2.5.15 tripanosomosis

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004 815

C A P T U L O 2 . 5 . 1 5 .

TRIPANOSOMIASIS (Trypanosoma evans i )

RESUMEN

La tripanosomiasis1 causada por Trypanosoma evansi (surra) es la tripanosomiasis patogena animal con una distribucin geogrfica ms amplia, y afecta al ganado domstico de Asia, frica, Amrica Central y Sudamrica. La especie hospedadora principal vara segn el rea geogrfica, pero en particular el bfalo, el ganado vacuno, los camellos y los caballos resultan ser los ms afectados, aunque tambin hay otros animales susceptibles. Es una enfermedad transmitida por artrpodos y se considera que los vectores ms importantes son varias especies de Tabanus. Por lo general, el diagnstico de la surra se basa en la demostracin de los parsitos en la sangre, complementndolo con pruebas hematolgicas, bioqumicas y serolgicas complementarias.

En animales susceptibles la enfermedad se manifiesta por fiebre, vinculada directamente a la parasitemia, junto con una anemia progresiva, prdida de la condicin normal y decaimiento. Durante el curso de la enfermedad ocurren episodios recurrentes de fiebre y parasitemia. A menudo se observa edema, particularmente en las partes inferiores del cuerpo, placas de urticaria y hemorragias petequiales de las membranas serosas. En Asia se han descrito abortos en los bfalos. Existen indicios de que la enfermedad provoca inmunodeficiencias. Sin embargo, aunque los signos clnicos de la surra resultan indicativos, no son suficientemente patognomnicos, y se debe confirmar el diagnstico por mtodos de laboratorio.

Identificacin del agente: Se requiere un diagnstico de laboratorio porque los sntomas clnicos generales de las diversas formas de infeccin por T. evansi no son patognomnicos. Cuando existe una parasitemia alta, el examen de extensiones de sangre fresca, los frotis de sangre teida y el material de los ndulos linfticos deben revelar la presencia de tripanosomas. En los casos ms crnicos, como en la fase de portador, se recomienda el examen de frotis sanguneos muy densos, as como mtodos de concentracin de los parsitos y la inoculacin en animales de laboratorio. En la actualidad se est explorando un enfoque complementario atractivo basado en la aplicacin de pruebas para la deteccin del antgeno. Tambin existen ensayos piloto con versiones de enzimoinmunoensayo y aglutinacin con ltex. Mediante la reaccin en cadena de la polimerasa, se pueden detectar pequeas cantidades de secuencias del ADN de los tripanosomas, bien definidas y muy especficas, en la sangre y otras muestras de los hospedadores infectados.

Las pruebas hematolgicas y bioqumicas no son especficas de una infeccin por T. evansi, pero revelan las consecuencias patolgicas de la infeccin. Tales pruebas ayudan a analizar los resultados de la quimioterapia en reas donde la enfermedad es endmica. Las pruebas incluyen la determinacin del volumen de las clulas sanguneas empaquetadas y los niveles de inmunoglobulinas.

Pruebas serolgicas: La infeccin provoca respuestas de anticuerpos especficos y se han introducido diversas pruebas de deteccin de anticuerpos. stas se han validado en parte, pero an estn pendientes de evaluacin y normalizacin a gran escala. En el laboratorio se pueden emplear ensayos de inmunofluorescencia y enzimoinmunoensayos. Para condiciones de campo, todava deben desarrollarse pruebas relativamente sencillas. Las mas adecuadas son las pruebas de aglutinacin directa con los tripanosomas del torrente circulatorio, las pruebas de aglutinacin indirecta con eritrocitos recubiertos por antgeno (hemoaglutinacin indirecta) o con partculas de ltex. Los ensayos para detectar anticuerpos circulantes tienen un elevado ndice de validez. Las

1 Nomenclatura de enfermedades parasitarias: vase la nota en el Captulo 2.3.15. Tripanosomiasis (transmitida por la

mosca tse-ts).

Captulo 2.5.15. Tripanosomiasis (Trypanosoma evansi)

816 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

estimaciones de los valores predictivos de las distintas pruebas serolgicas indican que los enzimoinmunoensayos (ELISA) para detectar anticuerpos IgG son probablemente los ms indicados para clasificar correctamente los animales no infectados, y que las pruebas de aglutinacin en placa (CATT) son probablemente las ms apropiadas para clasificar de modo correcto a los animales verdaderamente infectados. Por tanto, una prueba ELISA para determinar IgG sera adecuada para comprobar, antes de un desplazamiento o durante una cuarentena, que los animales estn libres de infeccin. En situaciones en las que la enfermedad se presenta abiertamente, las pruebas CATT se pueden utilizar para establecer un tratamiento individualizado de los animales contra los tripanosomas. Para declarar un estado de ausencia de enfermedad se recomiendan pruebas seriadas, esto es, una prueba ELISA seguida de una comprobacin por CATT de muestras sospechosas. No obstante, debe destacarse que hay una considerable similitud antignica entre las diferentes especies de tripanosomas patgenos, por lo que en zonas en que ocurre la tripanosomiasis transmitida por la mosca tse-ts se producirn reacciones cruzadas en cualquier prueba serolgica utilizada.

Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: No existen vacunas para la enfermedad.

A. INTRODUCCIN

El diagnstico de la infeccin por Trypanosoma evansi, que es una enfermedad transmitida por artrpodos, se basa en sntomas clnicos y en la demostracin de la presencia de los parsitos por mtodos directos o indirectos.

Los sntomas clnicos de la tripanosomiasis, la enfermedad causada por T. evansi, resultan indicativos, pero no son suficientemente patognomnicos, por lo que el diagnstico de la enfermedad se debe confirmar por mtodos de laboratorio. En los animales susceptibles, que incluyen ganado bovino, bfalos, camellos y dromedarios, caballos, cerdos, ovejas y cabras, la enfermedad se manifiesta con fiebre, asociada directamente a la parasitemia, junto a una anemia progresiva, prdida de la condicin normal y lasitud. Durante el curso de la enfermedad ocurren episodios recurrentes de fiebre y parasitemia. A menudo se observa edema, particularmente en las partes inferiores del cuerpo, placas de urticaria y hemorragias petequiales de las membranas serosas. En Asia se han descrito abortos en los bfalos (15). Existen indicios de que la enfermedad provoca inmunodeficiencias (26).

Hay una variacin considerable en la enfermedad en lo que respecta a la patogenicidad de cepas diferentes y a la susceptibilidad de diferentes especies de hospedadores. La enfermedad se puede manifestar en forma aguda o crnica, y en el ltimo caso puede persistir durante muchos meses. A menudo la enfermedad es mortal en camellos, bfalos, ganado bovino, llamas y perros, pero en estas especies tambin se pueden presentar infecciones suaves y subclnicas. Algunos animales salvajes, como los ciervos y los roedores capibaras, pueden resultar infectados. Los animales sometidos a estrs malnutricin, embarazo, trabajo- son ms susceptibles a la infeccin.

Trypanosoma evansi es biolgicamente muy similar a T. equiperdum, el agente causal de la durina, y se parece morfolgicamente a las formas delgadas de los tripanosomas transmitidos por la mosca tse-ts, T. brucei, T. gambiense y T. rhodesiense. La caracterizacin molecular de varias cepas de T. evansi aisladas de Asia, frica y Sudamrica indica que tienen un nico origen. Adems, es tambin probable que T. evansi y T. equinoperdum pertenezcan a la misma especie. Como todos los tripanosomas patgenos, T. evansi est recubierto por una densa capa proteica formada por una nica protena llamada la glicoprotena variable de superficie. sta acta como el inmungeno principal e induce la formacin de anticuerpos especficos. Los parsitos con capaces de evitar las consecuencias de estas reacciones inmunes cambiando la glicoprotena variable de superficie, fenmeno que se conoce como variacin antignica.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO

1. Identificacin del agente

El mtodo directo y clsico para el diagnstico de la tripanosomiasis condujo al descubrimiento original del parsito. Todava se emplea para examinar muestras de sangre o de ndulos linfticos, pero raramente con extractos de otros tejidos. No es posible una identificacin microscpica especfica por frotis de sangre en regiones donde adems de T. evansi se presentan T. brucei y T. equiperdum. En el futuro, se podr disponer de



sondas de ADN especficas (22,36) que permitan la identificacin de especies de tripanosomas por hibridacin no radioactiva de ADN.

Mtodos directos a) Mtodos normales de campo

i) Muestra de sangre

Como el resto de los miembros del subgnero Trypanozoon, T. evansi es un parsito sanguneo y de los tejidos; en particular, se encuentra en los vasos sanguneos profundos en los casos de parasitemia baja. Por esta razn se recomienda que la sangre para diagnstico se obtenga tanto de los vasos perifricos como de los profundos. Sin embargo, es preciso saber que por examen de la sangre perifrica se pueden identificar menos del 50% de los animales infectados.

La sangre perifrica se obtiene por puncin de una pequea vena de la oreja o de la cola. Las muestras ms profundas se toman con una jeringuilla de una vena ms grande. Primero se limpia con alcohol un rea marginal de la oreja o de la punta de la cola y, cuando est seca, se pincha con un instrumento adecuado. Es importante esterilizar los instrumentos o emplearlos de un solo uso entre animales individuales, de modo que la infeccin no se transmita por sangre residual.

ii) Extensiones de sangre fresca

Se coloca sobre un porta de vidrio limpio una pequea gota de sangre y se deposita encima un cubre para extender la sangre como si fuera una monocapa de clulas. sta se examina por microscopa de fondo claro (x200) para detectar cualquier tripanosoma mvil.

