NOMVRE

MATRICULA.

90339567

/Elizabeth Montes de Oca Ortiz

J LICENCIATURA.

J Bioiogia

(Unidad Iztapalapa, División de CUS) TELEFONO. 6 34 06 28

TRIMESTRE ELECTIVO. 96-P

TIEMPO DE DEDICACION 20 horas por semana

/TITULO DEL TRABAJO. Efecto del coumestrol sobre la orgrnkación histológica del 01 ano fetal

,/ NOMBRE DE LOS ASESORES M en C Mano Garcia Lorenzana (Profesor titular B, Depto t ‘ienrias De la Salud)

M en C Maria Del Rosario Tarragó Castellanos (Profesor Titiilar A. Depto. Biología

de la Reproducción)

LUGAR DE REALIZACION

Departamento De Biología De La iteproducción Area Psiconeuroendocnnologia Lab.Fisiología y Endrocnnología De La Adaptación y la Repri)ducción

FECHA DE INICIO. 1 de octubre 1996

FECHA DE TERMINO. / 9 de marzo lw

CLAVE DE REGISTRO DE SERVICIO SOCIAL.

B 024 96

e Oca Ortiz Mano Garcia Lorenzma M a del Rosario

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD SECRETARIA ACADÉMICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que la: M. en C. MARIA DEL ROSARIO TARRAGÓ CASTELLANOS

del Departamento de de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Socia I :

TITULO "EFECTO DEL COUMESTROL SOBRE LA ORGANIZACIÓN HICTOLÓGICA DEL OVARIO FETAL"

ALUMNO MONTES DE OCA ORTIZ ELIZABETH MATR~CULA 90339567 LICENCIATURA BIOLOG/A PERIODO

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓN

OCTUBRE lo. 1996 a MARZO 9. 1999

Se extiende la presente para los fines que a la interesada convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a seis de octubre de mil novecientos noventa y nueve.

A T E N T A M E N T E "CASA ABIERTA AL TIEMPO"

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán y la Puririma. Col. Vicenlina. D.F. 09340 Tel. (5) 723 63 51, Fax (5)612 80 83 e-mail: cdcbsaxenum uam.mx.

UW ahieh ai kmpo

UNIVERSIDAD AUTONOMA

p-,......~ -_ . . , , . . , _I-_u _-.... ",*,. -..A.

METROPOLITANA

México, D.F., a 9 de matzo de 1999,

DR. JOSC LUIS ARREDONDO FIGUE9OA. DIRECTOR DE LA DIVISIÓN DE C.B.S.

PRESENTE. UAM-I

Estimado Dr. Arredondo:

Aprovechamos la presente para saludarlo y al mismo tiempo justificar que el informe 'final del servicio social (denominado "Efecto del i.:our: (estro1 sobre la organización histológica del ovario fetal" con clave B.024.96), realizado por la C. Elizabeth Montes de Oca Ortiz con matrlcula 90339567, estudiante de la licenciatura de Biologia, es entregado con fecha posterior a la establecida inicialmente. Ya que si bien el trabajo de laboratorio se concluyó en año y medio (datlas la dificultades en el montaje de las técnicas), la elaboración del reporte se vi6 retrasada por la inclusión de la discusión de los resultados en diferentes reuniories científicas (de las cuales se anexan comprobantes).

Finalmente, a traves de la presente, damos por aceptado el reporte final del servicio social mencionado, entregado por la alumna Elizabeth Montes de Oca Ortiz.

Sin más por el momento y agradeciendo de antemano la llneza de su atención a la presente, quedamos de Usted

A T E N T A M E N TE .

/urn M. en C. Ma. del Itosario Tarraab C. -

Profesor Titular B Depto. Ciencias de la Salud

Profesor Titular A Depto. Biologia do la Reproducción

UNIDAD IZTAPALAPA Av. Michoacán Y la Purísima, Col. Vicentina. 09340 México, D.F.. Tel.: 724-41iO0, Telefax: (5) 612-0885

FORhlA’l‘O PARA SER LLENADO FOR EL. (LOS) ASESOR(ES) INI ERN0 O EX1 ERN0 I ’ A W El, INFOIIhlE FINAL DE SER\‘ICIO SOCIAL.

I . Nuiiibre y ndscripción del asesor.

Mario García Lorenzana Profesor Titular B Departamento de Ciencias de la Salud

. 3. Niiiiiiiir tic1 riUJC<lu &I ~ I I C & i i \ a CI St. i~it iu S0ii;iI c i i i h t i i i i t i G t a U ~ i i ; : i i i i ~ i ~ i i t I I I I C tu

n \n la .

alfalfas con alto contenido de coumestrol. Ili.rgIiis:ir Ins :rcíiriil:iclcs qiie dcs:irrullCi cl :rwsur ~ i ; r I : r f:i\ oi rica rl r iiiiipliiiiic ilia ilc Ius

ut!jcii\os p1:iiii~:icins CII rl t’rujrrio 1iiiti:il de Scrviciu So&l.

Análisis de las alteraciones reproducti,las producidas por

J.

Capacitación en las técnicas histolóqicas, iiiterpretación y aná- lisis histolóqico, análisis histológico y de resultados. Discusión y manejo de la información.

