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UNIVERSIDAD NACIONAL TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
ESCUELA DE SEGUNDA ESPECIALIDAD
ESPECIALIDAD EN
LABORATORIO DE ANALISIS CLINICO Y BIOLOGICOS
TRUJILLO
LUIS A. RODRIGUEZ DELFIN, MSc. PhD.
Laboratorio de Biologa Molecular y GenticaFacultad de Ciencias BiolgicasUniversidad Nacional Pedro Ruiz Gallo
TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Y
GENETICA COMO APOYO AL DIAGNSTICO
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L :
P
D ,
D
E
MARCADORES MOLECULARES
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TECNICAS MOLECULARE MARCADORES MOLECULARES
L ,
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MARCADORES MOLECULARES L
.M
.
P , ,
L
.
E
.
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E E B B B A
PFGE E E E B B A
PC E E B B M
AFLP E B E B B A
ML E E D E B A
REA: anlisis del ADN total con enzimas de restriccin de alta frecuencia de cortePFGE: digestin del ADN total con enzimas de baja frecuencia de corte y resolucin de los fragmentos generados por electroforesis de campo pulsante;PCR: polimorfismo de amplificacin
AFLP: polimorfismo del tamao de los fragmentos de amplificacinMLST: tipado por secuenciacin de mltiples loci.
CARACTERSTICAS DE LOS MARCADORES MOLECULARESP F
M D I D C
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IPABILIDADP
. 1.
EPODCIBILDAD
C .E .L .E ,E 0,95.
EVALUACIN DE LOS MARCADORES MOLECULARES: EFICACIA
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EABILIDAD
M E ( ) )
PODE DICIMINAIOP 2 2
E I D , :ID= 11/N (N1) =1 (1)N= ; = ; = J. E ID 0,95. P .
EVALUACIN DE LOS MARCADORES MOLECULARES: EFICACIA
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ANALISIS DE ARN RIBOSOMAL
Linaje
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Patrones obtenidos mediante REP-PCR en cepas de Acinetobacterbaumannii. (palindroma repetitiva extragenica). Lnea M, Marcadoresmoleculares de ADN.
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MARCADORES USADOS EN EL ANALISIS DELA VARIABILIDAD GENOMICA
:
:
APD: ADN PC:
MICOAELIE:
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MICROSATELITE CROMOSOMAdys390
P 6 5 4 3 2 1 P
Tetranucletido
atgctgca(ATCG)nctt..gtaat
n: 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,..
P1 = 2 = 212 (ACGACG)...
L = 208
2 = 3 = 216 (ACGACGACG)...3 = 4 = 220 (ACGACGACGACG)...
4 = 5 = 224 (ACGACGACGACGACG)...
5 = 6 = 228 (ACGACGACGACGACGACG)...
6 = 7 = 232 (ACGACGACGACGACGACGACG)...
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MARCADORES MOLECULARES VNTRs
3x
8x
8x
7x
4x
6x
3x
6x
3x
4x
2x
6x
2x
4x
3x
4x
5x
7x
4x
I A/3,8/3,6/2,4/
I B/7,8/3,4/3,4/
I C/4,6/2,6/5,7/
N I3=1; 4=1; 6=1;
7=1; 8=2
N II2=1; 3=2; 4=1;
6=2
N III2=1; 3=1; 4=2;
5=1; 7=1
1x
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ORIGEN POSIBLE DE
LOS POLMORFISMOS
DE LOS VNTRs
(ACGACGACG)...
(ACGACGACGACGACG)...
(ACGACGACGACGACGACGACG)...
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ANALISIS GENOMATECNICAS HIBRIDACION
OHEN ADN, E. , D, N
NOHEN NA N
ADN AN, N
AN , N
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HIBRIDACION
1. ENZIMAS DE RESTRICCIN
2. SONDAS N
Cadenas de simple y de distinto origen de ADN, de ARN o una de ADN y
otra de ARN se unen, formando un hbrido.
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SOUTHERN BLOTTING
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P . L 19
.L (
,
).