iii) Tincin de frotis densos

En el centro de un porta para microscopa se coloca una gota grande de sangre y se extiende con un palillo o el borde de otro porta hasta cubrir un rea aproximada de 1,0-1,25 cm de dimetro. Se deja secar durante al menos 1 hora protegiendo la preparacin de insectos. El frotis sin fijar se tie durante 25 minutos con Giemsa (una gota de Giemsa comercial + 1 ml de solucin salina tamponada con fosfato [PBS, 2,4 g de Na2HPO4.2H2O, 0,54 g de NaH2PO4.2H2O, 0,34 g de NaCl], pH 7,2). Despus de lavar, los portas se examinan en un microscopio de fondo claro a un aumento elevado (x500-1.000). La ventaja de la tcnica de frotis denso es que concentra la gota de sangre en un rea pequea y se necesita menos tiempo para detectar los parsitos. La desventaja es que se pueden daar los parsitos durante el proceso, y el mtodo no es por tanto adecuado para identificacin de especies en el caso de infecciones mixtas.

iv) Tincin de frotis finos

Se coloca una gota de sangre a 20 mm de un extremo de un porta limpio para microscopa y se prepara una extensin fina del modo usual. La extensin se seca brevemente al aire, se fija durante 2 minutos con alcohol metlico y se deja secar. Luego los frotis se tien 25 minutos con Giemsa (una gota de Giemsa + 1 ml de PBS, pH 7,2). Esta preparacin se escurre, se lava con agua del grifo y se seca. Los frotis no fijados se pueden teir cubrindolos 2 minutos con colorante de May-Grnwald, y se aaden luego un volumen igual de PBS, pH 7,2, dejando los portas durante otros 3 minutos. Esta preparacin se escurre y se aade Giemsa diluido, que se mantiene durante 25 minutos. sta se vierte de nuevo, se lava el porta con agua de grifo y se seca. Los portas se examinan a elevado aumento (x400-1.000). Esta tcnica permite estudios morfolgicos detallados y la identificacin de la especie de tripanosoma. Tambin existen tcnicas rpidas de tincin (Tincin de Field, Diff Quick).

v) Biopsias de ndulos linfticos

Normalmente las muestras se obtienen de los ndulos linfticos preescapulares o precrurales (subilacos). Se selecciona por palpacin un ndulo adecuado y se limpia la zona con alcohol. El ndulo se pincha con una aguja adecuada y el material del ndulo linftico se aspira en la jeringuilla. Este material se sita luego sobre un porta, se tapa con un cubre y se examina como en las preparaciones de sangre fresca. Tambin se pueden guardar frotis fijados para examen posterior.

b) Mtodos de concentracin

En muchos hospedadores T. evansi puede inducir infecciones clnicas leves o un estado subclnico de portador con baja parasitemia en donde resulta difcil poner de manifiesto los parsitos. Pueden necesitarse mtodos de concentracin.

i) Centrifugacin de hematocrito

Se recoge sangre (70 l) en tubos capilares (75 x 1,5 mm) con heparina, que luego se cierran por el extremo seco y se centrifugan, con el extremo cerrado hacia abajo, a 3.000 g durante 10 minutos. Se pegan a un porta dos trozos de cristal (25 x 10 x 1,2 mm) y se coloca entre ellos el tubo capilar. Se puede colocar encima un cubre al nivel de la unin de la capa de leucocitos, donde los tripanosomas aparecern concentrados. El espacio alrededor de esta parte del capilar se rellena con agua o con



aceite de inmersin, y se examina el rea de la capa de leucocitos al microscopio (100-200x). Una alternativa ms simple consiste en examinar el tubo capilar centrifugado colocando una gota de aceite de inmersin sobre el tubo y asegurndose de que hay contacto entre la lente objetivo y el aceite de inmersin.

ii) Tcnica de la capa de leucocitos en campo oscuro o contraste de fases

Se recoge sangre en tubos capilares con heparina y se centrifuga como se indica arriba. El tubo se marca y se rompe 1 mm por debajo de la capa de leucocitos, de tal modo que la parte de arriba contiene la capa superior de eritrocitos (RBCs), la capa de leucocitos y algo de plasma. El contenido de esta parte se saca parcialmente sobre un porta, se cubre con un cubreobjetos y se examina por microscopa de campo oscuro, por microscopa de contraste de fases o por microscopa ordinaria de campo claro.

Como alternativa a la centrfuga de hematocrito que funciona con electricidad, se han utilizado con xito microcentrfugas manuales para la deteccin de la tripanosomiasis en ganado bovino y en camellos (8,13).

iii) Tcnicas hemolticas

Se puede utilizair dodecil sulfato sdico (SDS) como reactivo para provocar la hemolisis de RBCs y facilitar as la deteccin de los tripanosomas mviles en las muestras de sangre parasitada. Como el SDS es txico, se debe evitar el contacto con la piel, su inhalacin y su ingestin. La solucin de SDS se puede guardar varios meses a temperatura ambiente. Tanto la solucin de SDS como la muestra de sangre deben utilizarse a temperaturas superiores a 15C. A temperaturas ms bajas, los tripanosomas pueden destruirse.