5. L(:l;tiici c \ nliia e1 tlrsc.iii~~cñu c i d :!Iuii i i in p i c.st;tJor tlr Scr\iciu Simc¡:il’.’ ~C~i i i~i iIc i :I iliir In

i t i i i i i : ici i>ii <Itle et :iliiiiiiiu i rtiiic C I I In i lhAl l ES :itJccIi:id:i ) s i ~ ~ c i c t ~ i ~ ID:II:I ><I I I C > V I I I I ~ C ~ ~ U 111 cifcsic~ii:il? ,‘,l’(lr w e ? Considero que los cursos teíiricus aportan las bases necesarias, fortaleciéndose los conocimicatos con los se- minarios de investigación que ticos importantes. ; t l i ~ ~ i c I:is lul-inlrzns y ilr1iili~i:iel~s i I ~ l ~ r 1 : ~ i J : t s ptir i ir i i4 roil i.csiwcln n In foi i i i r i t i i i i i del t ~ c i 3 a d i ~ 8 t B 1 r La alumna demostró tener habilidad y destreza para el desarrollo de técnicas manuales así como parii aplicar los con- ceptos teóricos en los aspectos prácticos. Lit Única dificultad detectada fue en relación a la búsqueda y mailejo de biblioqra- F & i ~ i r e y firiiia c ~ r ~ :iresor.

aportan además conocimyentos prác

6 .

7.

Mario García Lorenzana

11

FORhIATO PARA SER LLENADO POR EL (LOS) ASESOR(ES) IN1 ERN0 O EXTERNO P A M EL INFORME FINAL DE SERVICIO SOCIAL.

1. h'onibrey adscripción del asesor.

Ma. del Rosario TarragÓ CAsteiianos Profesor titular A Departamento de Biología de la Reproducción

2. L a iiaturaleza del Proyecto del que procede el Servicio Social es:

a) rruyeclo de Servicio Socinl asociado a la itivtstig;lciGit qti,. se t c a l i ~ a FII l i i s ;¡itas dclxwtniiiciitaier.

w Interno.

0 Externo.

(1 Pur ruiircnio.

b) Pi oyccto de Sctvicio Social asociado a nclivida~lcs disciplinarias rcalizndas por el 1' :isrsor.

3. Noiitbit del Piuycctu del que t l w i v a el SCI viciu Soci;il c itiaiiiuti&a U utg:ni&itti ~ ( I I C lo Análisis de las alceraciones reproducti,ias producidas

por alfalfas con alto contenido de coumestrol.

J. ücs:ios:ir Ins :iclivid~liies que dcsarroiib ct :Iscsur 1i:iIa f:i\orccrr rl (iiiiipIiittitiilo (le ius ubjetivus ~)l;i~iie:idos CII e1 i'ru)rrto Iiiicinl de Serviciu Social. Apoyo en la preparación de soluciones, y en la técnica histolÓ2 gica. Análisis de resultado , discusión y manejo de la informa ción. ~C6aiio ct aliin <.I ilcsciiipefio & I :!liiiiiiio picct;tdor tlc Sctvicio St,, ¡:it'! ~ C ~ ~ i i ~ i ~ l c r : t 11i1c la 5 . loi-iii:icioii <I"' el a1iii i i i io ircitie 1'11 l a UA3tl cs :ldccll;l~ia ) 5 l t G L i l r i le 11.1,:' .',I JC2i.iil,'Fí'"

pwksioii: i l? LPor que? Los cursos teóricos aportan las bases necesa-= rias fortaleciendose posteriormente con los c,onocimientos tanto teóricos como prácticos que se imparten en IC's seminarios de investigación. Aiioic Ins furtalcrar y iIcl~i¡id:itlcs <letcrí:~dar por iicícii coil rcsp~.cio a In foi iii:icii)ii dcl Pt l lllli:,llle.

manejo para el desrrollo de técnicas manuale:; así car conce toslteÓricos en los prácticos. La iinica dificultad -

h'uiiibi-e y firiiia de1 asesor.

6.

La alumna demostró tener habilidad y destreza para el como ?ara apli

fue en re E acion a husqueda y manejo de bibliografía, 7.

María del Rosario TarragÓ CAstellanoa

/L/&l* u

Eizabeth Montes de Oca Ortiz. Lic.Biología.

EFECTO DEL COUMESTROL SOBRE W ORCANIZAC I6N HISTOLOGICA DEL OVAMG FETAL.

Matricula: 90339567

Clave de registro: B.024.96 M en C. Mario García Lorenzana Depto. Ciencias de la Salud.

Fecha: 9 de marzo de 1999. M en C. Ma del Rosario Tarrash C Depto. Biología de la Reproducción

Algunos compuestos vegetales tienen efectos estrogéniws, entre estos se encuentra el coumestrol (Cou) pueden actuar tanto como agonistas como antagonistas del Estradiol (E2). El Cou tiene una potencia de 30 a 100 veces mayor que otras isoflavonas. Su potencia biológica con respecto al E2 para aumentar el peso uterino es 160 voces mayor y SLI afinidad de'unión relativa al receptor uterino es 70 veces menor. El consiirno de cste compuesto tanto en hembras wrno en niwlios produce alieracioiies ieproductivas. Siii en~bugo, los efwlos il nivel teratógenico no han sido estudiados. El presente trabajo analira efecto del Cou en la diferenciación ovárica en fetos de rata. Se utilizaron 25 rat& preñadas de la cepa Wistar, divididas en 5 grupos, al día diez de gestación se les administró una dosis Única de lor sigtientes tratamientos: X p c contrd (X) !O0 pl Oe oceik. Cciu 1 14.2 pdlW pi de aceite, Cou 2 28.4pg/100 pl de aceite, E2 1 2&00 pl de aceite, E2 2 4pgíiOO pl de aceite. En el dia i 8 de gestación se sacrificaron los animales, se extrajeron las gónridas de cada embrion, se fijaron en Bouin. se deshidrataron e incluyeron en parafina para obtener cortes de 8 pm los ciiales fueron teñidos por las técnicas H-E y Azul de alc.iano psi a sil posterior interpretación. En la descripción histoiógica del GC se distinguen ccrdones de i,elulas germinales delimitadas por cklulas de aspecto aplaudo cercairas a vaso$ saiiguíiioos, riAir;ulos wr;liws dispuestos e11 ¡a periferia de la gónada; en Cou I se observan escasas asociaciones celulares que corresponden a folículos, los cordones de las celulas germinales están menos definidos que GC; Cou 2 no se llegan apreciar folículos, los cordones de células germinales se encuentran definidas por delgadas fibrillas. E2 1 se distingen cliramente cordones de células germinales, los folículos son abundantes en toda la ghada, deim de las cuales se aprecian ovogonias con ntícieo heterocromáuco, ovociios primarios en paquireno cun epiieiio aplwado simple definido. E2 2 se definen más los cordones de celulas germinales cn comparacion con el grupo anterior apreciándose así mismo los folículos con mayor claridad. El tratamiento con E2 produce un avance en el desamllo y dtfinicián de Ins fnliciiln!~. sin embargo VI tratamiento con Cou produce un r e m o en el desarrollo del ovario ai obsmwse escasos foliculos, así iiusiiio 10s cordones de las c61ulas gci-iiuiialcs se eiicücriiiaii iiwiiüs defiilldos que e11 el GC y con la dosis alta de Cou se observan de aspecto fibrilar. Es muy probable que el tratamiento agudo de Cou en las dosis utilizadas tenga un efecto antiestrogériico, dosis dependiente, sobre la maduración gonadal del ovwio fetal.

