Samenvatting

Moleculaire biologie: chapter 10: Eukaryotic RNA polymerases and their promotors

1 Multiple forms of Eukaryotic RNA polymerase

Verschillende vroege studies suggereerden dat er minstens twee RNA polymerasen aanwezig moesten zijn in eukaryote nuclei: één dat instaat voor de transcriptie voor de aanmaak van rRNA, en één voor de transcriptie van de andere genen.Eén van de redenen dat dit werd aangenomen is dat de genen voor rRNA zeer sterk verschillen van de andere genen: (1) zij hebben een andere base samenstelling dan deze van de andere nucleaire genen. Zo heeft bijvoorbeeld het rRNA van ratten een GC gehalte van 60%, terwijl dit in de andere genen slechts 40% is. (2) ze zijn bijzonder repetitief; afhankelijk van het organisme kan een cel enkele honderden tot 20 000 kopies van een rRNA gen bevatten. (3) zij komen voor in een ander comaprtiment in de kern – de nucleolus – dan de rest van de nucleaire genen. Dit en andere overwegingen suggereerden de aanwezigheid van minstens twee RNA polymerasen voorkwamen in de kern. Eén ervan synthetiseerd rRNA in de nucleolus, het andere polymerase de rest van het RNA in het nucleoplasma.

1.1 Seperation of the three nuclear polymerases

Roeder en Rutter toonde 1969 aan dat eukaryoten niet twee, maar drie verschillende RNA polymerasen hebben. Deze polymerasen hebben elk een verschillende rol in de cel. De drie enzymen werden van elkaar gescheiden (na isolatie uit de kernen van cellen van de lever van ratten) door DEAE (Diëthylaminoëthyl) sephadex (dextraan) ion exchange chromatography.Zij numerden de drie polymerasen, in de volgorde dat ze van de kolom kwamen: RNA polymerase I, RNA polymerase II en RNA polymerase III.De drie polymerasen hebben nog andere verschillen in eigenschappen naast hun verscjil in affiniteit voor de DEAE-sephadex kolom. Zo hebben zij bijvoorbeeld verschillende responsen op ionensterkte en divalente metaalionen. De meest belangrijke verschillen liggen in het feit dat ze instaan voor de aanmaak van verschillende types van RNA.

1

Roeder en Rutter zuiverde hierna nucleoplasma en nucleolus op, ma na te gaan of er inde subnucleaire compartimenten een aangereikte hoeveelheid was van een type polymerase. Onderstaande figuur geeft aan dat polymerase I hoofdzakelijk aanwezig is in de nucleolus en dat polymerase II en II aangetroffen worden in het nucleoplasma. Dit maakt het zeer waarschijnlijk dat polymerase I het polymerase is dat rRNA synthetiseerd en dat polymerasen II en III instaan voor de aanmaak van andere types van RNA.

1.2 The role of the three RNA polymerases

Hoe weten we dat de verschillende RNA polymerasen een verschillende functie hebben bij de transcriptie. De duidelijkste bewijzen hiervoor komen van in vitro studies waarbij de opgezuiverde polymerasen werden gebruikt om genen af te schrijven. Hierbij werd aangetoond dat sommige genen, maar niet alle genen door een type van het RNA polymerase. Polymerase staat in voor de aanmaak van de precursor van rRNA. In zoogdieren heeft deze precursor een sedimentatie coëfficiënt van 45S. Deze wordt hierna verwerkt tot 28S, 18S en 5,8S matuur rRNA.

2

Polymerase II maakt een onduidelijk gedefinieerde klasse van RNA moleculen aan: heterogeen nucleair RNA (hnRNA) en precursors voor microRNA (miRNA) en de meeste small nuclear RNA(snRNA). hnRNA bestaat hoofdzakelijk uit precursors voor mRNA (pre mRNA). snRNA heeft een rol in de maturatie van pre mRNA tot mRNA. miRNA reguleert de expressie van verschillende genen door degradatie van mRNA of door limitatie van de transcriptie.Polymerase III staat in voor de aanmaak van de precursor van tRNA, 5sRNA en sommige andere kleine RNA moleculen.

