ตรวจเอกสาร

สบูดํา ( Physic nut or Purging nut ) เปนพืชพื้นเมืองของอเมริกากลาง ชาวโปรตุเกสนําเขามาในเมืองไทยปลายสมัยกรุงศรีอยุธยานานกวา 200 ป เพื่อรับซื้อเมล็ดไปบีบเอาน้ํามันมาทําสบู สบูดาํมีชื่อเรียกแตกตางกันตามแตละทองถิ่น เชน ภาคกลาง เรียกวา ตนสบูดํา ภาคตะวันออกเฉียงเหนือ เรียกวา ตนมะเยา ภาคเหนือ เรียกวาตนมะหุงฮั้ว สบูดาํ มีชือ่วิทยาศาสตรวา Jatropha curcas Linn อยูในตระกูล Euphorbiaeae (ประยูร, 2529) ลักษณะทางสัณฐานวิทยา ระพีพันธ และ สุขสันต (2525) และ นรินทร (2526) ไดรายงานไววา ลักษณะทั่วไปของสบูดําเปนไมพุม ตนขนาดกลาง สูงประมาณ 2–7 เมตร มอีายุไมนอยกวา 20 ป ตนที่มอีาย ุ1.5 ป มีทรงพุมกวางโดยเฉลี่ยประมาณ 2.0 เมตร ความสูงประมาณ 2.1 เมตร ลําตนบริเวณปลายยอดและลําตนสวนที่มีอายุนอยมีสีเขียวผิวเรียบไมมีขน อวบน้ําแตเปราะงาย เมื่อมีอายุมากขึ้นสวนโคนของลําตนจะเปล่ียนเปนสีน้ําตาลอมดํา สวนใหญลําตนจะเริ่มแตกทรงพุมทางดานขางเมื่ออยูเหนือผิวดิน 12–15 เซนติเมตร ทนตอความแหงแลงไดดี หากปลูกในที่น้ําขังใบจะเหี่ยวและลําตนเนางาย

ใบ

เปนใบเดี่ยว (simple leaf) แผนใบเปนแบบ palmately compound, orbicular-cordate (broady – ovate) คลายใบพุดตาลหรือใบฝาย แตหนากวาเพราะมีไข (cutin) เคลือบอยูที่ผิวใบ ขอบใบเปนแบบ entire มีรอยหยัก (lobe) ตื้น ๆ ประมาณ 3-5 หยัก ฐานใบเปนแบบ cordate ปลายใบเปนแบบ mucronate ยกเวนปลายใบตรงตําแหนงรอยหยักตรงกลางเปนแบบ acute การจัดเรียงตัวของเสนใบเปนแบบ palmately netted แผนใบมีสีเขียวใบไม ขนาดของแผนใบเฉลี่ย มีความยาวประมาณ 19.78 เซนติเมตร และมีความกวางประมาณ 16.67 เซนติเมตร ใบสบูดํามีสวนของกานใบเชือ่มติดกับสวนของลําตน กานใบมีสีเขียว ความยาวกานใบเฉลี่ยประมาณ 0.56 เซนติเมตร ตําแหนงของการเกิดของใบจะเกิดสลับกัน สบูดํามักจะทิง้ใบในฤดูแลงและเมื่อแลงจัดก็จะทิ้งใบหมดทั้งตน (ประยูร, 2529)

ดอก

ออกดอกบริเวณปลายกิ่ง ลักษณะเปนชอดอกแบบ compound dichasia เปนดอกไมสมบูรณเพศ ดอกตัวผูและดอกตัวเมียอยูแยกตนกัน (monoecious) แตอยูภายในชอดอกเดียวกัน ลักษณะของ

ดอกตัวผูและดอกตัวเมียมีกลีบเล้ียงและกลีบดอกจาํนวน 5 กลีบเทา ๆ กันกลีบเล้ียงมีสีเขียวออนอมเหลือง กลีบดอกมีสีเหลืองออนอมขาว มีตอมน้ําหวานติดอยูติดอยูที่โคนดานในของกลีบดอก ดอกตัวผูมีจํานวนเกสรตัวผูอยูวงละ 5 อนั ดอกตัวเมียประกอบดวยรังไขและสวนของกานชูเกสรตัวเมีย สวนของรังไขแบงออกเปน 3 พู (carpel) อัตราสวนของดอกตัวผู : ดอกตัวเมีย ประมาณ 7 : 1 สบูดําจัดเปนพืชผสมขาม ดอกตัวผูในชอเดียวกันบานกอนที่ดอกตัวเมียพรอมท่ีจะรับการผสมเกสร ปริมาณดอกยอยประมาณ 70 – 120 ดอก ตอ 1 ชอดอก แตจะผสมติดเพียง 6-15 ผลเทานั้น (ประยูร,2529)