Se pueden aplicar dos procedimientos generales2, la clarificacin de frotis de sangre fresca y la centrifugacin de hemolisis.

Mtodo de clarificacin de frotis de sangre fresca Este mtodo usa la lisis parcial de RBC para facilitar la deteccin de tripanosomas mviles. El mtodo requiere una solucin de SDS: 1% de SDS disuelto en Tris/glucosa/solucin salina, pH 7,5, asas de inoculacin (de 10 l), portas y cubres (24 x 24 mm), y una gota de sangre fresca o heparinizada. Se disuelven 100 mg de SDS en 100 ml de tampn isotnico Tris/NaCl/glucosa, pH 7,5 (14 g de Trizma base, 3,8 g de NaCl, 10.8 g de glucosa; disolver los productos en 750 ml de H

2O destilada, aadir 90-

100 ml de HCl 1 N y ajustar el pH a 7,5, luego llevar a un volumen final de 1.000 ml con H2O

destilada). Este tampn se puede guardar en viales pequeos durante varios meses a temperatura ambiente. La prueba no aporta una mayor sensibilidad que la tcnica de las extensiones de sangre fresca. Adems, el SDS puede causar problemas al enfocar el microscopio y los movimientos de los tripanosomas se pueden limitar debido a la alta viscosidad del SDS.

Poner aproximadamente 10 l de sangre en un porta. Aadir 10 l de la solucin de SDS utilizando un asa de inoculacin y mezclar ligeramente. Aplicar un cubre. Visualizar sin retraso toda la preparacin a bajo aumento (x100 o x200).

Tcnica de la centrifugacin de hemolisis Para este procedimiento se requiere una lisis casi completa de RBC. El material requerido incluye: solucin de SDS (0.1% de SDS disuelto en Tris/glucosa/solucin salina, pH 7,5), tubos cnicos de centrfuga, tubos de ensayo ordinarios, pipetas de plstico de punta larga y fina con perilla de goma incorporada, portas, cubres (24 x 24 mm o 24 x 32 mm), y sangre con heparina.

Utilizando una pipeta o una jeringuilla, se transfieren nueve volmenes de solucin de SDS (mximo 6,3 ml) a un tubo de ensayo ordinario. Aspirar un volumen (mximo 0,7 ml) de sangre heparinizada con una pipeta con perilla de goma y depositarlo justamente encima de la superficie de la solucin de SDS; mezclar rpida y minuciosamente. Evitar la formacin de espuma, que puede destruir los tripanosomas. Esperar 10 minutos para permitir una hemolisis completa.

Poner la suspensin hemolizada en tubos cnicos de centrfuga y centrifugar a aproximadamente 500 g durante 10 minutos. Sin alterar el sedimento, extraer tanto sobrenadante como se pueda mediante una pipeta limpia con perilla. Utilizando de nuevo una pipeta de punta fina y con perilla, extraer ms sobrenadante, dejando en el fondo 10-20 l de sobrenadante sin alterar. Luego se recoge con mucho cuidado el sedimento completo y se pone sobre un porta. Se aplica un cubre y se examina la preparacin completa sin retraso a bajo aumento (x100 o x200).

iv) Tcnica de mini-intercambio aninico y centrifugacin

Cuando se pasa a travs de una columna apropiada de intercambio aninico una muestra de sangre humana o animal que est infectada por tripanosomas, como las clulas sanguneas del hospedador

2 Se pueden obtener todas las instrucciones y materiales necesarios del Instituto de Medicina Tropical, Laboratorio de

Serologa, Nationalestraat 155, B-2000 Antwerp, Blgica.



estn cargadas ms negativamente que los tripanosomas, se adsorben al intercambiador aninico, mientras que los tripanosomas resultan eluidos manteniendo su viabilidad y su infectividad. Se ha desarrollado un mtodo de campo simplificado para la deteccin de parasitemias bajas (14, 17, 31). La sensibilidad de esta tcnica puede aumentarse aproximadamente diez veces cuando se utilizan preparaciones de leucocitos en vez de sangre completa (30).

Preparacin de solucin salina de glucosa tamponada a pH 8 Na2HPO4 (anhidra) (13,48 g); NaH2PO4.2H2O (0,78 g); NaCl (4,25 g); agua destilada (1 litro).

Las soluciones de diferente fuerza inica se hacen diluyendo el stock de PBS, pH 8, y aadiendo glucosa para mantener una concentracin adecuada. Para sangre de ratn, de rumiantes salvajes y domsticos, y de perro, aadir 4 partes de PBS a seis partes de agua destilada y ajustar la concentracin final de glucosa a 1%. Para sangre de cerdos o conejos, aadir tres partes de PBS a siete partes de agua destilada y ajustar la concentracin final de glucosa a 1,5%. La solucin de PBS/glucosa (PSG) debe estar estril.