3

RNA polymerase eigenschappenRNA pol I (RNA pol A) = rpa

RNA pol II (RNA pol B) = rpb

RNA pol III (RNA pol C) = rpc

DEAE sephadex Lage zoutconc Midelmatige zoutconc

Hoge zoutconc

Plaats Target genen Nucleolus60% GCRepetitief

Nucleoplasma40% GC

Nucleoplasma40% GC

TRanscripten Grote precursor rRNA(voor 28S,18S en 5,8S rRNA)

hnRNAsnRNAmiRNA

tRNA5S rRNAU6 snRNA7SL RNA

Inhibitor Actinomycine D α-amanitine α-amanitine (hoge conc)

Echter voordat er gekloonde genen en eukaryote in vitro systemen werden gebruikt waren er al aanwijzingen voor deze transcriptie patronen. Dit werk werd uitgevoerd door Roeder et al, en was gebaseerd op het toxine α-amanitine. Deze zeer toxische substantie wordt gemaakt door enkel giftige paddenstoelen, waaronder Amanita phalloides die de bijna “the death cap” heeft en Amanita bisporigera die ook wel “angel of death” wordt genoemd.

α-anamitine heeft verschillende effecten op de drie RNA polymerasen. Bij lage concentraties zorgt het voor de volledige inhibitie van polymeresae II, maar heeft het geen effect op polymerase I en III. Als de concentratie met een 1000-voud wordt vergroot, dan zal het toxine ook polymerase III inhiberen.

4

In het experiment werd de rol van polymerase III nagegaan door kernen van muizen cellen te incuberen met α-amanitine. Hierbij werd er een reeks gemaakt; waarbij de concentratie steeds werd toegenomen. Hierna werden de trnascripten elektroforetisch gescheiden om na te gaan welk effect het toxine had op de synthese van kleine RNA moleculen. Uit de reusltaten blijkt dat de synthese van 5S rRNA en 4S tRNA precursor werd geïnhibeerd. Het patroon van de inhibitie komt overeen met het inhibitie patroon van RNA polymerase III, wat de hypothese ondersteunde dat RNA polymerase III verantwoordelijk is voor de synthese ervan. Later werd ook aangetoond dat polymerase III ook andere kleine RNA moleculen aanmaakt.Gelijkaardige experimenten werden uitgevoerd om na te gaan welke genen door RNA polymerase I en II werden afgeschreven. De bekomen patronen waren moeilijk te inerpreteren. De resultaten ervan zijn met grotere zekerheid achteraf geverifieerd via in vitro studies.

RNA polymerase I wordt geïnhibeerd door Actinomycine D, dat wordt gemaakt door Streptomyces. De inhibitie akn optreden doordat actinomycine D intercaleert in de DNA duplex ter hoogte van GC-rijke gebieden, en hoofdzakelijk in gebieden waar rRNA genen gelegen zijn.

5

1.3 RNA polymerase subunit structures

De eerste structuren van de structuren van eukaryoot RNA polymerase (polymerase II) werden onafhankelijk van elkaar geraporteerd door Chambon en Rutter in 1971. Deze structuren waren ver van compleet. De structuren van de 3 polymerasen zijn complex. Ze hebben 14 (polymerase I), 12 (polymerase II) en 17 (polymerase III) subeenheden. Polymerase II is het beste bestudeerd, en de rest van de bespreking zal dan ook gaan over dit polymerase.

Polymerase II structure

Enzymes die zo complex zijn als eukaryoot RNA polymerase is het moeilijk om te zeggen welke polypeptiden die mee worden opgezuiverd met de polymerase activiteit echt subeenheden zijn van het polymerase en welke eerder contaminanten zijn die sterk binden op het polymerase. Een manier om dit p te lossen is het scheiden van alle vermeende subeenheden en dan nagaan welke subeenhden noodzakelijk zijn om de polymeraseactiviteit te bekomen. Alhoewel deze methode goed heeft gewerkt voor het prokaryoot RNA polymerase is er niemand in geslaagd dit te doen voor het eukaryoot RNA polymerase. Dus is men op zoek gegaan naar een andere manier. Een andere methode om na te gaan welke polypeptiden noodzakelijk zijn voor de polymerase activiteit is door het opsporen van alle genen van de vermeende subeenheden, deze te muteren en zo na te gaan of de polymerase activiteit bewaard blijft. Dit is bewerkstelligd voor één eukaryoot RNA polymerase: het RNA polymerase II van S.cervisiae. Verschillende onderzoekers hebben de traditionele methoden gebruikt om het RNA polymerase op te zuiveren en identificeerden hiermee 10 vermoedelijk subeenheden. Later ontdekte zij nog 2 extra subeenheden. De genen voor al deze subeenheden zijn gesequenced, en systematisch gemuteerd en de effecten hiervan zijn bestudeerd. Onderstaande table geeft de 12 subeenheden weer voor humaan en S.cerevisae polymerase II weer, samen met de moleculaire massa’s en hun karkateristieken. Elk van deze polypeptiden wordt gecodeerd door een gen. De namen van de polymerase subeenheden zijn afgeleid van de naam van hun gen (Rpb1 wordt gecodeerd door RPB1).