ผล

เปนแบบ nut-like ม ี 3 พู ผลคอนขางกลมหรือปอม ขนาดเสนผานศูนยกลางประมาณ 3.04

เซนติเมตร ผลออนมีสีเขียว เมื่อสุกจะเปลี่ยนเปนสีเหลืองสด และเปล่ียนเปนสีเหลืองออนในที่สุด เมื่อปลอยใหผลแหงคาตน เปลือกนอกของผลจะเปลี่ยนเปนสีดํา ผลแหงจะไมแตกออก (indehiscent fruit) ผลสด 1 ผลมีน้ําหนักประมาณ 15.06 กรัม ผลแหงน้ําหนักจะลดลงเหลือเพียง 2.06 กรัม ผลแกเมื่อแกะผนัง exocarp และ mesocarp ออกจะพบผนังของ endocarp สานกันเปนชั้นหุมเมล็ดไวภายในอกีทีหนึ่ง ผลนั้นจะติดเมล็ดไดประมาณ 2-3 เมล็ด (ประยูร, 2529)

เมล็ด

รูปรางเมล็ดของสบูดําเปนแบบรี มีเปลือกหุมสีดํา จัดเปนพวก albuminous seed โดยมีเยื่อ albumin บุอยูภายในเปนที่เก็บสะสมพวกน้าํมันและสารพวก curcin สวนของ endosperm และ embryo มีสีขาว ขนาดของเมล็ดมีความยาวเฉลี่ยประมาณ 1.94 เซนติเมตร มีขนาดเสนผานศูนยกลางเฉลี่ยประมาณ 1.16 เซนติเมตร เมล็ดแตละเมล็ดมีน้ําหนักเฉลี่ยประมาณ 0.64 กรัม เมล็ดสบูดําไมมีการพักตัว (ประยูร, 2529)

น้ํายาง

มีลักษณะใส ไมมสีี พบมากในสวนของลาํตนออนและกานใบ ลําตนแกพบยาง เฉพาะที่เปลือกเทานัน้ (ประยูร, 2529) การปลูกและการขยายพันธุ

สบูดําสามารถปลูกได 2 วิธ ีคือ

1. ใชกิ่งชํา โดยการตัดกิ่งที่มีสีเขียวปนน้ําตาลเล็กนอย ซึ่งเปนกิ่งออนถึงแก มีตาประมาณ 3-5 ตา หรือความยาวประมาณ 5-7 เซนติเมตร เสนผานศูนยกลางไมควรเกิน 1-1.5 เซนติเมตร ชําในถุงพลาสติกที่มีทราย 1 สวน ผสมขี้เถาแกลบ 1 สวน หรือทราย 5 สวน ขีเ้ถาแกลบ 5 สวน กากสบูดาํ 1 สวน และหญาแหง 1 สวน ชําไวประมาณ 1 เดอืนกอนฝนตก การปลูกวิธีนี้จะใชเวลา 4 เดือน จะเริ่มออกดอก ระยะเวลาจากออกดอกจนถึงเมล็ดแกจนมีสีดําจะกินเวลา 60-90 วัน ซึ่งขึ้นกับสภาพภูมอิากาศ ถาอากาศรอนจะทําใหแกเร็วขึ้น

2. การใชเมลด็ เมล็ดสบูดําไมมีการพักตัว สามารถปลูกไดทันที การปลูกโดยใชเมล็ดจะเก็บ

ผลไดเมื่ออายุ 1 ป ระยะของการปลูก 1x0.5 หรือ 1x1 เมตร ถาเปนดินเลว และระยะปลูก 1.5x1 หรอื 2x1 เมตร

ถาเปนดินดี (ประยูร, 2529)

ประโยชน

1. ใชปลูกตามรั้วบานเรือน เพื่อปองกันสัตวบุกรุกได เนื่องจากตนสบูดํามีสารพิษ hydrocyanic acid , curcin และมีกล่ินเหม็นเขียว

2. ปลูกคลุมบริเวณดินทราย เพื่อรักษาความชุมชื้นและเปนแนวกันไฟ 3. ในตางประเทศตนสบูดําเปนที่อยูอาศัยของแมลงจําพวกหนึ่งคลายครั่งซึ่งมักจะสรางชันขึ้น

ที่ใบ แลวเก็บเอาชันไปทําน้ํามันขัดเงา 4. สรรพคุณทางสมุนไพร ใชใบสดแกเคล็ดขัดยอกปวดบวม ฟกช้ํา โรคผิวหนัง ผ่ืนคัน