Equilibrado de la matriz de DEAE-celulosa Suspender 500 g de DEAE-celulosa (dietilamino-etilcelulosa) en 2 litros de agua destilada. Ajustar el pH a 8 con cido fosfrico. Dejar sedimentar durante 30 minutos. Eliminar el sobrenadante que contiene grnulos finos. Repetir el proceso tres veces. Guardar la suspensin equilibrada y concentrada (con aspecto de gel blando) a 4C o en pequeas alcuotas a 20C.

Montaje de la matriz de DEAE-celulosa equilibrada Se dispone una jeringuilla de 2 ml sin su mbolo y provista de aguja (20 G x 1,5 pulgadas) sobre una gradilla. En el fondo de la jeringuilla se coloca un disco de papel de filtro Whatman No. 41 y se humedece con unas cuantas gotas de PSG. Se vierten en la jeringuilla 2-2,5 ml del gel de celulosa equilibrada y se compacta mediante elucin con el tampn. La altura del sedimento debe ser aproximadamente 3 cm. Se lava y se equilibra la columna con 2 ml de PSG sin alterar la superficie.

Adsorcin de la sangre y elucin de los tripanosomas Colocar con cuidado 100-300 l de sangre heparinizada sobre la superficie de la columna de celulosa. Aadir diez gotas de PSG y desechar las primeras diez gotas eludas. Ir aadiendo 1.5 ml de PSG y comenzar a recoger el eluato en una pipeta Pasteur de punta fina con su extremo cerrado. Poner la pipeta llena, protegiendo su extremo con la punta de una pipeta cnica de plstico, dentro de un tubo y centrifugar a 525 g (o hasta 1.000 g) durante 10 minutos. Examinar la parte inferior de la pipeta al microscopio (x100 o x200) utilizando un dispositivo especial de montaje. Alternativamente, el eluato se puede recoger en tubos de plstico de 50 ml, con fondo cnico, centrifugar a 1.000 g y examinar el sedimento por microscopa de fondo oscuro.

Durante el proceso, la columna debe permanecer constantemente hmeda.

c) Inoculacin en animales

Se pueden utilizar animales de laboratorio para revelar infecciones subclnicas (no patentes) en animales domsticos. Trypanosoma evansi tiene un amplio rango de infectividad entre los pequeos roedores, de modo que se utilizan con frecuencia ratas y ratones. En estudios de infecciones de camellos por T. evansi, se han hecho comparaciones entre los anlisis mediante frotis densos de sangre y las pruebas de inoculacin en rata y en ratn; la inoculacin en animales dio resultados ms positivos, 15,2% y 17% respectivamente, que el anlisis slo de frotis densos (7,27). Aunque la inoculacin en ratn no es sensible al 100% (19) se puede mejorar la tcnica utilizando como material la capa de leucocitos. Se ha utilizado un procedimiento modificado de inoculacin en ratn que permite detectar un nivel tan bajo como 1.25 T. evansi/ml de sangre (30).

La sangre tratada con el anticoagulante heparina sdica se inocula intraperitonealmente en ratas (1-2 ml) o ratones (0,25-0,5 ml). Se recomienda la inoculacin de un mnimo de dos animales; los animales se sangran por la cola tres veces a la semana para detectar la parasitemia. El perodo de incubacin antes de la aparicin de los parsitos y su virulencia depende de la cepa de los tripanosomas, su concentracin en el inculo, y la cepa de animal de laboratorio empleada. La sensibilidad de este sistema de cultivo in vivo tal vez se pueda mejorar con el uso de animales de laboratorio inmunosuprimidos. A tal fin, se utilizan compuestos como ciclofosfamida o acetato de cortisona, irradiacin con rayos X o esplenectoma.

d) Sondas de ADN recombinante

Se estn evaluando sondas especficas de ADN para detectar tripanosomas en sangre o tejidos infectados (22,36).



Mtodos indirectos Estos mtodos implican pruebas hematolgicas o bioqumicas que demuestran los efectos del parsito sobre su hospedador en vez de detectar directamente el parsito mismo.

a) Hematologa

La anemia suele ser un indicio fiable de infestacion por tripanosoma, aunque no es patognomnico. Sin embargo, hay animales con infeccin subclnica suave que pueden tener parasitemia sin evidencia de anemia.