Hoe zijn de structuren van polymerase I en III vergeleken met die van polymerase II? Te eerste zijn al de structuren complex. Ten tweede zijn al de polymerasen gelijk in het feit dat ze allen zijn uit twee grote (groter dan 100 kDa) subeenheden en een aantal kleinere. In dit opzicht lijken de structuren op die van prokaryote core RNA polymerase, dat ook bestaat twee grote subeenheden (β enβ’) en 3 kleinere subeenheden (2 keer α en ω).Uit de bovenstaande tabel kunnen we ook halen dat de drie eukaryote RNA polymerasen verschillende

6

subeenheden gemeenschappelijk hebben. Deze worden de coomon subunits genoemd. Deze zijn: Rpb5, Rpb6, Rpb8, Rpb10 en Rpb12.

Richard Young et al identificeerde in het begin 10 polymerase II subeenheden, of op zijn minst contaminanten die sterk gebonden waren op het polymerase. Om dit te doen maakte zij gebruik van de methode die epitoop tagging wordt genoemd. Bij deze methode wordt het gen van de vermeende subeenheif (Rpb3) genetisch gemanipuleerd, zodat het een vreemde epitoop (waartegen men AL heeft aangemaakt) eraan wordt gekoppeld. Het gemanipuleerde gen werd ingebouwd in een gistcel, die een defficiënt Rpb3 gen had. De cellulaire proteïnen werden gelabeld met 35S of 32P. Het enzym werd geprecipiteerd met behulp van een AL (tegen de ingebouwde epitoop). Na de immunoprecepitatie werden de gelabelde polypeptiden gescheiden met behulp van SDS PAGE en gedtecteerd met autoradiografie. Deze eenstapszuivering leverde zeer zuiver polymerase II op, dat opgebouwd leek uit 10 subeenheden. Dit experiment werd ook uitgevoerd door Kornberg et al, die 12 subeenheden kon onderscheiden. Rpb11 was gecoëlektroforeerd met Rpb9 en Rpb12 met Rpb10, zodat deze subeenheden in vorige experimenten over het hoofd gezien werden.

Doordat Young et al de samenstelling van de aminozuren van de subeenheden kenden, was het

7

mogelijk door aan de hand van de relatieve intensiteit de stoichiometrie van het RNA polymerase te bepalen. Deze is in onderstaande tabel weergegeven. Bovenstaande figuur met de resultaten geeft ook weer dat twee subeenhden gefosforyleerd worden, doordat zij ook gelabeld werden door 32P. Deze subeenheden zijn Rpb1 en Rpb6. Rpb2 wordt ook gefosforyleerd, maar dat is niet zichtbaar, doordat het zeer weinig gebeurd.

Core subunitsDe polypeptiden Rpb1, Rpb2 en Rpb3 zijn absoluut noodzakelijk voor de enzym activiteit. Ze zijn respectievelijk homoloog aan β, β’ en α.Common subuntisVijf subeenheden, RPb5, Rpb6, Rpb8, Rpb10 en Rpb12 worden gevonden in al de nucleiare polymerasen. Van hun functie is weinig geweten, maar het feit dat ze voorkomen in elk van de RNA polymerasen doet vermoeden dat ze een fundamentele rol spelen in het transcriptieproces.