กระดูกหัก ยางของใบใชรักษาโรคปากนกกระจอก หามเลือด แกปวดฟน 5. ในดานอุตสาหกรรม ใชประโยชนเปนน้ํามันหลอล่ืน สบู เทียนไข และใชเปนน้ํามันเชื้อเพลิง

แทนน้ํามันโซลา (ประยูร, 2529)

ลายพิมพดีเอน็เอ ( DNA fingerprint )

ในอดีตถึงปจจบุัน การศึกษาความหลากหลายของสิ่งมีชีวติ จะทําการศกึษาจากอนุกรมวิธาน การเปรียบเทียบทางกายวิภาค (anatomy) สัณฐานวิทยา (morphology) การศึกษาเอมบริโอ (embryo) และสรีรวิทยา (physiology) ซึ่งเปนวิธีที่ใชกนัมานานและยังคงไดผลดี แตบางครั้งก็เกิดความผิดพลาดได ในกรณีที่สายพันธุที่ทดสอบมีความใกลเคียงกันทางพันธุกรรม ซึ่งในปจจบุันก็ไดมีการนําวิธีการ

วิเคราะหในระดับโมเลกุล โดยใชเครื่องหมายโมเลกุล (molecular marker) โดยจะแสดงความแตกตางหรือโพลีมอรฟซึม (polymorphism) ในระดับโปรตีนและดีเอ็นเอ (วาริน, 2545)

ลายพิมพดีเอ็นเอ หรือ DNA fingerprint คือ การตรวจสอบลักษณะทางพันธุกรรม โดยการสรางลายพิมพดีเอ็นเอ เพื่อบอกความแตกตางของสิ่งมีชีวิตในแตละชนิดการศึกษาลายพมิพดีเอ็นเอเปนวิธีที่นิยมนํามาใชในการจําแนกหรือตรวจสอบสิ่งมีชีวิตตาง ๆ และยังสามารถนํามาประยุกตใชในการศึกษาวิวัฒนาการ ตรวจสอบความสัมพนัธทางสายเลือด และพิสูจนบคุคล การศึกษาลายพิมพดีเอน็เอ จะถูกแบงออกเปน

1. การตรวจลายพิมพดีเอ็นเอโดยวิธีไฮบริไดเซชั่น (hybridization–base DNA

figerprinting) 2. การตรวจลายพิมพดีเอ็นเอโดยวิธี PCR ( PCR–base DNA figerprinting) (วาริน,

2545)

1. การตรวจลายพิมพดีเอ็นเอโดย วิธีไฮบริไดเซชัน่

คือ การนําดีเอน็เอที่สกัดจากเซลลมาตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ แลวแยกขนาดดีเอ็นเอดวยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีส จากนั้นยายดีเอ็นเอลงสูแผนฟลเตอร แลวไฮบริไดซกับโพรบทีต่ิดฉลากดวยสารกัมมันตรังสีหรือสารปลอดรังสี ตรวจสอบผลที่เกิดขึ้น โดยจะปรากฏแถบที่มีลักษณะเฉพาะในแตละพนัธุ (วาริน, 2545) เทคนิค Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) เปนเคร่ืองหมายดีเอ็นเอที่ใชในการพัฒนาแผนที่ทางพันธุกรรม (genetic map) ขั้นตอนของการทํา RFLP จะเริ่มจากการตัดดีเอ็นเอดวยเอนไซมตดัจําเพาะ แลวแยกขนาดของชิ้นดีเอ็นเอ ดวยวิธอีิเล็กโทรโฟรีซีส หลังจากนั้นแยกดีเอ็นเอจากแผนเจลมาไวบนแผนเมมเบรน แลวใชโพรบหรือดีเอน็เอตรวจสอบที่ติดฉลากสําหรับติดตาม เพื่อบอกความแตกตางของจีโนม ความแตกตางของชิ้นสวนดีเอ็นเอที่ผานการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะของเทคนิค RFLP เกิดจากดีเอ็นเอมีการเปลี่ยนลําดับเบสตางไปจากเดิม โดยมสีาเหตุเนื่องมาจาก

1. เกิด point mutation ทําใหตําแหนงจดจําของเอนไซมหายไปหรือเพิ่มขึ้นมา 2. เกิดการเพิ่มขึ้นหรือขาดหายไปของดีเอ็นเอบางสวนในบริเวณที่อยูระหวาง

ตําแหนงจดจําของเอนไซม มผีลใหชิ้นดีเอ็นเอที่ตัดไดมีขนาดตางไปจากเดิม

3. เกิดการหายไปของดีเอ็นเอในสวนที่มีตําแหนงจดจําของเอนไซม ซึ่งมผีลทําใหตําแหนงจดจําหายไป