INTRODUCCION

DlFERENClAClON SEXUAL EN HEMBllAS

El desarrollo de la gónadas se lleva a cabo a nivel embriológico, la gónada

indiferenciada tiene 2 opciones normales para desarrollarse dependiendo de la

información genética, a un ovario o a un testículo. En mamiferos los primeros

esbosos de la gónada terminan en un estado indiferenciado durante el Cual no

tienen ni características femeninas, ni masculinas, es ha!ita la séptima y Octava

semana que ocurre la diferenciación sexual. En hembras especificamente (XX)

durante la organogenesis, el mesodermo da lugar a una gCinada indiferenciada, las

células mesenquimáticas del ovario se diferencian en las células de la teca y células

de la granulosa del folículo, estas envuelven a la célula germinal, formando los

foliculos como resultado de la asociación de estos tipos celiilares. La diferenciación

del ovario es un proceso largo que se efectúa en una serie de fases sucasivas, en

las primeras etapas de la diferenciación se manifiesta tina actividad endocrina

transitoria (Jost, 1991), cada folículo contendrá un núniero básico de células

germinales y los conductos de Muller permanecen intactos diferenciándose hacia,

Útero, oviductos y cervix (Gilbert, 1991).

Las gónadas tienen una función doble; la producción de células germinales y

una función endocrina al secretar hormonas sexuales, en el caso específico de las

hembras, los estrogénos son las principales hormonas sintetizadas (Ganorig, 1996).

Los estrogénos actúan sobre el tracto reproductor, la hipófisis y el área

preóptica hipotalámica, participando en el desarrollo final y maduración para

alcanzar la capacidad reproductiva (Ojeda, 1986), en el tracto reproductivo los

estrogénos estimulan la maduración folicular, el crecimiento uterino y la canalización

vaginal (Richards, 1979).

SUSTANCIAS ESTROGENICAS ( FITOESTROGENOS)

Las sustancias estrogénicas no sólo son producidas por los órganos

reproductores de los animales, sino también se encuentriin en la naturaleza, en

algunas plantas (Jurado, 1989).

Estas sustancias de origen vegetal que tienen aclividad estrogénica se

denominan fitoestrogénos, ya que tienen la capacidad do unirse al receptor de

estradiol e inducir efectos estrogénicos, tanto a nivel ovarico y útero (Shemesh et al.,

1972). Estas sustancias son químicamente similares a los esteroides gonadales

(Fowler, 1983).

Las sustancias estrogénicas de origen animal son todas esteroides e

intervienen en el ciclo estral femenino. Se han realizado estudios para relacionar la

estructura química con la actividad de los fitoestrogénos. De manera general

podemos dividir a estos compuestos en tres grupos en base a su estructura química:

los esteroides, los isoflavonoides y las coumarinas. Dentro de los esteroides se

encuentran la estrona y el estriol, entre las isoflavonoides se encuentran la

genesteina, daidzeína etc, y dentro de las coumarinas principalmente se ha aislado

el coumestrol. El efecto que produce la ingesta de plantasi con alto contenido de

fitoestrogénos es similar al que se obtiene cuando se administran estrogénos de

origen animal o sintéticos (Jurado, 1989).

Doran en 1926, demostró que existían sustancias estri lgénicas en las plantas,

las cuales se encuentran en una amplia variedad, dentro de gama de estas se

encuentran los géneros; Trifolium ( tréboles ), Glycine ( soja ), Meúicago ( alfalfa ),

Beta (remolacha), Prunus ( almendras ) etc.

Con base a su actividad los fitoestrogénos pueden clatiificarse en tres grupos,

los que tienen actividad estrogénica, los antiestrogénicos y los que su actividad

depende de la dosis. Dentro del primer grupo se incluyen al coumestrol, CC-

Zearalenol y a la genisteina, los cuales tienen actividad estrogénica, similer a la del

estardiol cuando se administra en altss concentraciones.

El segundo grupo tiene actividad estrogénica mínima 13 nula comparados son

el estradiol, esta clase incluye al phloretin, kaempferide y a 1;i narigenin.

El tercer grupo esta representado por la biochanina A, chrysin y las flavonas,

estas presentan actividad antiestrogénica pero sólo dependitindo de la dosis, pero si

tienen actividad estrogénica (Bridgette et al., 1977).

