, Wake Forest University Departmen2  and Pharmacology, Winston‐Salem, North Carolina 

001‐2003  nterpersonal   

Student Tutor, Ohio Northern University ICommunications Skills Center, Ada, Ohio  

2  ORGANIZATIONS/ACTIVITIES: 

of   

t 2006  Student Member, Wake Forest University Departmen  Physiology and Pharmacology Curriculum Committee 001‐2003  an, Judicial Board, Ohio Northern University 000‐2003  an, Judicial Committee, Ohio Northern University Student  2 Chairm

ChairmSenate 

2  COMMUNIT VICE: 

006‐2007  art & Stroke Walk,  

Y SER 

Team Captain, American Heart Association HeTanglewood Park, Clemmons, North Carolina 

2  PUBLICATIONS:  BOOK CHAPTERS: 

Trask  AJ,  Varagic  J,  Ahmad  S,  Ferrario  CM.    “Angiotensin‐(1‐7),  Angiotensin Converting Enzyme 2, and New Components of the Renin‐Angiotensin System.”  Renin‐Angiotensin  System  and  Cardiovascular  Disease.    Ed.  De  Mello  W.C.  & Frohlich E.D.  Totowa: Humana Press, Submitted.  

218

Trask  AJ,  Ferrario  CM.    “The  Renin‐Angiotensin  System  and  the  Heart.”  Textbook  of  Nephro‐Endocrinology.    Ed.  Singh  A.  &  Williams  G.    San  Diego: 

. Elsevier, 2009. 181‐188

Ferrario CM, Jessup JA, Trask AJ, Varagic J.  “Basic Science in Hypertension.”  The Year in Hypertension.  Ed. Townsend R.  Oxford: Clinical Publishing, 2008. 1‐17. 

JOURNAL ARTICLES: 

Trask AJ, Groban L, Westwood BM, Varagic J, Ganten D, Gallagher PE, Chappell MC,  Ferrario  CM.    Disruption  of  Cardiac  Angiotensin  Peptides  by  Angiotensin Converting Enzyme 2 Inhibition Excacerbates Cardiac Hypertrophy and Fibrosis 

Rats.  In P  in Ren‐2 Hypertensive  reparation for Hypertension 2008.   

Ferrario  CM,  Varagic  J,  Habibi  J,  Nagata  S,  Kato  J,  Chappell  MC,  Trask  AJ, Kitamura  K,  Whaley‐Connell  A,  Sowers  JR.    Differential  Regulation  of Angiotensin‐(1‐12)  in  Plasma  and  Cardiac  Tissue  in  Response  to  Bilateral Nephrectomy.  Submitted to Am J Physiol Heart Circ Physiol 2008. 

Jessup  JA, Trask AJ,  Chappell  MC,  Nagata  S,  Kato  J,  Kitamura  K,  Ferrario  CM.  Localization  of  the  Novel  Angiotensin  Peptide,  Angiotensin‐12,  in  Heart  and Kidney of Hypertensive and Normotensive Rats.  Am J Physiol Heart Circ Physiol 

: H2614‐H2008; 294 2618. 

Varagic  J, Trask AJ,  Jessup  JA, Chappell MC, Ferrario CM.   New Angiotensins.    J Mol Med 2 0 6 ‐0 8; 86:  63 71. 

Trask  AJ,  Jessup  JA,  Chappell  MC,  Ferrario  CM.    Angiotensin‐(1‐12)  is  an Alternate  Substrate  for  Angiotensin  Peptide  Production  in  the  Heart.    Am  J Physiol Heart Circ Physiol 2008; 294: H2242‐H2247. 

Trask AJ, Ferrario CM.  Angiotensin‐(1‐7): Pharmacology and New Perspectives in Cardiovascular Treatments.   Cardiovascular Drug Reviews  2007; 25(2):  162‐174. 