La anemia se puede determinar midiendo el volumen de clulas empaquetadas y puede utilizarse en la vigilancia de rebaos o manadas en riesgo. Esta tcnica es idntica a la de centrifugacin del hematocrito. Se examina el tubo capilar y los resultados se expresan como porcentaje del volumen de RBCs empaquetadas respecto al volumen total de sangre.

b) Pruebas bioqumicas

Las pruebas bioqumicas incluyen la floculacin, la formacin de gel con formol, la precipitacin con cloruro mercrico y el ensayo de turbidez con timol. Otros mtodos ms antiguos que se consideran superados tienen an un cierto uso en condiciones de campo debido a que son simples de realizar. Todas las pruebas dependen de un aumento en las globulinas sricas como consecuencia de la infeccin, pero este aumento no es especfico de una infeccin por T. evansi. Los ensayos de formacin de gel con formol y los de cloruro mercrico constituyen las pruebas de eleccin. Estas pruebas se han utilizado principalmente en camellos y se han utilizado raramente en otras especies. No existen datos sobre los niveles de globulinas que se requieren para producir una reaccin positiva.

Para la prueba del gel con formol, se ponen en un tubo aproximadamente 3-5 ml de sangre y se deja coagular. Se pasa aproximadamente 1 ml de suero sin clulas a un tubo ms pequeo y se aaden dos gotas de solucin de formalina (40% de formaldehdo [p/v]). Si el suero se coagula inmediatamente y se vuelve blanco, la prueba es positiva. En las reacciones negativas, el suero permanece sin cambios o la coagulacin puede tardar en aparecer hasta 30 minutos.

En la prueba del cloruro mercrico, se ponen aproximadamente 1-2 ml de sangre venosa en un tubo seco y se deja coagular. Para detectar casos precoces de infestacin por T. evansi, es necesario utilizar la concentracin ms alta de cloruro mercrico que no precipite el suero normal, es decir, entre 1/20.000 y 1/30.0000. Se pasa a un tubo pequeo una solucin de cloruro mercrico diluido (1 ml) y se aade con agitacin suave una gota de suero libre de RBCs. Nota: deben tomarse precauciones cuando se maneja el cloruro mercrico, especialmente para evitar su absorcin a travs de la piel.

Una reaccin positiva provoca la aparicin de opacidad, mientras que una reaccin negativa no detecta cambios en 15 minutos. Algunos autores sostienen que esta prueba solo es vlida en el caso de los camellos (6).

c) Deteccin de antgeno

Se han presentado y evaluado a escala relativamente grande algunos enzimoinmunoensayos (ELISA) de tipo piloto para detectar antgenos circulantes no variables de los tripanosomas (11). En principio, se espera que los sistemas diseados para T. brucei sean igualmente funcionales con todos los representantes del subgnero Trypanozoon, incluido T. evansi (4, 5, 18, 25, 37). Recientemente se ha desarrollado una prueba comercial de aglutinacin de antgeno con ltex para diagnosticar la surra (23), pero requiere ms evaluacin.

d) Deteccin de ADN de los tripanosomas

En los ltimos aos, varios centros de investigacin han estado trabajando en el desarrollo de procedimientos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar pequeas cantidades de secuencias del ADN de los tripanosomas. Algunas publicaciones recientes sobre su posible aplicacin a T. evansi son las de Ventura et al. (33) y Wuyts et al. (38). Sin embargo, an no hay sondas disponibles de ADN especficas de especie para organismos de tipo Trypanozoon. Aunque las tcnicas moleculares tienen una elevada sensibilidad analtica, estudios experimentales con bfalos (9) han demostrado que la sensibilidad diagnstica de una PCR fue solo de un 78%, similar a la prueba de inoculacin en ratn.



2. Pruebas serolgicas

Los mtodos para detectar anticuerpos humorales especficos frente a antgenos de tripanosomas incluyen la prueba de fijacin de complemento (FC), la de hemoaglutinacin indirecta y la de precipitacin. stas no se han aplicado en inspecciones a gran escala. Ms recientemente, se han utilizado ensayos de inmunofluorescencia indirecta (16, 20, 35), ELISA (2, 5, 16, 24, 28, 32, 40), y aglutinacin en tarjeta (CATT) (1,39). En Indonesia y Vietnam se ha llevado a cabo una extensa evaluacin de mtodos ELISA y CATT con bfalos (3,34). Se puede simplificar la toma de muestras utilizando manchas de sangre en papel de filtro para uso posterior en ELISA, mientras que en ensayos de tipo CATT se puede sustituir la sangre completa por suero (10). Otras modificaciones innovadoras que se pueden desarrollar en un futuro son el uso de varillas con colorantes coloidales (12) que podran permitir la realizacin de pruebas bajo condiciones de campo.

a) Prueba de inmunofluorescencia indirecta

Como antgeno se utilizan frotis de sangre desecada que contengan de cinco a diez tripanosomas de T. evansi por campo visual a un aumento de x500, recogida de un ratn o rata de 4 das despus de la infeccin. Los frotis se secan a temperatura ambiente durante 1 hora y se fijan en acetona durante 5 minutos. Cuando se mantienen secos, los frotis fijados se pueden guardar durante varios meses a 20C.