ANALISIS DE GENOMA
Enzimas RestriccinSondas
Patrones Restriccin
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ENZIMAS DE RESTRICCION
Alu I AGCT
TCGA
Hinf GANTC
CTNAG
Eco RI GAATTC
CTTAAG
TIPOSEXONUCLEASA : Hidrlisis las bases de los extremos 5o 3
ENDONUCLEASA: Hidrolizan enlaces fosfodister en el ADN, reconocen secuenciapalindrmica, simetra central
EXTREMOS PLANOS
5.TGAGCTCT. 5.TGAG CTCT.
3.AGTCGACA. 3.AGTC GACA.
EXTREMOS COHESIVOS
5.AAGACTCGG.. 5.AAG ACTCGG.
3.TTCTGAGCC.. 3.TTCTGA GCC.
DEFINICIONENZIMAS QUE CORTAN SECUENCIAS CORTAS Y ESPECIFICAS DEL ADN
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SONDA o PROBESecuencia conocida de ADN (ARN) marcada con istopos
radiactivos (32P, 35S, 3H) o no radiactivo (biotina o digoxigenina)
Marcaje Radiactiva de la sonda en el extremo 5
5 aaggtaatgtctgaGCTCTTGACGGTGGAATCTGACTGATctaacgtaactttcaaaagttggctcat..3
350
3.CGAGAACTGCCACCTTAGACTGACTA.5
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SONDA o PROBE
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E
B
ADNM
BIOINA DIGOIGENINA ONDA
ENIMA
ANICEPO
FOFAAAPEOIDAA
AO INCOLOO
PODCO COLOEADO
H
E
B
E
B
E
B
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ELIMINACION DE CADENAS SIMPLES DE LA HIBRIDACION
ESTABILIDAD DEL HIBRIDO
Tamao de la unin de la sonda y el ADN Temperatura. Altas T slo mantienen hbridos muy estables
Concentracin de formamida. Inestabilidad
Fuerza inica. Concentracin de sales
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Comparacin de Tcnicasde Hibridacin
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Patrones de restriccin-hibridacin asociados a IS6110: Lnea 1,
cepa control MT1423. Obsrvese como las cepas de las lneas5, 6, 7 y 8 comparten el mismo patrn constituyendo un cluster.Ello tambin ocurre con las cepas en las lineas 10 y 11.
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POLIMORFISMO EN LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIONRFLPs
5 aaggtaatgtctgag3 ttccattacagactc
ctcttgacggtggaatctgactgatctaacgtaactttcaaaagttggctcat..3gagaactgccaccttagactgactagattgcattgaaagttttcaaccgagta..5
50 bases 300 bases
5 aaggtaatgtctgagctcttgacggtggaatctgactgatctaacgtaactttcaaaagtgaattctggctcat...33 ttccattacagactcgagaactgccaccttagactgactagattgcattgaaagttttcacttaagaccgagta5
Alu I AGCTTCGA . 15
. 340Eco RI GAATTCCTTAAG
aattctggctcat...3gaccgagta5
5 aaggtaatgtctgag3 ttccattacagactc
ctcttgacggtggaatctgactgatctaacgtaactttcaaaagtggagaactgccaccttagactgactagattgcattgaaagttttcacttaa
50 bases
290 bases
20 bases
Alu I AGCT
TCGA
. 15
5 aaggtaatgtctgagctcttgacggtggaatctgactgatctaacgtaactttcaaaagttggctcat..33 ttccattacagactcgagaactgccaccttagactgactagattgcattgaaagttttcaaccgagta..5
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1: DP; 2-3: SD; 4: DP
1 2 3 4
AISLADOS DE LeishmaniaRFLP SalI
L. brasiliensisL. peruaviana
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M:X174/HaeIII
PCR M 1 2 3 4 LC-26
RFLP Eco RIL. peruviana
1-2: DP, 3: DT, 4: SD
1,300pb
800pb
500pb
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Folia DermatolgicaPeruana 14 (2), 2003
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PCR -RFLPs
6d 8f PCR 11g
266
86
38
390
pSRYM
1 kb
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209 pb
144 pb
65 pb102 pb 42 pb P1
P265 pb
Padrn
123 1 kbPCR P1 P2
209 pb
102 pb
65 pb
42 pb
144 pb
65 pb
PCR -RFLPs
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Mapeo de Sitios de Restriccin
A I H III
5 3
5 3 5 3
5 3 5 3
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Mapeo de
Sitios
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ANALISIS DE FRAGMENTOS DEADN AMPLIFICADO AL AZAR
RAPD
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RAPD: SEGREGACION
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GEL: APD
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Vamos a otro Descansito???