El coumestrol se encuentra en pequeñas cantidades i?n plantas sanas (1 a 2

mgikg) como en el trébol y en leguminosas (alfalfa) sin ninguna influencia aparente

sobre'los animales que las consumen, pero puede verse elt?vada su concentración

en presencia de ataques foliares de hongos y áfidos (Livingston et al., 1961),

pudiendo superar en este caso los 100 mgikg, lo que resultii bastante superior a la

concentración mínima de 20- 50 mg Ikg considerada como biológicamente ectiva

(Wong et al., 1971) Este aumento parece asociado a mecani3mos de defensa de los

vegetales expuestos a patógenos foliares (Bickof, 1968), los niveles de

coumestranos en alfalfa pueden mantenerse bajos si se tiene un control de agentes

patógenos cuando este control se altera los niveles de couinestrol se elevan como

mecanismo de defensa (Hanson et al., 1965).

Los problemas causados por los estrogenos de origeii vegetal se deben a la

elevada concentración que alcanzan en el plasma sanguíni:o de los animales que

ingieren las plantas, a elevadas concentraciones pueden cljercer en el animal un

efecto importante y producir un desequilibrio hormonal (Mat1 iieson and Kitts, 1980).

Las concentraciones altas de fitoestrogénos pueden Ilegiir a competir con los

estrógenos endógenos y así unirse a los receptores proteico s en la hipofisis y en el

hipotálamo influyendo sobre la producción de gonadotropina!i y suprimiéndose así la

función del ovario (Rodger et al., 1980). Sin embargo, en I;i producción animal se

tienen reportes de los efectos de los fitoestrógenos sobrc~ la reproducción. Los

.I -. prikeros trabajos que se realizaron en relación a los efectos adversos de los

fitoestrbgenos, fueron hechos en ovejas australianas alimentadas principalmente con

trébol subterráneo el cual contiene altas concentraciones de isoflavanas (Cox,

1977); estos animales presentaron fallas en la concepción acompañada de una

hiperplasia glandular cística del tracto reproductor (Adams, 1990). El desarrollo de

las mamas en ovejas no preñadas sugirió la presencia de etrtrógeno vegetal el Cual

también provoca la esterilidad de las ovejas reproductoras (Cox and Braden, 1974).

A partir de este momento se dispuso de una evidencia que 3isocieba el consumo de

ciertos forrajes con alteraciones reproductivas del ganada, y de manera general

encontraron que el consumo de fitoestragénos induce alter; iciones morfológicas en

el aparato reproductor del ganado. En el caso de las hembras se observó que

afectan al ovario, al oviducto, el Útero, el cervix, la vagina, la glándula tiroides, las

adrenales y las glándulas Inamarias (Gardiner and Nair, 196! I).

En general los efectos observados en ovejas que consumen fitoestrógenos

'* son metritis, hiperplasia mamaria, calores no fértiles, distocías y mortalidad pos natal

de corderos así como formación de quistes ováricos; eri bovinos se observan

cuad:us de ninfomanía, hiperemia de vulva, quistes ováricos, hiperplasia mamaria e

hiperplasia en útero; en porcinos se presenta hiperernia dt3 vulva, flujo vaginal e

infertildad por el consumo de forrajes con alta concentración de fitoestrogénos

(Jurado, 1989), también se han observado fracasos parciale!; de fecundación en las

ovejas (Engle et al., 1957). Los efectos antes mencionados piieden ser causados por

diversos tipos de fitoestrógenos, específicamente en el ganiido bovino, el principal

fitoestrógeno es el coumestrol el cual tiene una gran actividad estrogénica en el

ganado que lo consume. Su potencia es de 5 a 20 veces mayor que las isoflavanas

para inducir una respuesta estrógenica (Wong et al., 1971 ).

En ovejas que consumen un promedio de 27.1 mg do coumestrol la tasa de

ovulación presento una disminución significativa de un 20 Om. sin embargo, la

fertilidad y la mortalidad embrionaria en ovejas alimentadas con alfalfa, no se ve

alterada significativamente. LOS resultados observados sugieren que ovejas

alimentadas con alfalfa por tiempo prolongado presentan efttctos adversos sobre la

tasa de ovulación en la Cual podría afectar negativamente a la producción del

rebaño (Valderrabano and Folch, 1993).

Existen reportes que indican que se requiere una concentración de 100 a

1000 veces más alta de coumestrol y genisteina que el estrí3diol para provocar una

respuesta equivalente a este (Bridgette et al., 1997).

Las concentraciones de coumestrol y genisteina requeridas para la activación

del gen sensitivo a estrógeno y para alcanzar una actividad : iimilar a la del estradiol

es de 1500 y 9000 veces más que el estradiol (Milksicel$., 1994) así mismo se

propone que los fitoestrogenoc tienen una afinidad similar a la del estradiol para

unirse a proteínas (Garreau et al., 1991). Por otro lado el coumestrol compite por los

receptores a estrogenos cuando estos últimos son de baje afinidad como el 17p

estradiol y el diethylstibestrol (Martin et al., 1978).

El posible efecto del consumo de dietas con estroip5nos en roedores de

laboratorio durante el desarrollo del periodo crítico reproductivo es un tema de

considerable interés (Bickoff et al., 1957). Se a observado ile manera general que

algunos de los efectos del coumestrol son: estimular el alargíimiemto uterino (Bickoff

et al., 1962) decrecimiento de el porcentaje ovulatorio (Leavitt, 1965) y aumento de

malformaciones embrionarias en ratas preiladas (Fredericks tit al., 1981).

Newsome y Kitts (1980) al administrar a ovejas estradicil en diferentes dosis y

a un grupo de animales coumestrol observaron que independientemente de las dosis

o tratamiento en todos los animales hubo una disminución de peso de los ovarios, y

de las células ováricas, tendiendo a disminuir el desarrollo folicular. En relación al

peso uterino se increment6 en los animales tratados con cuornestrol (132 mgí día x

doce días) de manera similar a los animales tratados con estradiol en una dosis

equimolar a la del coumestrol.