4. เกิดการเรียงตัวใหมของดีเอ็นเอ (DNA rearrangement) (วาริน, 2545; มะลิวัลย, 2546)

จากสาเหตุดังกลาวที่ทําใหขนาดของชิ้นดีเอ็นเอที่ผานการตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะเปล่ียนแปลงไปทําใหเกิดโพลิมอรฟซึ่มที่สามารถนําไปใชประโยชนได โดย RFLP marker มีประโยชนหลายอยางในทางพันธุศาสตร การทําแผนที่พันธุกรรม การศึกษาความหลากหลายของสิ่งมีชีวิต และ การปรับปรุงพันธุ เปนตน ซึ่งดีกวาการใช morphological marker เพราะ RFLP marker ไมขึ้นกับสภาพแวดลอม และการขมของยีนแบบใด ๆ และไมขึ้นกับการแสดงออกของยีนในระยะตาง ๆ ของการพัฒนาของสิ่งมีชีวิตและเนื้อเยื่อ ในทางตรงกันขาม RFLP ก็มีขอจํากัดในเรื่องความบริสุทธิของดีเอ็นเอที่จะตองบริสุทธิมาก ใชโพรบ (probe) และเอนไซม เปนจํานวนมากเพื่อที่จะศึกษา genetic distance และการตรวจสอบโพลิมอรฟซึ่ม จะตองใชเวลาและคาใชจายที่สูง (วาริน, 2545; มะลิวัลย, 2546)

2. การตรวจลายพิมพดีเอ็นเอโดยวิธี PCR (PCR-base DNA fingerprinting)

PCR หรือ polymerase chain reaction คือ การเพิ่มปริมาณชิ้นสวนดีเอ็นเอเฉพาะสวนเพื่อเปนประโยชนในการตรวจสอบความแตกตางของขนาดดีเอ็นเอ โดยในปฏกิิริยา PCR จะมีองคประกอบ ดังนี้ ดีเอ็นเอตนแบบ นิวคลีโอไทด 4 ชนิด บัฟเฟอร และ เอนไซม Taq DNA polymerase มีการทําปฏิกิริยาซ้ํา ๆ กันหลายรอบเพื่อเปนการเพิ่มปริมาณของดีเอ็นเอ มีการใชไพรเมอร 2 ชนิด โดยตองทราบลําดับเบสของดีเอ็นเอเปาหมายเสยีกอน เพื่อเปนขอมูลในการสังเคราะหไพรเมอร ในการทําปฏิกริิยา PCR ในแตละรอบจะประกอบดวย 3 ขั้นตอน ไดแก

1. denaturing ทําใหดีเอ็นเอสายคูแยกเปนสายเดี่ยว โดยเกิดที่อุณหภูมิสูงประมาณ 90 - 95oซ.

2. annealing ไพรเมอร 2 สาย เขาไปจบักับคูสมบนดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่เปนตนแบบ เกิดที่อุณหภูมิ 35 - 60 oซ.

3. extension การตอลําดับนิวคลีโอไทปเขาที่ปลาย 3 'OH ของไพรเมอรโดยใชเอนไซม Taq DNA polymerase ซึ่งตองการอุณหภูมิพอเหมาะที่ 72 oซ.

เมื่อทําซ้ําจํานวนหลายรอบทําใหมีการเพิ่มดีเอ็นเอจากเดิมไดอยางทวีคูณแบบ exponential โดยมีจํานวน PCR product ไดเทากับ 2 n (n = จํานวนรอบ) ซึ่งวิธี PCR มหีลายเทคนิคโดยดัดแปลงใหเหมาะสมกับความตองการ (วนิิตชาญ, 2540; วาริน, 2545)

2.1 เทคนิค Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

RAPD เปนเทคนิคที่ดัดแปลงมาจากเทคนิค PCR โดยที่หลักการของ RAPD จะคลายกับปฏิกิริยา PCR คือ การทําใหเสนดีเอ็นเอเปาหมายแยกเปนเสนเดี่ยว แลวใหไพรเมอรเขาไปเกาะตรงบริเวณที่เปนคูสมกัน โดยในขั้นตอน annealing ของ RAPD จะใชอุณหภมูิต่ํากวา PCR ทั่วไป เนื่องจากไพรเมอรที่ใชมคีวามยาวเพียง 8-10 เบส ซึ่งมี melting temperature ต่ําประมาณ 35 -36 oซ. และเอนไซม Taq DNA polymerase ก็จะนํานิวคลีโอไทดที่เปนคูสมกับดีเอ็นเอตนแบบมาตอจนเปนเสนยาว เกิดเปนเสนดีเอ็นเอเสนใหมเกิดขึ้น ตอจากนั้นก็จะเกิดปฏิกิริยาลูกโซหลาย ๆ รอบ ซึ่งจาํนวนรอบของการเกิดปฏิกิริยาก็มีผลตอความเขมขนของดีเอ็นเอ ผลผลิตโดยทั่วไปของปฏิกิริยา RAPD จะเพิ่มขึ้นในขั้นตอนกอนและหลังการเกิดปฏิกิริยาจริง 1 รอบ โดยเพิ่มขึ้นในขั้นตอน denature และ extension จนดีเอ็นเอเสนใหมมีปริมาณมากพอจนสามารถมองเห็นไดเมื่อยอมสี (วินิตชาญ, 2540; วาริน, 2545; มะลิวัลย, 2546; Welsh and Meclelland, 1990; Willams et al., 1990) ตารางที่1 ความแตกตางของปฏิกิริยาแบบ RAPD กับปฏิกริิยาแบบ PCR RAPD PCR ชนิดไพรเมอร ใชไพรเมอรที่มขีนาดสั้น ๆ

