(19) *DE102017219565A120190509*

(10) DE 10 2017 219 565 A1 2019.05.09

(12) Offenlegungsschrift

(21) Aktenzeichen: 10 2017 219 565.7(22) Anmeldetag: 03.11.2017(43) Offenlegungstag: 09.05.2019

(51) Int Cl.: G01N 33/48 (2006.01)G01N 15/14 (2006.01)G01N 21/64 (2006.01)G01N 33/533 (2006.01)

(71) Anmelder:Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, 17489Greifswald, DE

(74) Vertreter:HOFFMANN - EITLE Patent- und RechtsanwältePartmbB, 81925 München, DE

(72) Erfinder:Otto, Oliver, Dr., 17489 Greifswald, DE; Aurich,Konstanze, Dr. rer. nat., 17489 Greifswald, DE;Greinacher, Andreas, Prof. Dr. med., 18516Süderholz, DE

(56) Ermittelter Stand der Technik:

CZERWINSKA, Justyna, et al. Red blood cellaging during storage, studied using opticaltweezers experiment. Cellular and MolecularBioengineering, 2015, 8. Jg., Nr. 2, S. 258-266.

GUZNICZAK, Ewa, et al. High-throughputassessment of mechanical properties of stemcell derived red blood cells, toward cellulardownstream processing. Scientific reports, 2017,7. Jg., Nr. 1, S. 14457.

MATTHEWS, Kerryn, et al. Microfluidicdeformability analysis of the red cell storagelesion. Journal of biomechanics, 2015, 48. Jg., Nr.15, S. 4065-4072.

OTTO, Oliver [u.a.]: Real-time deformabilitycytometry: on-the-fly cell mechanicalphenotyping. In: Nature methods. 2015,Bd. 12, H. 3, S. 199-202. ISSN 1548-7105 (E); 1548-7091 (P). DOI: 10.1038/nmeth.3281.Bibliographieinformationen ermittelt über: http://www.nature.com/nmeth/journal/v12/n3/abs/nmeth.3281.html [abgerufen am 09.02.2017].

RELEVY, Hanna, et al. Blood banking–inducedalteration of red blood cell flow properties.Transfusion, 2008, 48. Jg., Nr. 1, S. 136-146.

Prüfungsantrag gemäß § 44 PatG ist gestellt.

Die folgenden Angaben sind den vom Anmelder eingereichten Unterlagen entnommen.

(54) Bezeichnung: Verfahren zur Qualitätskontrolle von zellulären Blutprodukten

(57) Zusammenfassung: Die vorliegende Erfindung betrifftein Verfahren zur Qualitätskontrolle von zellulären Produk-ten mit folgenden Schritten:- Bestimmen einer mechanischen Eigenschaft von Zellen,die in den zellulären Blutprodukten enthalten sind,- Vergleichen der mechanischen Eigenschaft mit einer vor-her festgelegten Referenz und- Entscheiden, basierend zumindest in Teilen auf dem Er-gebnis des Vergleichs, ob das zelluläre Blutprodukt eine er-forderliche Qualität hat.

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Beschreibung

Technisches Gebiet

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfah-ren zur Qualitätskontrolle von zellulären Blutproduk-ten.

Stand der Technik

[0002] Blutprodukte sind Arzneimittel, die aus demVollblut von Spendern im Rahmen einer Blutspen-de gewonnen werden. Um ihre gleichbleibend hoheQualität zu gewährleisten, sind laut Arzneimittelge-setz sowie den Richtlinien der Bundesärztekammerzur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen undzur Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapie-Richtlinien) regelmäßige Qualitätskontrollen durch-zuführen. Das Arzneimittelgesetz enthält Bestimmun-gen bezüglich der Herstellung und Prüfung von Arz-neimitteln allgemein. In den Hämotherapierichtlini-en werden Herstellung und Prüfung von Blutproduk-ten, z. B. von Thrombozytenkonzentraten, welchezur Prophylaxe und zur Behandlung von Blutungeneingesetzt werden näher definiert. In Deutschlandmuss monatlich ein bestimmter Anteil aller hergestell-ten Blutprodukte mittels verschiedener in-vitro-Funk-tionsuntersuchungen im Rahmen der Stichproben-qualitätskontrolle untersucht werden.