Se ha observado en ratas inmaduras expuestas a coumestrol en la dieta,

alteraciones en la función reproductiva manifestada por ciclos vaginales irregulares

Ojeda et al., 1986).

EFECTO DE LOS ESTROGENOS EN LA DlFERENClAClON SEXUAL.

Los estrogenos tienen influencia en la regulación de la función ovárica

(Young,' 1961). Bradbury en 1961 demostró que hay unit acción directa de los

estrogenos en la actividad del ovario ya que tienen un papel importante en la

maduración folicular (Goldenberrg et al., 1972; Hartman et al, 1975; Richard, 1980).

La administración de hormonas sexuales a roedores durante el periodo crítico

de diferenciación sexual lleva a cambios persistentes en' el sistema hipotálamo-

hipófisis-gonada y en órganos reproductores induciendo además desarrollo de

ciertos tipos de cáncer (Takasugi, 1976). En la etapa temprana del desarrollo en

roedores expuestos a altas dosis de estrogénos se ha obriervado la inducción de

hiperplasias, displacias y neoplasias, en el adulto en la glandula mamaria se

presenta un incremento en la sensibilidad a las horrnona,i sexuales para inducir

carcinogénesis (Bern et al., 1985).

.

Cuando se administra dietiletilbestrol en etapas neúnatales a ratones, se

observan como consecuencia del tratamiento lesiones en vagina así como

metaplasia en el útero, en el folículo se observa ausencitt de la capa lutea, en

glándula mamaria se induce hiperplasia en nódulos alveolai'es así como secreción

(Bern et ai., 1987). Este tip:, de tratamientos también inducen proliferación y

cornificación vaginal persistentes (Jones et al., 1984).

La administración exógena de dietilestilbestrol en los días 9 -10 de gestación

induce anormalidades en los órganos genitales, incluyendo adenosis vaginal,

adenocarcinomas, cáncer en el útero, malformación del oviducto y una tendencia a

presentarse ovarios poliquisticos. En hembras de ratón la adininistración exógena de

estardiol o de dietilestilbestrol durante periodos prolongados do tiempo dan como

resultado la aceleración de la diferenciación del tracto genital así como hiperplasia

glandular en endometrio (Davies and Letkowitz, 1987).

Baggs y colaboradores (1991) demostraron que la exposición a altas dosis de

dietilestibestrol en ratas gestantes durante la gestación induce en el Útero la

formación de tiJfflOr0S vaginales y adenocarcinomas.

OBJETIVO

Anallzar el efecto del coumestrol sobre la diferenciación ován'ca en ratas

Wistar.

Se utilizaron 25 ratas de la cepa Wistar divididas en 5 grupos, con igual

número de ratas cada uno.

Grupo control

Grupo experimental 1

Grupo experimental 2

1 OOp1 de aceite (GC)

14.2~9 de coumestrol /lo0 pI de iiceite (Cou 1)

28.4pg de coumestrol1100 pl de iiceite (Cou 2)

Grupo experimental 3 2.0pg de estradiol 1100 pl de aceite (E2 1) - Grupo experimental 4 4.0pg de estradiol 1100 pI de aceiie (E2 2)

A todas las ratas se les hizo un seguimiento del cicici estral por frotis vaginal,

se llevaron a cruza en etapa de proestro, al día siguiente se corroboró que se

encontraron preñadas por medio de la presencia de espeimatozoides en el frotis,

considerando este como día cero de gestación.

AI día diez de gestación se les administró por vía subcutánea cada uno de los

tratamientos arriba indicados. las ratas se sacrificaron en €11 día 18 de gestación, y

por medio de una laparatomia abdominal se obtuvieron lo:i embriones, se tomó el

peso de cada embrión con placenta y posteriormente sin placenta.

En el caso de las hembras se obtuvieron los ovariiis de los embriones se

fijaron en Bouin durante 24 hrs, posteriorment6 se lavaron o m alcohol del 70%, y se

procesaron para la inclusión definitiva en paiafina, realizándose cortes de 8 p ,

posteriormente se tiñeron por la la tbcnica de Hernatoxilina y Eoslna así como con la

técnica de azul de alciano. Se realizó el análisis histológico cualitativo. Con relación

al peso de los embriones se realizó un análisis de variariza y posteriormente se

aplicó la prueba de Tuckey para determinar diferencias significativas entre los

grupos.

ACTIVIDADES REALIZADAS

L

ETAPAS:

I .- BÚSQUEDA DE BIBLIOGRAFh

2.- OBTENCIÓN DEL MATERIAL

3.- PROCESAMIENTO

4.- ANALISIS DE RESULTADOS

5.- ELABORACIÓN DEL REPORTE

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS.

Presentaciones en eventos especializados:

XXI Congreso Nacional de Histología en la fecha 16 de octubre de 1997. El cual llevó como titulo El efecto que tiene el coumestrol sobre la organización

histolegica del ovario fetal. Anexo I

XVll Congreso Nacional de Anatomia con fecha del 2: I al 26 de noviembre de

1998. El cual llevó como titulo Efecto comparado del coumestrol y estradiol

sobre la organización histologica de la góneda femenina fetal. Anexo 1

V simposio del Departamento de Ciencias dB la SalucI con fecha 27 al 29 de

enero de 1999. El cual llevo corno titulo Efecto del coumestrol y estradiol sobre la

histologla de la gónada fetal. Anexo 1

.-

RESULTADOS.

~

- 7

7 PESO DE LOS EMBRIONES.

Los valores de los pesos de los embriones se expresiin como la media f la

desviaci6n estándar n

- GC 1.455 i 0.300

cou 1 1.81 f0.596

cou 2 1 455 f 0.327333 _.

E2 1 17540 to496

- E2 2 '1.8521 t 0.375

CG

O

3.7627"

o O005 3.31 28*

5.1 121"

CG

cou I

cou 2

E2 I

E2 2

TABLA DE ANALISIS DE VARIANZA.