En la prueba, los portas se subdividen primero en varias reas utilizando medio de montaje o portas multimedia revestidos de Teflon, y luego se lavan con PBS, pH 7,2 a temperatura ambiente durante 10 minutos. La solucin stock de PBS contiene Na2HPO4.2H2O (9,72 g); KH2PO4 (2,15 g); NaCl (36,00 g); NaN3 (1,0 g); y agua destilada (hasta 1 litro). sta se guarda a temperatura ambiente y se repone cada mes. Antes de uso se diluye cinco veces con agua destilada.

Despus de lavar, se aade un control de suero positivo y negativo y los sueros a ensayar (diluidos de 1/50 a 1/100 o ms en PBS) y se deja reaccionar durante 30 minutos. Los portas se lavan tres veces sucesivas con PBS durante 5 minutos cada vez. Luego se aade un antisuero conjugado con fluorescena que sea especfico contra la especie ensayada y se deja durante 30 minutos. Los portas se vuelven a lavar en PBS, se preparan con medio de montaje para inmunofluorescencia y se examinan en un microscopio de fluorescencia. La solucin de glicerol debe conservarse a 4C y renovarse cada 2 semanas.

El conjugado de fluorescena debe guardarse en pequeas alcuotas a 20C para evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. El tubo debe protegerse de algn modo de la luz, por ejemplo envolvindolo en papel de aluminio. El conjugado se diluye en PBS, pH 7,2, o en PBS que contenga azul de Evans al 1/1.000 (p/v) como un colorante de contraste que facilita la diferenciacin entre la fluorescencia positiva (verde) y la negativa (roja).

En general, los resultados ms especficos se obtienen con conjugados anti-IgG monoespecficos (contra la cadena gamma).

b) Enzimoinmunoensayo

El principio de esta tcnica se basa en que los anticuerpos especficos contra los tripanosomas se pueden detectar por anti-inmunoglobulinas ligadas a un enzima utilizando como fase slida placas de poliestireno recubiertas de antgeno soluble. El enzima puede ser la peroxidasa, fosfatasa alcalina o cualquier otro enzima apropiado. El enzima conjugado se une al complejo antgeno/anticuerpo y luego reacciona con un substrato adecuado para producir un cambio de color caracterstico del substrato mismo o de un indicador aadido (el cromgeno).

El antgeno de recubrimiento de las placas deriva de la sangre de una rata con elevada parasitemia. Los tripanosomas se separan por medio de una columna de DEAE-celulosa y se lavan tres veces por centrifugacin con PSG fro, pH 8 (PBS con glucosa al 1%). El sedimento final se resuspende en PSG fro a una concentracin del 3-5%, y se somete a ultrasonidos brevemente en hielo durante 30-120 segundos hasta lograr la desintegracin completa de los organismos. Esta preparacin se centrifuga a 4C y 40.000 g durante 60 minutos. El sobrenadante se diluye con agua hasta obtener una concentracin de protena de 1 mg/ml. El producto as obtenido se puede guardar en pequeas alcuotas a 70C durante varios meses. Tambin se puede liofilizar y mantener a 20C. Se han aplicado diversos tratamientos a las preparaciones de antgeno para mejorar la precisin de la deteccin de anticuerpo (29).

Procedimiento de la prueba i) Antes de su utilizacin, el antgeno congelado o liofilizado se diluye o reconstituye con tampn

carbonato/bicarbonato 0,01 M, pH 9,6, recin preparado. El reactivo (100 l) se aade a cada pocillo de una placa de microtitulacin y las placas se incuban durante toda la noche a 4C o durante 1 hora a 37C.



ii) Se elimina el exceso de antgeno, se lavan las placas con 0.01 M de PBS que contenga 0,05% de Tween 20 (PBST), y se aaden diluciones de suero en PBST (100 l). Las diluciones normales de ensayo estn entre 1/100 y 1/1.000.

iii) Las placas se incuban a 37C durante 30 minutos y se lavan tres veces con PBST.

iv) Se aade la anti-globulina especfica conjugada (100 l) convenientemente diluida en PBST (normalmente entre 1/1.000 y 1/50,0000).

v) Las placas se reincuban a 37C durante 30 minutos y se lavan tres veces con PBST.

vi) En conjugados con peroxidasa se pueden utilizar varias soluciones de substrato/cromgeno, que constan de perxido de hidrgeno con un cromgeno, como tetrametilbenzideno (TMB), 2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6- cido sulfnico) (ABTS) y orto-difenilndiamina (OPD). Una posible solucin de substrato/cromgeno para conjugados con peroxidasa es perxido de hidrgeno al 30% (0,167 ml y 35 mg) en tampn citrato (100 ml), pH 6,0. El tampn citrato se prepara as: Solucin A (36.85 ml): (0,1 mM de cido ctrico [21,01 g/litro]); Solucin B: (65,15 ml): (0,2 M de Na2HPO4 [35,59 g/litro]; y agua destilada (100 ml). Disolver 10 mg de TMB en 1 ml de dimetil sulfxido y aadir a 99 ml del tampn citrato. Varias de estas combinaciones estn disponibles comercialmente y listas para uso y pueden permanecer estables a 4C hasta 1 ao.