ประมาณ 8-10 เบส เพียงชนิดเดียว

ไพรเมอรสองชนิดที่มีความเฉพาะเจาะจงกับบริเวณที่ตองการ ความยาวประมาณ 18-25 เบส

อุณหภูมิ annealing ต่ําประมาณ 35-38 0ซ. ขึ้นกับ % GC content ของ primer ประมาณ 50-650ซ.

การเกาะกับบริเวณเปาหมาย แบบสุมทั้ง genome แบบเฉพาะเจาะจงกับบริเวณที่ออกแบบไพรเมอรมา

การเพิ่มปริมาณเสนดีเอ็นเอ ผลผลิตมากชิ้นโดยทั่วไปประมาณ 8-10 ชิ้นที่สามารถเห็นไดชัดเจน ขึ้นกับขนาดของ genome

ปรกติจะมีนอยชิ้น ขึ้นกับชนิดของไพรเมอร

ปฏิกิริยา RAPD จะประกอบดวย primer โดยที่ไพรเมอรของ RAPD จะเปนไพรเมอรแบบสุม ทําใหไมตองทราบขอมูลเกี่ยวกับลําดับเบสของดีเอ็นเอเปาหมาย ไพรเมอรที่ใชจะมีความยาวประมาณ 10 นิวคลีโอไทด เนื่องจากไพรเมอรยิ่งมีขนาดสั้นมาก โอกาสที่จะสามารถเกาะกับเสนดีเอ็นเอตนแบบก็เปนไปไดมาก ทําใหไดเสนดีเอ็นเอจํานวนมาก และใชเพียง 1 ไพรเมอร โดยควรจะม ี% GC content อยางนอย 50 % และมี inverted repeat ภายในนอย (วินิตชาญ, 2540; Welsh and Meclelland, 1990; Willams et al., 1990) DNA template ดีเอนเอที่ใชตองเปนดีเอ็นเอที่สะอาด ไมมีส่ิงเจือปนมากนัก เพราะถาดีเอ็นเอมีการปนเปอนของสารอื่น เชน โพลีแซคคารไรด หรือสารประเภทฟนอลิค ก็จะทําใหรูปแบบของ RAPD ไมชัดเจน ซึ่งจะสงผลทําใหการแปลผลมีความคลาดเคลื่อนได และดีเอ็นเอตองไมแตกหัก (sheered DNA) หรือ degrade เพราะจะมผีลตอการทําปฏิกิริยาซ้ํา และในขณะเดียวกันความเขมขนของดีเอ็นเอก็มีความสําคัญในการเกิดปฏิกิริยา โดยปรกติจะเจือจางดีเอ็นเอ ใหมีความเขมขนประมาณ 5 นาโนกรัมตอไมโครลิตร จึงจะใหผลดีและมีความเขมขนสุดทายในปฏิกิริยาประมาณ 10-20 นาโนกรัมตอปฏิกิริยา เพราะถามากเกินไปจะทําใหรูปแบบ RAPD เปนปน แตถานอยเกินไปก็จะไมสามารถทําซ้าํได (มะลิวัลย, 2546; Welsh and Meclelland, 1990; Willams et al., 1990) PCR buffer ที่ใชในปฏิกิริยา PCR เพื่อเปนตัวปรับสภาพสารละลายที่ทําปฏิกริิยาใหเหมาะสม เพื่อท่ีเอนไซมจะไดทํางานไดอยางเหมาะสม โดย buffer จะประกอบดวย Tris-Cl pH 8.3 ความเขมขน 100 mM, 500mM KCl , 0.01%gelatin ซึ่ง buffer จะมีความเขมขนเปน 10 เทาของปฏิกิริยาปรกติ (Welsh and Meclelland, 1990; Willams et al., 1990) MgCl2 โดยที่บางชนิดจะผสมรวมกบับัฟเฟอร หรืออาจจะแยกหลอดตางหากเพื่อผสมทีหลัง โดยปรกติ MgCl2 ควรจะมีความเขมขนประมาณ 2 - 2.5 mM ตอปฏิกิริยา ซึ่งความเขมขนของ MgCl2