- - cou 1 cou 2 E t I E2 2

3.7627- 0.0005 3.3128' - 5.1121- O 3.9637" O 0265 - 0.0362

3 9637- O 3 K13In 5 396"

0.0362 5.3966" O 1347 O

O. 0265 3.5031- O - O. 1347

-pco.oi

*pc0.05

Los resultados de la tabla muestran un aumento en el peso de los embriones

de 0.31, 0.35 (pc0.01) y de 0.30 (~'0.05) em los grupos Cou 1, Cou 2 y E2 1

respectivamente en comparación con el GC.

.

Cuando se compararon los valores entre los grupos de Cou 1 y Cou 2 se

observó un aumento de 0.36 (pe0.01) en los embriones de Cou I.

Con respecto al peso de los embriones de E2 1 fue mayor (pc0.01) cuando se

comparó con el grupo Cou 2. Mientras que el peso de los embriones de E2 2 fue mas

alto (p<O.Ol) con respecto a Cou 2.

ANALISIS HlSTOLdGlCO CUALITATRíO.

En el grupo GC, se distinguen claramente los cordonw de células germinales

delimitados por células de aspecto aplanado, lac dales si3 localizan, en algunos

casos cerca de vasos sanguíneos; los folículos son escasos y se encuentran

dispuestos en la periferia de la g6nada (Fig.1 y 2). En el gn ipo experimental Cou 1

se observan escasas asociaciones celulares que correspotiden a la formación de

folículos, los cordones de células germinales están menos iiefinidos que en el GC

(Fig. 3). En Cou 2 no se llegan a apreciar folículos y los cordones de células

germinales se encuentran poco definidos y constituidos por delgadas fibrillas (Fig 4

y 5). En Ezl se distinguen claramente los cordones de i*lulas germinales, los

folículos son abundantes en toda la gónada dentro de IBS cuales se aprecian

ovogonias con núcleo heterocromático y ovocitos en paqcriteno; los foliculos se

encuentran delimitados por un epitelio aplanado simple bien definido (Fig. 6 y 7). En

Ez 2 se definen mejor los cordones de células germinales en relación con los grupos

anteriores, así mismo los folículos se aprecian con mayor claridad que en el grupo

E2 1; de igual forma son abundantes en toda la periferia de la gónada dentro de los

cuales se observan mayor número de ovocitos primarios en paquiténo y escasas

ovogonias (Fig.8 y 9). En ambos grupos E2 1 y 2 el epitelio overico se encuentra

bien definido.

lbre\ iaturas C (ordone6

b P boliculos primordiales c P Cápsula

FICl.RA 1 GRI PO COYTROL H-E ZSOS

FICklRA 2 GRUPO CONTROL H-E SOOS

. FIGURA 3 DOSIS BAJA <'01iMESTROI, H-E 25OX

FIGURA 4 DOSIS ALTA COL \.IESTR<>L H-E 250s

.

FIG1 R-4 5 DOSIS . \LT.I Cok LIEhTROL H-E 500s

U

FIGURA 6 DOSIS BAJA ESTRADIOL H-E 250s

FIGURA 7 DOSIS BAJA ESTRADIOL AZUL ALCIANO 2SOX

FIGl RA 8 DOSIS ALTA ESTRADIOL AZt'L ALCIANO 250s

. . .. :

. .-. . . ~. . FIGl R.\ 9 DOSIS ALTA ESTRADIOL AZCL ALCIAh'O 250s

DiSCUSidN Y CONCLUSdN.

Los resultados del presente trabajo muestran que tanto la administración de

coumestrol y estradiol en dosis bajas y altas afecta el peso de los embriones. Los

pesos de los embriones de los grupos Cou 1, E2 1 y E..! 2 contrastan con los

resultados obtenidos por Bellido y colaboradores (1 985) en animales neonatos

estrogenizados.

El análisis histológico muestra que tanto en el GC y Cou 1, las imágenes que

se observan son muy similares, ya que en ambos casos podemos distinguir escasas

asociaciones celulares que corresponden a folículos primordiales los cuales se

encuentran localizados principalmente en la periferia de la gi'inada, sin embargo, los

cordones de células germinales en 01 GC, en el caso del grupo Cou 1 no están

definidos; en Cou 2 no se llegan a apreciar foliculos primcrdiales y los cordones

germinales se encuentran definidos por elementos fibrosos.

En ambos grupos de E2 1 y 2 se observan foliculos hien definidos dentro de

los cuales se encuentran ovocitos y ovogonias en el caso de E2 1 son más

abundantes las ovogonias con núcleo heterocromático y en número menor los

ovocitos primarios paquiténicos, en comparación con E7 2 ocurre lo contrario se

observan mayor número de ovocitos primarios paquiténico:; y escasas ovogonias

con nucleo bhofilo. También en ambos grupos E2 1 y 2 se piiede apreciar el epitelio

ovárico bien definido. En todos los grupos mencionando desde GC, Cou 1, Cou 2,

E2 1 y E2 2 se puede observar la presencia de cordones de wilulas germinales.

Es muy probable que el tratamiento agudo con Cou eri las dosis utilizadas

tenga un efecto antiestrogénico sobre la maduración gonadal del ovario fetal. En

la literatura como en el presente trabajo se reporta que el tratamiento con

estrogénos o análogos de estos compuestos inducen un mayor desarrollo

folicular (Bradbuty 1961). Sin embargo, el tratamiento con Cou produce un

retraso en el desarrollo folicular as¡ como de la gonada eii general, de manera

dosis dependiente, ya que con la dosis más alta el dssarrollo gonadal es

prácticamente nulo. El efecto antiestrogénico observado en el desarrollo ovárico,

puede ser debido a la competencia por los receptores a estrógenos, entre el

cournestrol y el estradiol endógeno, lo cual puede dar C(mo iesultado que el

coumestrol ocupe los receptores bloqueando la función de los estrógenos en el

desarrollo gonadal del embrión femenino.