vii) Se aade el substrato cromgeno (100 l) y se incuban las placas a temperatura ambiente durante 1520 minutos.

viii) La reaccin se detiene aadiendo 1M de cido sulfrico (50 l). La absorbancia de la mezcla de cada pocillo se lee a 450 nm para el cromgeno TMB. Otros cromgenos pueden requerir lecturas a otras longitudes de onda. Todos los ensayos deben incluir sueros de control positivo de actividad alta y media conocida, un suero de control negativo y un control del tampn.

Existe una amplia variedad de procedimientos de ensayo. Para especies animales muy relacionadas, con frecuencia se pueden utilizar reactivos que dan reaccin cruzada (por ejemplo, inmunoglobulina anti-bovina en el caso de los bfalos). Al igual que para la inmunofluorescencia, generalmente se recomienda la utilizacin de conjugados anti-IgG monoespecficos. Hay varios mtodos que se pueden utilizar para determinar un punto de corte de diferenciacin entre resultados positivos y negativos. El mtodo ms simple es basar el corte en la inspeccin visual de los resultados del ensayo con poblaciones negativas y positivas conocidas. Estos resultados muestran a menudo cierto solapamiento. El operador puede elegir el punto ms adecuado para modificar los resultados de falsos positivos o falsos negativos en funcin de la aplicacin del ensayo. Una alternativa es establecer el corte en el valor medio + 2 desviaciones estndar (SD) o +3 SD en una muestra grande de animales negativos. Finalmente, si no se dispone de muestras positivas/negativas se puede establecer el corte basndose en el anlisis de los datos en animales en situacin endmica. Si se separan los animales infectados y los no infectados segn una distribucin bimodal, entonces se puede seleccionar un valor adecuado. Es probable que los mtodos ELISA identifiquen correctamente los animales no infectados. Los resultados equvocos pueden volver a ensayarse mediante CATT. Actualmente no hay antgenos definidos fcilmente disponibles. El Instituto de Medicina Tropical en Antwerp tiene algunos antgenos todava en fase de evaluacin. Este instituto dispone de preparaciones CATT. Los ensayos para diagnstico que incorporan antgenos derivados de un nico VAT deben interpretarse con cautela y ser evaluados por completo en diferentes hospedadores y reas geogrficas distintas para determinar si su comportamiento es vlido en todo el espectro de infeccin de T. evansi.

c) Pruebas de aglutinacin en placa

Se sabe que varias cepas de tripanosomas de diferentes reas comparten algunos tipos predominantes de antgenos variables (VATs). Teniendo en cuenta este hecho, el Laboratorio de Serologa del Instituto de Medicina Tropical de Antwerp desarroll un ensayo de campo para el diagnstico de la enfermedad del sueo, la prueba de la aglutinacin en placa CATT/ T. brucei gambiense (21). Esta prueba usa tripanosomas fijados y teidos de un VAT definido. En la reaccin de aglutinacin intervienen antgenos de superficie, tanto variables como constantes. Se ha desarrollado un sistema de ensayo similar para el diagnstico de infecciones por T. evansi (1). La prueba CATT/ T. evansi se basa en la utilizacin de un VAT de T. evansi muy distribuido el RoTat . Este antgeno est siendo tambin evaluado en la actualidad para ser utilizado en pruebas ELISA. El CATT requiere antgeno liofilizado, PBS, pH 7,4, tarjetas de plstico, suero o sangre heparinizada y un aparato rotatorio. El antgeno liofilizado se puede conservar hasta 1 ao a 28C. El antgeno reconstituido se puede mantener a 28C durante 2 das, pero debe ser utilizado preferentemente en 8 horas.

Para el anlisis, se ponen 25 l de suero de ensayo diluido (1/4 o 1/8) y una gota (45 l) de suspensin de antgeno en uno de los crculos de la placa de ensayo. Despus de mezclar y extender los reactivos, la



placa se agita durante 5 minutos. Una reaccin positiva se evidencia por la aparicin de depsitos granulados y azulados que son visibles a simple vista3.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

No existen vacunas para esta enfermedad.

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3 En el Laboratorio de Serologa del Instituto de Medicina Tropical, Nationalestraat 155, B-2000 Antwerp, Blgica, se

encuentran disponibles preparaciones experimentales de CATT/ T. evansi para fines de evaluacin. Estn siendo evaluadas en colaboracin con el Instituto de Biologa Molecular de la Universidad Libre de Bruselas, con apoyo econmico del Laboratorio Internacional para la Investigacin de Enfermedades Animales (ILRAD), Nairobi, Kenya.



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2.5.15 tripanosomosis

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