จะมีผลตอการเกาะของไพรเมอรบนเสนดีเอ็นเอตนแบบ ในสภาวะที่ความเขมขนของ MgCl2 สูงและสภาพความเขมงวดต่ํา (stringency) จะทาํใหเกิดการจับคูที่ผิดพลาด (miss-matching) ระหวางไพรเมอรกับดีเอ็นเอตนแบบ (มะลิวัลย, 2546; Welsh and Meclelland, 1990; Willams et al., 1990) Nucleotide เบสเปนสวนที่เอนไซม Taq DNA polymerase จะนําไปตอกับไพรเมอรเพื่อสรางเปนเสนดีเอ็นเอเสนใหม เบสจะอยูในรูป deoxynucleotide triphosphate (dNTP) ประกอบดวยเบส 4 ชนิด คือ dATP, dCTP, dGTP และ dTTP (Welsh and Meclelland, 1990; Willams et al., 1990)

เอนไซม Taq DNA polymerase โดยทั่วไปประสิทธิภาพของการเกิดปฏิกิริยา PCR จะขึ้นกับชนิดของเอนไซมเปนสําคัญ แตอยางไรก็ตามคณุภาพของเอนไซมก็ขึ้นกับบริษัทที่จําหนายดวย เนื่องจากเอนไซมมาจากตางแหลงมักใหรูปแบบของดีเอ็นเอที่ตางกัน เอนไซม Taq DNA polymerase สกัดมาจากแบคทีเรีย Thermus aquaticus ซึ่งเปนปจจัยทีสํ่าคัญในการเพิ่มปริมาณดีเอน็เอ (มะลิวัลย, 2546; Welsh and Meclelland, 1990; Willams et al., 1990) โปรแกรมการสังเคราะหดีเอ็นเอและเครือ่ง Thermal Cycler ควรใชเครื่องที่มีประสิทธิภาพในการใหอุณหภูมิที่ทั่วถึงทุก ๆ หลอดเหมือนกัน และถาจะทําปฏิกิริยาซ้าํควรจะใชเครื่องเดียวกัน (มะลิวัลย, 2546) การตรวจผล สามารถนํามาแยกไดงายดวยเทคนิคอิเล็กโทรโฟรีซีส และยอมดวยเอธิเดียมโบรไมด แลวสองดภูายใตแสงอัลตราไวโอเลต (Welsh and Meclelland, 1990; Willams et al., 1990) polymorphism ของ RAPD เปนผลมาจากการที่ไพรเมอรเกาะในตําแหนงที่ตางกันทําใหไดจํานวนและขนาดของชิ้นดีเอ็นเอที่เปล่ียนไป หรือเกิดจากดีเอ็นเอสวนที่ไพรเมอรเกาะไดหายไป หรือมีการแทนที่ หรือเปลียนแปลงเบสบริเวณที่ไพรเมอรเกาะจึงไมเกิดแถบดีเอ็นเอ หรือเกิดการหายไปหรือเพิ่มขึ้นมาของดีเอน็เอบริเวณที่อยูระหวางตําแหนงของไพรเมอร 2 ตําแหนง ทําใหขนาดของชิ้นดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นมีขนาดเปลี่ยนแปลงไป โดยจะแสดงผลในลักษณะการมีหรือไมมีแถบดีเอ็นเอที่ตําแหนงตาง ๆ มากกวาการเปลี่ยนขนาดของแถบดีเอ็นเอ (วาริน, 2545) ขอดีของเทคนิค RAPD คือ ทาํไดงาย สะดวก รวดเร็ว ใชดีเอ็นเอในปริมาณนอย ไมจําเปนตองรูลําดับเบสของไพรเมอร และดเีอ็นเอที่จะศึกษา และไมตองใชสารกัมมันตรังสี (วินิตชาญ, 2540; วาริน, 2545; มะลิวัลย, 2546) ขอเสียของเทคนิค RAPD คือ เมื่อทําการทดลองซ้ําบางครั้งไดผลที่ตางไปจากเดิม เนื่องจากเทคนิค RAPD มีความไวตอการเปลี่ยนแปลงของสภาวะการทดลองไดงาย (วาริน, 2545; มะลิวัลย, 2546)