En conclusión, el análisis histológico sugiere que el cournestrol presenta

actividad antiestrog8nica dosis dependiente.

.

L * .

BIBLIOGRAFíA.

Adams, N.R. 1990. Permanent infertility in ewes exposed to plant oestrogens. Aust.

Vet. J. 67: 197-201.

Baggs, R. K., Miller, R.K. and Odoroff, C.L. 1991. Active tliethylstibestrol in uter.

Cáncer Res. 51: 331 1-3315.

Bellido, C; Gaytán F; Aguilar R; Pinilla I . , and Aguilar E. 1985. Prepuberal.

Reproductive defects in Neonatal Estrogenized. Male rats. Biolgy of

Reproduction 33: 381 -387.

Bern, H.A., Mills, K. T., Kohrman, A. F., Mori, T., and Larsori, L. 1987.The neonatal

mouse, tumorigenesis after short-termexposure to hoi moms and its possible

relevance to human Syndrome. Cáncer Res 47: 21 65 41 72.

Bern, H.A., Mills, K.T. and Edery, M. 1985. In " Estrogens in the Evironment II,

Influences on Development " ( J.A. McLachlan, ed), pp 319-326. Elsevier,

New York. .

Bickoff, E.M., 1968. Oestrogenic constituents of forage plants. Review series No.1.

Ed. Commonwealth Bureau of Pastures and Field Crops.

Bickoff, E.M., Booth, A. N., Lyman, R.C., Livingston, A. L. and Thompson, C.R. 1957.

Coumestro! a now estrogen in solated from forge crops. Science 726: 969-

970.

Bickoff, E.M., Livingston, A.L., Hendrickson, A.P. and Booth, AN. Relative potencies

of several estrogen like compounds in forages. 1962 J. Agnc. Food Chern.

70: 410-412.

Bradbury, J.T., 1961. Direct action of estrogen on the ovaiy of the immature rat.

Endocrinology 68: 1 15-1 20.

4

Bridgette, M. C., McLachlan, J. A., Arnold, S.T. 199!.The estrogenic and

antiestrogenic activities of phytochemicals with tho hi iman estrogen receptor

expressed in yeast. Steroids 62:365-372.

Cox, R.I., Braden, A.W. 1974. The metabolism and physiol,igical effects of phyto-

oestrogens. Proc. Aust. Soc. Anim. Prod. 10: 122-129

Cox, R. I. 1977. Plant oestrogens affecting livestock in Ausiralia. Proccedings of o

joint United State Australian Simposium of poisonous Plnnts of Utah State

University, Logan.

Davies, J. and Lefkowitz, J. 1987. Citado en Taisen Iguchi. 1992. Cellular Effects of

Early Exposure to Sex Hormones and Antihormones. international Review of

Cytology. 139: 1-47.

Engle, P.H., Bell, D. S. and Davis, P.R. 1957. The effect0 of ladino clover, birds foot

trefoil and bluegrass pasture on the rate of concepti( in among ewes. Can J.

Anim. Sci. 16: 703-71 O.

Fowler, M.E. 1983. Plant poisoning in free-living wild animals: a review. J. Wi/d/ife

Dis. 19: 3443.

Fredricks, G.R., Kincaid, R.L., Bondoili, K.R. and Wright, R.W. 1981. Ovulation

Rates' and embryo Degeneracy in Female Mice Fed the Phytoestrgen,

Coumetrl. Proc Exp Biol Med 167: 237-241.

Ganong., W. F.1996.Cap. 23. Gonadas desarrollo y fiinciones del aparato

reproductor. Fisiología Médica. Ed. Manual Moderno. ed.5a. p492.

Gardiner, M.R. and Naim. M.E. 1969. Studies on the effect o1 cobalt and selenium in

clover disease of ewes. Aust. Vet. J. 45: 215-222.

Gilbert., S.F. 1991. Cell interaction at distance: hormone as mediators of developent.

Deislopmental Biology: Chapter 19. De Sinaver Associatns Inc. Sunderland.

Massachusetts. pp 685-713.

Goldenberg, R.L., Vaitukaitis, J.L. and Ross, G.T. 1972. Estrogen and FSH

Interaction on follicle grotwth in rats. Endocrinology 90 :1492-1498.

Hanson, Z.H. 1965. Citado en Delgado, I., Ramón, J., Valdeirabano. 1992. Efectos

del pastoreo directo sobre un cultivo de alfalfa. Invttst. Agr.: Prod. Sanid.

Anim., 7: 71-79.

Hartam, H.M., Louvet, J.P. and Ross, G.T. 1975. Interac.tion of estrogen and

gonadotrophins on follicular atresia. Endocrinology 96: 1145-1 152.

Jost A. 1991. Chapter II. La diferenciation du Sexe en la reproduction chez les

mamiferos et I’homme. Coordonnatevrs Thi bantt c. and Levassenr

M.’C.INRA. pag 189-204.

Jurado, C.R. 1989. Fitbestrógonos, plantas estrogénicas, horigos estrogbicos. En :

toxicología Veterinaria . Editado por Jurado C. R:, 367-497. Salvat Editores,

Barcelona, España.

Livingston, A.L., Bickoff, E.M., Guggolz, J. and Thompson, (;.R. 1961. Quantitative

determination of coumestrol in fresh and dried alfalfa J. Agric. i d . Chem. 9:

135-1 37.

Martin, P.M., Orwitz, K., Ryan, D. and McGuire, W.1978. Phytoestrogen interaction

with estrogen receptors in human breast cancer cells. Endocrinology 703:

1860-1 867.