Heterogenity of the Rpb1 subunit

Eén van de eerste studies van RNA polymerase II toonde aan dat er heterogeniteit was in de grootste subeenheid ervan. De hiernaaststaande figuur geeft dit weer voor polymerase II van een tumorcel in muizen (plasmacytoma cel). We zien dat er aan de top van de gel 3 bandjes aanwezig zijn in kleinere hoeveelheden dan c (IIc), die IIo, IIa en IIb worden genoemd. Deze drie polypeptiden zijn aan elkaar gerelateerd. De vraag is welk bandje is het originele polypeptide en welke bandjes zijn eruit ontstaan. Door sequentieanalyse van RPB1 voorspeld een polypeptide met een moleculaire massa van 210 kDa, wat overeenkomt met IIa. Door AZ sequentieanalyse is aangetoond dat IIb een repetitieve keten van zeven AZ mist (Tyr, Ser, Thr, Ser, Pro, Ser), die het CTD (corboxy terminaal Domein) vormt. AL die gericht zijn tegen dit CTD reageren met IIa, maar niet met IIb, wat de conclusie dat IIb het CTD mist versterkt. IIb is niet in vivo waargenomen, wat suggereert dat het ontstaat tijdens de zuivering van het proteïne. Verdere sequentieanalyse geeft aan dat dit CTD geen ordelijk gevouwen structuur is, zodat het makkelijk te prooi kan vallen aan proteolytische enzymen.De IIo subeenheid lijkt groter te zijn dat IIa, zodat het niet kan ontstaan

8

door proteolyse. Het lijkt in plaats daarvan een gefosforyleerde versie van IIa. Dit werd bevestigd doordat IIo naar IIa kan omgezet worden door het toevoegen van fosfatasen. Uit verder onderzoek blijkt dat serine 2,5 en soms 7 worden gefosforyleerd.De fosforylatie kan niet enkel het verschil in elektroforetische mobiliteit verklaren, maar ook een conformationele wijziging mee. Inderstaande figuur geeft de relatie tussen de drie subeenheden weer:

Het feit dat de cel twee vormen van Rpb1 bevat impliceert dat er twee vormen van het RNA polymerase bestaan. Deze worden RNA polymerase IIO en RNA polymerase IIA genoemd. De in vitro vorm met IIb wordt RNA polymerase IIB genoemd.RNA polymerase IIA en IIO hebben elk een andere rol in de cel. Experimentele bewijzen suggereren dat IIA wordt gebruikt tijdens de initiatie en dat IIO wordt gebruikt tijdens de eleongatie.

The Three-dimensional structure of RNA polymerase II

De meest geschikte methode om de structuur van een proteïne te bepalen is X-stralen kristallografie. Tot 1999 was het niet mogelijk om kristallen van RNA polymerase te maken die hoog genoeg van kwaliteit zijn voor kirstallografische studies. Het prbleem is te danken aan het feit dat het RNA polymerase heterogeen is. Het kan namelijk soms wel en soms niet de subeenheid Rpb4 en Rpb7 bevatten. Heterogene mengsels van proteïnen vormen zeer moeilijk kristallen. Kornberg et al losten dit probleem op door een mutant te maken (pol II ∆4/7) die beide subeenheden niet bevat. Dit polymerase is in staat om elongatie uit te voeren, maar niet om de transcriptie te initiëren. Dus het moet in staat zijn om gebruikt te worden om een model te maken van de elongatie. Hiervan werden kristallen geproduceerd met een resolutie van 2,8 Å in 2001. Onderstaande figuur geeft een sterobeeld van het RNA polymerase II van S.cerevisiae. Elk van de subeenheden is weergegevn in een verschillende kleur. De meest prominente structuur van het enzyme is de kloof waar het DNA bind, waar de active site gelegen is. De active site bevat Mg2+. De kloof lijkt op de klauw van een krab (net zoals bij het prokaryoot RNA polymerase). Het bovenste gedeelte is opgebouwd uit Rpb1 en Rpb9, de onderste uit Rpb5. De hypothese dat het DNA wordt gebonden in de kloof wordt versterkt doordat er basische AZ aanwezig zijn. Er zijn Twee magnesiumionen aanwezig in het RNA polymerase, die beide betrokken zijn bij de katalyse.