เทคนิค RAPD ถูกนาํมาใชประโยชนในดานตาง ๆ คือ 1. การสรางแผนที่โครโมโซม 2. ศึกษาพันธุประวัติ และวิวฒันาการ

3. การจําแนกสายพันธุ 4. การทํา DNA fingerprinting 5. การวางตําแหนงยีน 6. การปรับปรุงพนัธุพืช 7. การศึกษาพันธศุาสตรประชากร (วินิตชาญ, 2540; วาริน, 2545; Welsh and Meclelland,

1990; Willams et al., 1990) วินิตชาญ (2540) ทําการสํารวจและแยกความแตกตางของหญาแฝกในประเทศไทย 10 สาย

พันธุ โดยเทคนิค RAPD โดยเตรียมดีเอ็นเอจากใบออนของหญาแฝกดวยวิธีที่ดัดแปลงจาก Edward และคณะ (1991) (อางโดยวินิตชาญ, 2540) ซึ่งสามารถสกัดดีเอ็นเอจากใบพืชไดประมาณ 50 ไมโครกรัมตอกรัมพืช จากนัน้นําดีเอ็นเอมาเพิ่มปริมาณแบบสุมโดยเทคนิค PCR แบบ RAPD พบวามี ไพรเมอร 12 ชนิดจาก 114 ชนิด ที่ใหแผนที่ดีเอ็นเอที่มีความแตกตางกันหลายรูปแบบ (polymorphism) และเมือ่นํารูปแบบที่แตกตางกันมาใหคะแนนและวิเคราะหโดยใชโปรแกรมคอมพวิเตอร PAUP สามารถแบงหญาแฝกออกเปน 2 กลุมใหม คือ กลุมของหญาแฝกหอม และกลุมของหญาแฝกดอน

มะลิวัลย (2546) ใชลักษณะทางสัณฐานวิทยา ลักษณะทางกายวิภาค และเทคนิค RAPD ใน

การจัดกลุมของหมอน 43 สายพันธุ พบวาลักษณะทางสัณฐานวิทยาสามารถจัดกลุมหมอนไดทั้งหมด 10 กลุม สวนลักษณะทางกายวิภาคสามารถจัดกลุมหมอนไดทั้งหมด 7 กลุม และจากการวิเคราะหผลจากการศึกษา RAPD พบวาจากการใชไพรเมอร 16 ไพรเมอรใหกลุมของแถบที่แบงตามขนาดดีเอ็นเอไดทั้งสิ้น 269 แถบ คาเฉลี่ย 16.8 แถบตอไพรเมอร แถบดีเอ็นเอที่พบมากมีขนาด 200–1,400 คูเบส และจากการวิเคราะหกลุมโดยใชลักษณะรูปแบบดีเอ็นเอจากเทคนิค RAPD โดยใชโปรแกรม NTSYSpc ทําใหสามารถแบงหมอนออกเปน 5 กลุมใหญ โดยที่หมอนปา หมอนกินผลจะถูกแยกเปนกลุมเฉพาะ 2 กลุม เพราะสามารถพบแถบดเีอ็นเอเฉพาะใน 10 ไพรเมอร

Chowdhury และ Slinkard. (1999) ไดทําการเชื่อมตอแผนที่ทางพันธุกรรมของ grasspea

(Lathyrus sativus L.; 2n = 14) จากลูกชั่วที่ 2 จํานวน 100 ตนซึ่งไดมาจากการผสมขามระหวางสายพันธุ PI 426891.1.3 กับสายพันธุ PI 283564 C.3.2 และจากการทํา RAPD ทั้งหมด 71 คร้ัง, isozyme 3 ชนิด และลกัษณะทางสัณฐานวิทยา 1 ลักษณะ เพื่อท่ีจะใชในการคัดแยกลูกชั่วที่ 2 มี marker สวนนอย (12%) ซึ่งไมตรงกับ Mendelian ratio (1:2:1 หรือ 3:1) จาก 75 marker จะมี 69 marker (ลักษณะทางสัณฐานวิทยา 1 ลักษณะ, isozyme 3 ชนิด และ 65 RAPD markers) แบงไดเปน 14 linkage ซึ่งครอบคลุม 898 cM คาเฉลี่ยของระยะทางระหวาง 2 marker ที่อยูใกลกันมคีาเทากับ 17.2 cM