Trask  AJ,  Averill  DB,  Ganten  D,  Chappell  MC,  Ferrario  CM.    Primary  Role  of Angiotensin Converting Enzyme 2 in Cardiac Production of Angiotensin‐(1‐7) in Transgenic Ren‐2 Hypertensive Rats.  Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007; 292: 

4. H3019‐H302

Ferrario CM, Trask AJ, Jessup JA.  Advances in Biochemical and Functional Roles of Angiotensin‐Converting Enzyme 2 and Angiotensin‐(1–7) in the Regulation of Cardiovascular  Function.    Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  2005;  289:  H2281‐2290. H

 

219

ABSTRACTS:   

Trask AJ, Groban L, Varagic J, Ferrario CM.  Inhibition of Angiotensin Converting Enzyme  2  Aggravates  Cardiac  Hypertrophy  in  Ren‐2  Hypertensive  Rats.    16th Annual Wake Forest University Surgical Sciences Research Day, 2008.

Trask AJ, Groban L, Varagic J, Ferrario CM.  Inhibition of Angiotensin Converting Enzyme  2  Aggravates  Cardiac  Hypertrophy  in  Ren‐2  Hypertensive  Rats.  Hypertension 2008; 52(4):e126.  

Ferrario  CM,  Varagic  J,  Chappell  MC,  Trask  AJ,  Nagata  S,  Kato  J.    Bilateral Nephrectomy  Augments  the  Cardiac  Content  of  Angiotensin‐(1‐12)  and Angiotensin I in Wistar‐Kyoto Rats.  Hypertension 2008; 52(4): e126. 

Trask AJ,  Jessup JA, Tallant EA, Chappell MC, Ferrario CM.   Renin‐Independent Processing  of  Angiotensin‐(1‐12)  in  the  Rat  Heart  and  Isolated  Myocytes.  Hypertension 2008; 52(4):e45‐e46 (Selected for oral presentation).

Trask AJ,  Jessup JA, Tallant EA, Chappell MC, Ferrario CM.   Renin‐Independent Processing of Angiotensin‐(1‐12) in the Rat Heart and Isolated Myocytes.  Third Annual  NIH  National  Graduate  Student  Research  Festival,  Bethesda,  Maryland 

tation).(Selected for presen

Jessup JA, Habibi J, Trask AJ, Chappell MC, Nagata S, Kato J, Kitamura K, Sowers J, Ferrario  CM.    Experimental  Hypertension  is  Associated  with  Differential Expression  of  Angiotensin‐(1‐12)  in  Heart  of  Hypertensive  and  Normotensive Rats.  FASEB, 2008. 

Trask  AJ,  Jessup  JA,  Ferrario  CM.    Angiotensin‐(1‐12)  is  a  Precursor  for  the Processing  of  Cardiac  Tissue  Angiotensin  Peptides.    8th  Annual  Wake  Forest University G  raduate Student Research Day, 2008.

Trask  AJ,  Jessup  JA,  Ferrario  CM.    Angiotensin‐(1‐12)  is  a  Precursor  for  the Processing  of  Cardiac  Tissue  Angiotensin  Peptides.    15   Annual  Wake  Forest University S

th

  urgical Sciences Research Day, 2007.

Trask  AJ,  Jessup  JA,  Ferrario  CM.    Angiotensin‐(1‐12)  is  a  Precursor  for  the Processing  of  Cardiac  Tissue Angiotensin  Peptides.   Hypertension  2007;  50(4): e154. 

Trask  AJ,  Chappell  MC,  Ferrario  CM.    Major  Role  for  Angiotensin  Converting Enzyme 2 in Cardiac Angiotensin‐(1‐7) Production in the Congenic Hypertensive mRen2.Lewis Rat.  Hypertension 2007; 50(4): e140. 

Trask AJ, Averill DB, Chappell MC, Ferrario CM.   Predominance of Angiotensin Converting  Enzyme  2  to  Cardiac  Angiotensin‐(1‐7)  Production  in  [mRen2]27 

220

Transgenic Hypertensive Rats.  Inter‐American Society of Hypertension/COSEHC Annual Scientific Meeting, Miami Beach, Florida, 2007.

Trask AJ, Averill DB, Chappell MC, Ferrario CM.   Predominance of Angiotensin Converting  Enzyme  2  to  Cardiac  Angiotensin‐(1‐7)  Production  in  [mRen2]27 Transgenic Hypertensive Rats.  Hypertension 2006; 48(4): e72.