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ORGANIZACIN GENOMICA ESTRUCTURAL :ORGANIZACIN GENOMICA ESTRUCTURAL :ORGANIZACIN GENOMICA ESTRUCTURAL :ORGANIZACIN GENOMICA ESTRUCTURAL : GENGENGENGEN
CROMOSOMA
DNAIntron 1
Exon 1
Intron 2
Exon 2 Exon 35- UTR UTR- 3
ARN primario
ARNm maduro
PROTEINA 1 PROTEINA 2
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ORGANIZACIN GENICA EN TANDEMORGANIZACIN GENICA EN TANDEMORGANIZACIN GENICA EN TANDEMORGANIZACIN GENICA EN TANDEM
SOLO EXONESSOLO EXONESSOLO EXONESSOLO EXONES ---- INTRONES?INTRONES?INTRONES?INTRONES?
ITS
1
ITS
2
ETS ETS ETS ETS
ITS
1
ITS
2
ITS
1
ITS
2
ITS
1
ITS
2
SECUENCIA ESPACIADORA INTRAGENICA (ITS)
SECUENCIA ESPACIADORA INTERGNICA (ETS)
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FIH
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FIH
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. El mtodo de Sanger se basa en la elongacin 5' a 3' de las molculas de DNA por la DNA polimerasa.Ambas estrategias generan un conjunto de molculas de DNA de cadena sencilla de diferentes longitudes.Un mtodo de secuenciacin de DNA diseado por Alan Maxam y Walter Gilbert utiliza productos qumicospara cortar el DNA. Este mtodo se utiliz para determinar la secuencia de bases de los 4.362 nucletidos delplsmido pBR322. El segundo mtodo, que es el que generalmente se utiliza, lo desarrollaron FrederickSanger y sus colaboradores
SECUENCIAMIENTO DE ADN
l
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Mtodo Qumico de Maxam y Gilbert
ATGTCTACTGTTACCTCAAGTTCTAACTATCTGACTC*
AT TCTACTgTTACCTCAgTTCTAACTATCTgACTC*
ATgTCTACTgTTCCACTCAgTTCTAACTATCTgACTC*
ATgTCTACT TTACCTCAgTTCTAACTATCTgACTC*
ATgTCTACTgTTACCTCA TTCTAACTATCTgACTC*
ATgTCTACTgTTACCTCAgTTCTAACTATCT ACTC*
D A. F H H+G A +C C
CGAATC
ATGTCTACTGTTACCTCAAGTTCTAACTATCTAACTC 37
Mt d d S
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3ACGACGAGCAAGAACAGGGCA5532PAGC3
3ACGACGAGCAAGAACAGGGCA5532PAGC 3
3ACGACGAGCAAGAACAGGGCA5532PAGCGACCA 3
A G T C
DNA
D
E
C G A
ACA
GCG
3
3 5
G
G
A
A
A G
T
T
T
C
C
C
PC: ADN + NP
OH
H
H
H HH
CH2
3P
BASE
NP
Mtodo de Sanger o
Enzimtico
H
H
H
H HH
CH2
3P
BASE
NP
ANALISIS DE SECUENCIA DE ADN
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ANALISIS DE SECUENCIA DE ADN
ATCTCGGCGTGTTTACTCAAGTGTCTTAACTAGGCTGAACT
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Secuenciamiento Shotgun
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CLONACION
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Vectores y tamao de insertos(pb)
Plsmido 20Fago 25Csmido 45Fago 100
BAC 300YAC 1000
CLONACION
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CLONACIONEXPRESION
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ELABORACION DEBIBLIOTECAGENOMICA
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ELABORACIONDE BIBLIOTECADE cDNA
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STS: sitios marcados por su
secuencia
EST: marcadores de secuencia
expresada
CONTIGS: serie de clones solapados