9

Vergelijking van de verschillende RNA polymerasen van de verschillende koninkrijken (Archae, Euabcteria en Eukaria) toont aan dat het RNA polymerase van hen alle zeer gelijkend zijn. Dit doet het vermoeden ontstaan dat dit enzyme al reeds aanwezig was in de gemeenschappelijke voorouder (logisch daar dit het enzym de eerste schakel vormt om proteïen aan te maken.

10

RNA polymerase elongation complex

In de vorige paragraaf is de structuur van het RNA polymerase II zelf besproken. Kornbreg et al hebben echter ook kristallen gemaakt van het Polymerase II als het gebonden was aan een DNA template en er RNA werd gevormd in een elongatiecomplex. De resolutie van de kristallen is niet groot, maar heft geeft toch een heleboel informatie.OM het polymerase te kunnen initiëren zonder hulp van een transcriptiefactor, werd er gebruik gemaakt van een template met aan de 3’ kant een enkelstrengige oligo [dC ]staart. Dit zorgt ervoor dat het polymerase kan initiëren op 2-3 nt voor de dubbelstrengige regio. Het template was zo ontwikkeld dat er een 14-mer kan worden gemaakt in afwezigheid van UTP. Van zodra dit moet worden ingebouwd, wordt de transcriptie gepaiseerd. Deze sequentie leverde een homogeen mengsel op van elongatiecomplexen, dat gecontamineerd is met niet actieve RNA polymerasen. Deze niet actieve polymerasen werden verwijderd op een heparine kolom. De complexen werden na zuivering gekristalliseerd.Onderstaande figuur geeft een doorsnede weer van het elongatie complex.

In onderstaande figuur wordt de 3D structuur van het complex weergegeven.

11

In deze figuur is te zien dat de clamp gesloten is als het DNA aanwezig is. Dit zal ervoor zorgen dat het polymerase in staat is het gen volledig te transcripteren zonder dat het van het polymerase loskomt en zo de transcriptie te vroeg te beëindigen. In de doorsnede in de bovenstaande figuur is er een gedetaileerder beeld te zien van het elongatiecomplex. Hierbij zien we dat er verschillende zaken in het enzym aanwezig zijn. We zien dat de DNA-RNA hybride een hoek vormt met het downstream gelegen dubbelstrengige DNA dat nog getranscripteerd moet worden. Deze hoek wordt geforceerd door de sluiting van de clamp. We zien ook dat Mg2+ aanwezig is in de katalytische site van het enzym – het punt waar er juist een nucleotide wordt toegevoegd aan de groeiende RNA keten. Dit ion (metal A) is gepositioneerd zo dat het kan binden met de fosfaatlinkende nucleotide +1 en -1. Het nucleotide op positie +1 ligt juist bij de ingang van pore 1, wat het vermoeden doet rijzen dat langs hier de nucelotiden worden aangevoerd.Voor de rest zien we een bridge helix dat de kloof overspant inde buurt van het actieve centrum. Deze zorgt ervoor dat het DNA template wordt opgeschoven zodra het nucleotide is ingebouwd, zodat het polymerase het volgende nucleotide kan inbouwen. De dwarsdoorsnede van het elongatiecomplex toont ook de rol van 3 lussen die lid, rudder en zipper worden genoemd. Deze lussen zorgen voor enkele belangrijke functies zoals de vorming van de transcriptie bubble en het uit elkaar halen van de DNA-RNA hybride.

12

De translocatie (de 1 nt stap van het DNA template en het RNA product door het polymerase) gebeurd als volgt: De bridge helix voert een oscillerende beweging uit tussen een gebogen en een rechte vorm. Als de bridge helix in de rechte conformatie is, dan is de actieve site niet afgesloten voor de aanvoer van een nucelotiede, en kan er dus een nucleotide worden aangevoerd door porie 1 van het enzym. Het polymerase bouwt het nucleotide in en vult zo de ruimte tussen het 3’ uiteinde van het RNA polymerase en de rechte conformatie van het bridge polymerase. Dit zal ertoe lijden dat de bridge helix overgaat naar de gebogen conformatie, en de DNA-RNA hybride schuift één plaats op. Hierna gaat de bridge helix terug over in de gestrekte conformatie. En begint de cyclus opnieuw.