Trask  AJ, Averill  DB, Chappell  MC, Ferrario  CM.   Cardiac  Production  of Angiotensin‐(1‐7)  by  Angiotensin  Converting  Enzyme  2.   13th  Annual  Wake 

ical Sciences Research Day, 2005.  Forest University Surg

ORAL PRESENTATIONS:   

“New Advances on  the Biochemical Pathways  in  the Renin‐Angiotensin System and  their  Role  in  Cardiac  Structure  and  Function.”    Nationwide  Children’s Hospital, Columbus, Ohio, 2008.   

“Renin‐Independent  Processing  of  Angiotensin‐(1‐12)  in  the  Rat  Heart  and Isolated  Myocytes.”    62nd  Council  for  High  Blood  Pressure  Research,  Atlanta, Georgia, 2008.   

“New Advances on the Biochemical Pathways of  the Cardiac Renin‐Angiotensin System.”  Wake Forest University Department of Physiology and Pharmacology, Winston‐Salem, North Carolina, 2007. 

“The  Cardioprotective  Effects  of  the  ACE2/Ang‐(1‐7)  Axis  in  Heart  Failure.”  Wake Forest University Department of Physiology and Pharmacology, Winston‐Salem, North Carolina, 2006. 

“The  Cardioprotective  Effects  of  the  ACE2/Ang‐(1‐7)  Axis  in  Heart  Failure.”  Wake Forest University Department of Physiology and Pharmacology, Winston‐

006. Salem, North Carolina, 2

POSTER PRESENTATIONS:   

“Inhibition  of  Angiotensin  Converting  Enzyme  2  Aggravates  Cardiac Hypertrophy in Ren‐2 Hypertensive Rats.”   16th Annual Wake Forest University 

‐S  C 20 8Surgical Sciences Day, Winston alem, North arolina,  0 . 

 “Inhibition  of  Angiotensin  Converting  Enzyme  2  Aggravates  Cardiac Hypertrophy in Ren‐2 Hypertensive Rats.”  62nd Council for High Blood Pressure Research, Atlanta, Georgia, 2008.  

“Angiotensin‐(1‐12)  is  a  Precursor  for  the  Processing  of  Cardiac  Tissue Angiotensin  Peptides.”    8th  Annual  Wake  Forest  University  Graduate  Student Research Day, 2008. 

221

“Angiotensin‐(1‐12)  is  a  Precursor  for  the  Processing  of  Cardiac  Tissue Angiotensin  Peptides.”    15th  Annual  Wake  Forest  University  Surgical  Sciences Day, Winston‐Salem, North Carolina, 2007. 

“Angiotensin‐(1‐12)  is  a  Precursor  for  the  Processing  of  Cardiac  Tissue Angiotensin Peptides.”   61st American Heart Association Council for High Blood Pressure Research, Tucson, Arizona, 2007.  

“Major Role  for Angiotensin Converting Enzyme 2  in Cardiac Angiotensin‐(1‐7) Production  in  the  Congenic  Hypertensive  mRen2.Lewis  Rat.”    61st  American Heart  Association  Council  for  High  Blood  Pressure  Research,  Tucson,  Arizona, 2007.   

“Predominance of Angiotensin Converting Enzyme 2 to Cardiac Angiotensin‐(1‐7)  Production  in  [mRen2]27  Transgenic  Hypertensive  Rats.”    Inter‐American Society  of  Hypertension/COSEHC  Annual  Scientific  Meeting,  Miami  Beach, Florida, 2007. 

“Predominance of Angiotensin Converting Enzyme 2 to Cardiac Angiotensin‐(1‐7)  Production  in  [mRen2]27  Transgenic  Hypertensive  Rats.”    60th  American Heart Association Council for High Blood Pressure Research, San Antonio, Texas, 2006. 

“Cardiac Production of Angiotensin‐(1‐7) by Angiotensin Converting Enzyme 2.”  13th Annual Wake Forest University Surgical Sciences Day, Winston‐Salem, North Carolina, 2005.  

 

   

222