Miksicek, R.J. 1994. Interaction of naturally ocurring nonsleroidal estrogens with

expressed recombinant human estrogen receptor. J Steroid Biochem Mol

BiOl 49: 153-1 60.

Newbold, R.R., Bullock, B.C. and MC Lachlan, J.A 1983. Exposure to

Diethylstibestrol During Pregnancy Permanently Alters the Ovary and

Oviduct. Pi01 Reproduction 28:735-744.

Newsome, F. E. and Kitts, W.D. 1980. The effects of feeding coumestrol on the

reproductive organs of prepubertal lambs. Can. J. Anim. Sci. 60: 53-58.

üjeda, S.R., Urbanski, H.F. and Ahmed, C.E. 1986. The onset of female puberty:

studies in the rat. Recent Horm Res 42: 385-440.

Richards, J.S. 1979. Hormonal control of ovarian follicular development: a

perspective. Recent Prog Horm Res 35: 343-373.

Richards, J.S. 1980. Maturation of ovarian follicles: Action and interections of

pituitary and ovarian hormones on follicular cell diferentiation. Physiol. Rev.

60: 51-89.

Rodger, R.J., Clarke, I.J., Findlay, J.K., Ainslie, B., Curnming, I., Muller, B.D. and

Walker, o S.K. 1980. Plasma LH and FSH in ewes that were either fertile or

infertile after long-term grazing of oestrogenic pasture. Aust. J. Biol. Sci. 38:

21 3-220.

Shemes, M., Lindner, H.R. and Ayalon. N. 1972. : Affinity of rabbit uterine oestradiol

receptor for phyto-oestrogens and its use in a competitive protein-binding

radioassay for plasma coumestrol. J. Reprod. Fed. 29: 1-9.

Takasugi N. 1976. Cytological basis for permanent vaginal changes in mice treated

neonatally with steroid hormes. lnt Rev Cytd 44:195-223.

Valderrabano, J. and Folch, J. 1993. Reproductive performace of rasa Aragonesa

ewes mated en lucerne ( Medicago sativa C.V.Aragon ) pasture. Small

Ruminant Research 11: 323-329.

Whitten, P.L. and Naftolin F. 1992 Effects of a phytoestrogen diet on estrogen-

dependent reproductive processes inmature female rats. Steroids 57: 5601.

Wong, E., Flux, D.S. and Latch, G.C. M. 1971. The oestrogenic activity of white

clover. N. Z J Ag*. Res. 14: 639-645.

Young,, W.C. 1961. The Mammalian Ovary. In: Sex and Internal Secretions, vol I, 3

ed ( W. C. Younp and G.W. Corner, eds.). William 8 Wilkins, Baltimore, p

451.

APENDICE A

TECNICA PARA INCLUSION DE TEJIDOS

1 .OII-809/0 30min

2.OH-8OYo 30min

3 OH-96% 30min

4.OH-96Yo 30min

5.OH-100% 30min

6.OH- 100% 30min

7.OH-XILOL 4Smin

8.XILOL I 6Omin

9 XKOL I1 6Omin

10 PARAFmA I 6Oniin

11 PARAFINA 11 60niin

.

TECNlCAS DE Tlh’CION HEMATOXILINA-EOSINA

1. XlLOL I Smin

2.xrLOL 2 Smin

3.0H-XLOL 3min (1:l)

4.OH-IOOYo I 2niin

5.OH-100Y0 11 Zmin

6.OH-ETER 2min ( 1 : 1)

7.OH-96% -. 2min

8 .OH-80% 2min

9.OH-60% 2min

10 H20 (3 lavados)

1 1 HEMATOXILINA 7min

12 LAVADO CON H2O (RAPIDO)

13 OH-ACID0 (LAC ADO)

14 H20 DESTILADA (LAVADO)

15 SOL SCOTT lmin

16 H2O DESTILADA (LAVADO)

17 EOSiNA 3min

18 OH-96% I (LAVADO)

19.0H-965 I1 (LAVADO)

20 OH-100% 1 (LAVADO)

2 1 .OH-100% I1 (LAVADO)

22.011-XILOL (LAVADO)

23.XiLOL 1 (LAVADO)

24.XlLOL I1 (LAVADO)

.. 25.MONTAJE. .

AZUL ALCIANO-PAS

1 .XILOL I Sinin

2.xKLOL I1 5min

3.0H-XiLOL 3min( l:l)

4 OH-1 00% I 2min

5.OH-100% I1 2min

6.0H-96% I 2min

7.0H-96% 11 2min

8.OH-80Yo 2min

9 OH-60% 2min

10 H20 DESTILADA (3 LAVADOS)

1 1 ÁCIDO ACETIC0 3% 2min

12.- DE ALCIANO 30min

13.H20 CORRIENTE 7min

14 H 2 0 DESTI LADA (LAVADO)

IS.ACiD0 PERYODICO 5% 1Omin

16 H 2 0 CORRiENTE 5min

17 H 2 0 DESTILADA (LAVADO)

18 REACTIVO DE SCIIFF IOmin

19 TRES BAÑOS DE SlJLFlTO ACID0

' DE SODIO '2min g@&3mO) II - - . a

20 H 2 0 CORRiENTE 5min

21 HFVATOXILINA ómin

22 H2C CORRIENTE (LAVADO)

23 OH-ACID0 (LAVADO)

24 H20 CORRIENTE (LAVADO)

25 SOL. SCOTT 1 min}

26 H20 DESTILADA (LAVADO)

27 ÁCIDO PICRIC0 SATURADO 1 min

28 OH-96% I (LAVADO)

29.0H-96% I1 (LAVADO)

30 OH-100% I (LAVADO)

3 1 .OH-100% I1 (LAVADO)

32.XILOL-OH (LAVADO)

33 X L O L I (LAVADO)

34 XILOL I1 (LAVADO)

35.MONTAJE.

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