2 Promotors

We hebben gezien dat de eukaryote RNA polymerasen verschillende structuren hebben en dat ze instaan voor de transcriptie van verschillende klassen van genen. Daarom verwacht men dat zij ook verschillende promotors hebben, en deze verwachting blijkt te kloppen.

2.1 Class II promotors

Klasse II promotors kunnen bestaan uit uit een core gedeelte dat in de buurt van de startplaats van de transcriptie is gelegen, en een upstream element, dat verderweg is gelegen. De core promotor kan bestaan uit tot 6 verschillende elementen, die in onderstaande figuur zijn weergegeven. Op zijn minst is één van deze elementen aanwezig. Pormotoren van gespecualiseerde genen met een hoge expressiegraad hebben een TATA bow aanwezig, maar housekeeping genen blijken deze niet te hebben. De meeste promotors missen minstens een van deze elementen, waardoor ze zeer moeilijk te herkennen zijn.

13

Doordat de promotor sequentie zo onvoorspelbaar is in eukaryoten, is het zeer moeilijk om de startplaats van de transcriptie te bepalen. Om dit mogelijk te maken kan er gebruik worden gemaakt van S1 mapping.S1 mapping is een techniek die gebruikt wordt om het 3’ of het 5’ van RNA moleculen te localiseren en te quentificeren. Het principe achter deze methode is het gebruik van een enkelstrengige probe die enkel hybridiseert met de sequentie van interesse. Na hybridisatie wordt S1 nuclease toegevoegd, dat enkelstrengigge nucleïnezuren afbreekt. De grootte van de fragmenten zal dan de plaats weergeven waar de transcriptie zal starten. De preciese werking van deze techniek wordt in onderstaande figuur weergegeven.

14

Eerst wordt een DNA probe gelabeld aan het 5’ einde met 32P. Het 5’ uiteinde bevat meestal al een niet gelabelde fosfaatgroep, die eerst moet verwijderd worden. Dit wordt bewerkstelligd door het toevoegen van alkalische fosfatase (CIP of SAP). Hierna wordt de radioactief gelabelde fosfaatgroep ingebouwd met behulp van een polynucleotide kinase.In dit voorbeeld wordt een BamHI restrictiefragment gelabeld aan beide uiteinden, wat twee gelabelde ptobes oplevert. Dit zou de analyse verwarrend kunnen maken, dus wordt het label aan de linkerkant verwijderd door gebruik te maken van het restrictie-enzym salI. De twee fragmenten worden van elkaar gescheiden met behulp van gelelektroforese. Na opzuivering van de probe, wordt deze toegevoegd aan een mengsel van transcripten. De probe wordt gedenatureerd, en daarn gehybridiseerd met het transcript. Daar de probe start van de SalI plaats en dit niet de startplaats is van de transcriptie zal er een geddelte van de probe enkelstrengig blijven. Dit enkelstrengig gebeied wordt weggeknipt door S1 nuclease, totdat de hybride volledig dubbelstrengig is. Hierna wordt er terug gedenatureerd en een elektroforetische scheiding uitgevoerd, waarna de grootte van het fragment bepaald kan worden. Hieruit kan bepaald worden hoeveel nucelotiden er weggeknipt zijn (want de fragmentlengte voor hybridisatie is gekend) bepaald worden en zo de startplaats van transcriptie in het genoom gelokaliseerd worden (ligging SalI plaats is gekend door sequencing (men weet dat deze gelegen was voor de startplaats va het gen)).

Proximal promotor elements

De proximale promotor elementen zijn meestal upstream gelegen van de polymerase II core promotors. Ze verschillen van de core promotor in het feit dat ze binden met relatief specifieke transcriptiefactoren (voor een bepaald gen). Zo binden GC bowen de transcriptiefactor Sp1, terwijl CCAAT boxen CTF (CCAAT binding transcription factor) bind. De proximale promotor elementen zijn oriëntatie onafhankelijk, wat niet geld voor de core promotor, maar hun werking is wel afhankelijk van de plaats waar ze gelegen zijn.