Te-chato (2000) ใช RAPD ในการประเมินความแปรปรวนทางพันธุกรรมของแคลลัส 20 ตัวอยาง และ somaclone 8 ตัวอยาง ที่ไดจากการเพาะเลี้ยงใบยอด จากการสุมไพรเมอร 10 ไพรเมอรพบวามี 8 ไพรเมอร ที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอจากตัวอยางได และจากการศกึษา annealing temperature ที่ตางกัน 3 ระดับ คือ 35, 41 และ 51 0ซ. พบวาสภาพที่ดีทีสุ่ดที่เปนผลในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ 3 นาโนกรัมตอไมโครลิตร จากดีเอ็นเอตนแบบ ก็คือ annealing temperature เทากับ 41 oซ. และจาก 8 ไพรเมอรที่ใชทดสอบไมแสดงความแตกตางกนัในแตละ somaclone โดยมี 5–15 รูปแบบเดียว (monomorphism)

สิริภัทรและคณะ (2543) ใชเทคนิค RAPD ในการศึกษาลายพิมพดีเอ็นเอของถั่วเขียวพันธุ

รับรองจํานวน 5 พันธุ ไดแก พันธุ อท.1 อท.2 ชน.36 ชน.60 พล.2 และพันธุของมหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร จํานวน 2 พันธุ ไดแก พันธุ กพส.1 และ กพส.2 โดยใช universal random primer และพบวามีไพรเมอร 3 ชุด ที่สามารถแสดงลายพิมพ็ดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงกับพนัธุถั่วเขียวพันธุรับรองทั้ง 5 พันธุ และสามารถแยกกลุมถั่วเขียวออกเปน 2 กลุมชัดเจน คือ กลุมถั่วเขียวผิวมัน และถั่วเขียวผิวดํา และจากการศึกษาความใกลเคียงทางพันธุกรรมระหวางพันธุพบวา พันธุ กพส.1 กพส.2 มีพันธุกรรมใกลเคียงกับพันธุ อท.1 ชน.36 และ ชน. 60 มาก

วันเพ็ญ (2543) ตรวจลายพมิพดีเอ็นเอ (DNA fingerprint) ของมันสําปะหลัง ดวยเทคนิค

RAPD โดยใชไพรเมอรที่มีลําดับเบส 5’ CCG CCC AAA C 3’ สามารถจาํแนกสายพันธุมันสําปะหลัง ไดเปน 2 กลุมหลัก คือ กลุมที่ 1 พันธุระยอง 5 และเกษตรศาสตร 60 กลุมที่ 2 พันธุระยอง 2 หานาที และ MKUL 36-Y002 และพบวาพันธุระยอง 2 และ MKUL 36-Y002 มีความสัมพันธทางพนัธุกรรมใกลชดิกัน

2.2 เทคนิค Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)

เทคนิคนี้เปนวิธีการสรางลายพิมพดีเอ็นเอที่รวมเอาวิธ ี RFLP และ RAPD เขาไวดวยกนั ทําไดโดยการสกัดดีเอ็นเอจากเซลลและตัดดวยเอนไซมตัดจําเพาะ แลวเชื่อมตอ adepter เขาที่ปลายทั้ง 2 ของชิ้นดีเอ็นเอเพื่อเปนสวนสําหรับใหไพรเมอรมาเกาะ และสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอไดโดยไพรเมอรที่สังเคราะหขึ้นนี้มีลําดับเบสเหมือนกันกับสวนของ adepter สวนปลาย 3 ' ของไพรเมอรมีลําดับเบสที่เปนตําแหนงจดจําของเอนไซมตัดจําเพาะและเพิม่เบสอีก 2-3 เบสเขาที่ปลาย 3 ' ของไพรเมอร เพื่อใหเกิดการเลือกจับไดเฉพาะชิ้นดีเอ็นเอที่มีเบสเปนคูสมกันเทานั้น ดังนั้นชิ้นดีเอ็นเอที่สามารถเพิม่ปริมาณไดจะมีเฉพาะชิ้นดีเอน็เอที่มีลําดับเบสสวนที่ตัดกับบริเวณจดจาํของเอนไซมเขาคูไดกับไพรเมอรที่เลือกใชได

เทานั้น วิเคราะหแถบดีเอ็นเอที่ไดจากการสังเคราะหโดย polyacrylamine gel electrophoresis (วาริน, 2545) ขอดีของ AFLP คือ ไมตองทราบขอมูลลําดับเบสของดีเอ็นเอ ทําไดรวดเร็ว ใชปริมาณดเีอ็นเอเร่ิมตนจํานวนนอย ทําใหเกิดโพลีมอรฟซึมจํานวนมาก และใชกบัส่ิงมีชวีิตที่มีจีโนมขนาดใดก็ได ขอเสียของ AFLP คือ คาใชจายสูง ตองการดีเอ็นเอที่มีความบริสุทธิ์สูง วิธีการคอนขางซับซอนซึ่งเปนการยากที่จะปองกันขอผิดพลาดที่จะเกิดขึ้นในแตละขั้นตอน (วาริน, 2545; มะลิวัลย, 2546)