2.2 Class II promotors

RNA polymerase I herkent slechts 1 promotor: de rRNA gen promotor. Hoewel er 100en kopiën van dit gen in het genoom voorkomen, blijft het steeds dezelfde promotor sequentie. De sequentie van deze promotor is niet goed geconserveerd tussen verschillende soorten, maar de algemene architectuur ervan wel. Hij is opgebouwd uit twee elementen: een core element, dat gelegen is rond de startplaats van de transcriptie. Deze bevat rINR (initiator), die opgebouwd is uit een AT rijk gebied. Het andere gedeelte is het upstream element, dat ongeveer 100 bp voor de startplaats van de transcriptie is gelegen.De aanwezigheid van twee promotor elementen doet de vraag reizen of de afstand ertussen belangrijk is. In dit geval is dit wel. Tjian et al verwijderde of voegde DNA fragmenten toe. Deze waren van verschillende grootte en gelegen tussen de core promotor en het UPE. Als er slechts 16 bp tussen beide werd verwijderd, zorgde dit al voor een reductie in transcriptie tot 40%, als er 44 bp werden verwijderd was er nog slechts 10% van de originele transcriptiehoeveelheid over.Als zij 28 bp toevoegde leverde dit geen significante verandering op, maar als zij 49 bp toevoegde

15

werd de sterkte van de promotor met 70% verminderd. De efficiëntie van de promotor is dus gevoeliger aan deleties dan aan inserties.

De delen van de promotor werden bepaald met behulp van linker scanning. De grafiek hier boven geeft weerd dat er nog steeds een basale hoeveelheid transcriptie kan doorgaan indien er mutaties worden aangebracht in het UPE. Wordt er echter een mutatie aangebracht in het core gedeelte, dan lijdt dit tot een reductie tot bijna 0%.

2.3 Class III promotors

RNA polymerase III zorgt voor de transcriptie van een set van korte RNA moleculen. De klassieke klasse III promotor is volledig gelegen in het gen. De interne promotor type I bestaat uit 3 regio’s: box A, een intermediair element en box C. De type II promotor bestaat uit twee delen: box A en box B. De promotor kan ook niet klassiek zijn: deze is zeer gelijkend op de promotor van klasse II.

3 Enhancers and silencers

Veel eukaryote genen, vooral die van klasse II, worden vergezeld door cis handelende elementen die niet behoren tot de promotor, maar de transcriptie sterk beïnvloeden. Deze elementen zijn enhancers, die de transcriptie stimuleren, en silencers, die de transcriptie onderdrukken. De elementen zijn plaats en oriëntatie onafhankelijk (ze kunnen ook in een gen gelegen zijn). Vaak zijn ze weefselafhankelijk, daar de proteïnen die erop moeten binden vaak weefsel specifiek zijn. Soms kan een DNA element ook optrden als een enhancer of een silencer, afhankelijk van welk proteïne erop bind.

16

Enhancers

Chambon et al ontdekte de eerste enhancer in de 5’ regio die de vroege genen van SV40 flaankeerden. Deze DNA regio was hun opgevallen doordat het een opvallende duplicatie heeft van een sequentie van 72 bp, die de 72 bp repeat wordt genoemd. Als zij een deleterende mutatie uitvoerde in deze regio, obeserveerde zij een onmiddelijke terugval van de transcriptie in vivo. Dit gedrag suggereerde dat dit 72 bp element een andere upstream element van de promotor bevatte. Berg eta al ontdekte echter dat de 72 bp repeat de transcriptie nog steeds stimuleerde als het werd geïnverteerd of helemaal naar het andere einde van het genoom van SV40 (ongeveer 2kb verwijderd van de promotor) werd verplaast. Dit is geen normaal gedrag voor een promotor element. Dus zulke oriëntatie en positie afhankelijke elementen worden enhancers genoemd. Enhancers stimuleren de transcriptie door de binding van proteïnen, die men transcriptie factoren, enhancer binding proteîns of activators noemt. Deze proteïnen stimuleren de transcriptie door de interactie met andere proteïnen, die general transcriptie factors worden genoemd. Deze interacties stimulerende vorming van een open promotor complex.

Enhancers worden vaak upstream van de promotor gevonden die zij controleren. Dit is geen regel die altijd geld. In 1983 werd door Tonegawa et al een voorbeeld van een enhancer gevonden die binnen een gen gelegen is. De onderzoekers waren bezig met een studie van het gen dat codeert voor de grote subeenheid van een bepaald immunoglobuline van een muis, γ2b . Dit gen werd ingebouwd in een plasmacytoma cel, een celtype dat AL genen tot expressie brengt. Dit specifieke gen werd echter niet tot expressie gebracht. Om de efficiëntie van de expressie te bepalen, werd een gelabeld AZ aan de cellen toegevoegd, om de nieuw aangemaakte proteïnen te kunnen merken. γ2b werd uit het mengsel van proteïnen opgezuiverd door middel van immunoprecipitatie. Hierna werden de geprecipiteerde proteïnen van elkaar gescheiden door middel van elektroforese en gedetecteerd met behulp van autoradiografie. De verwachte enhancer was gelegen in een intron, een regio in een gen dat wordt getranscripteerd, maar hierna uit het RNA wordt geknipt voordat de translatie start. Tonegawa et al begonnen met de deletie van twee delen van deze verwachte enhancer regio. Hierna werd de expressiegraad bepaald. Van een deletie binnen een intron werd verwacht dat dit geen invloed zou hebben op het product, omdat het een niet coderende regio is. De deletie zorgde echter voor een verminderde transcriptie, en dan vooral de grootere deletie (∆2).

17

Is dit effect te wijten aan een verminderde hoeveelheid transcriptie of heeft dit een andere oorzaak. Om deze vraag te beantwoorden werd een Northern blot uitgevoerd met het RNA vancellen die het normale en het gemuteerde γ2b gen bevatten. De resultaten hiervan zijn in bovenstaande figuur c te zien. Deze tonen aan dat de transcriptie graad terugvallen als er een stuk van de enhancer verloren gaat. Om aan te toden dat het echt om een enhancer gaat, moet dit element oriëntatie onafhankelijk zijn. Om dit aan te tonen werd het X2-X3 geïnverteerd (dit element bevat de enhancer). Onderstaande figurr toont aan dat de enhancer na inversie nog steeds zijn functie uitoefent Hierna werd nagegaan of het fragment zijn functie plaats onafhankelijk kon uitvoeren door het fragment X2-X3 te verplaatsen naar een DNA regio buiten het intron. De enhancer behield nog steeds zijn functie. Om de weefsel specificiteit na te gaan werd het gen zowel ingebouwd in fibroblasten als in plasmacytoma cellen. De expressie van het gen was veel hoger i de plasmacytoma cellen, wat in overeenstemming is, dat de enhaner binding proteïnes weefselspecifiek zijn.

18

Silencers

Enhancers zijn niet de enige elementen die de transcriptie vanop een afstand kunnen beïnvloeden. Silencers kunnen dit ook, maar – zoals hun naam al doet vermoeden – inhiberen zij de transcriptie. Het mating systeem (MAT) van gist is een goed voorbeeld van een systeem met een silencer. Het gist chromosom III bevat drie locci met een zeer gelijkaardige sequentie: MAT, HML en HMR. Als MAT tot expressie komt, dan komen de andere twee locci niet tot expressie. Hiervoor zijn silencers, die minsens kb verder weg gelegen zijn verantwoordelijk voor. Hoe werken silencers? De voorhanden zijnde data indiceren dat zij ervoor zorgen dat het chromatine zich opwind tot een dichte, ondoordringbare structuur. Dit zorgt ervoor dat het DNA in een inactieve vorm wordt gebracht, en dat zo de transcriptie van de naburige genen verhinderd word.

Southern en northern blotting

Dit zijn technieken die gebruikt worden om nucleïnezuren (Southern: DNA en northern: RNA) over te brengen van een gel na elektroforetische scheiding. De dat dit wordt gedaan is om de nucleïnezuur fragmenten beter toegankelijk te maken voor detectie (zoals hybridisatie methoden – anders zit DNA fragment in de poriën van de gel. Na blotting is deze aanwezig op de bovenkant van het membraan). Het nucleïnezuur wordt bij southern blotting overgebracht naar een membraan door de gel te leggen op een papeiren wick die aanwezig met zijn uiteinden gedompeld is in buffer. Door capillaire krachten wordt de buffer in het papier getrokken en door de gel geleid. De DNA fragmenten zullen samen met de buffer door de gel migreren en op het membraan terrecht komen. Het specifieke fragment van interesse kan gedetecteerd worden met een gemerkte probe.

19

20