[0003] Bei zellulären Blutprodukten (Erythrozyten-konzentraten und Thrombozytenkonzentraten, aberauch Stammzellpräparaten) umfasst die Qualitäts-kontrolle unter anderem die Funktionsuntersuchungder enthaltenen Zellen. Verfahren, die dafür der-zeit verwendet werden, sind z. B. die Bestimmungder Aggregationsfähigkeit von Thrombozyten mittelsder Transmissionslichtaggregometrie oder die Be-stimmung der Aktivierungsfähigkeit von Thrombozy-ten durch die Analyse von bestimmten Oberflächen-markern in der Durchflusszytometrie. Erythrozyten inErythrozytenkonzentraten werden z. B. hinsichtlichihrer Hämoglobinfreisetzung oder ihres Kaliumstoff-wechsels untersucht.

[0004] Blutprodukte werden ständig weiterentwi-ckelt. Eine große Rolle spielt hierbei die Einführungvon Verfahren zur Pathogeninaktivierung, durch diePathogene wie z. B. enthaltene Bakterien oder ande-re Keime inaktiviert werden können, und auch verän-derte Lagerungsbedingungen, durch welche die Halt-barkeit der Blutprodukte verlängert werden kann. Umfür derartig veränderte Blutprodukte eine Zulassungdurch die zuständige Arzneimitteloberbehörde zu er-langen, sind jedoch aufwendige Validierungsunter-suchungen notwendig, die derzeit mit den oben be-schriebenen Verfahren zur Funktionsuntersuchungder enthaltenen Zellen durchgeführt werden.

[0005] Ein wichtiger Punkt ergibt sich hierbei daraus,dass es gewünscht wird, die derzeit sehr kurze Lage-rungsdauer von Thrombozytenkonzentraten zu erhö-hen. Solche Thrombozytenkonzentrate werden mo-mentan bei Raumtemperatur (d. h. zwischen 20 und24°C) gelagert. Das begünstigt eine Vermehrung voneventuell vorhandenen Bakterien in solchen Blutkon-serven. Die Transfusion einer bakteriell kontaminier-ten Konserve ist jedoch in jedem Fall zu vermeiden,da dies eine Sepsis als schwerwiegende Komplikati-on auslösen kann.

[0006] Um ein solches unerwünschtes Ergebniszu minimieren, wurde seit 2008 die Lagerzeit vonThrombozytenkonzentraten auf vier Tage ab demHerstellungstag (d. h. ab der Blutspende) begrenzt.Eine solche kurze Lagerungszeit führt jedoch zu gro-ßen logistischen Problemen, da die Herstellung vonThrombozytenkonzentraten im Voraus nur bedingtmöglich ist.

[0007] Aus diesen Gründen wurden verschiedeneAnsätze zur Verlängerung der Haltbarkeit verfolgt.Unter anderem wurde eine Lagerung der Thrombo-zytenkonzentrate bei 2 bis 6 °C, Verfahren zur In-aktivierung von Pathogenen oder aber auch Verfah-ren zur Detektion von Pathogenen zur Anwendungals Screening-Verfahren bei jedem Thrombozyten-konzentrat in Betracht gezogen.

Darstellung der Erfindung

[0008] Ausgehend von dem vorher Genannten, be-steht ein Bedürfnis dahingehend, ein effizientes,gleichzeitig aber auch empfindliches Verfahren zurQualitätskontrolle von zellulären Blutprodukten be-reitzustellen.

[0009] Ein Grundgedanke der vorliegenden Erfin-dung ist es, den Effekt zu nutzen, dass die Änderun-gen der Lagerbedingungen oder der Pathogenkon-tamination in Thrombozytenkonzentraten, aber auchin anderen zellulären Blutprodukten, Einfluss auf dasZytoskelett dieser Zellen haben. Dies wurde bereitsmehrfach nachgewiesen (Berger, G. et al., P-Selec-tin and platelet clearance. Blood, 92, 4446-52 (1998),Holme, S. et al., Studies on platelets exposed to orstored at temperatures below 20 degrees C or above24 degrees C. Transfusion, 37, 5-11 (1997), Milford,E. et al., Comprehensive review of platelet storagemethods for use in the treatment of active hemorrha-ge. Transfusion, 56 Suppl. 2, 140-8 (2016)).

[0010] Die derzeit verwendeten Verfahren zur Quali-tätskontrolle geben keine Auskunft über Veränderun-gen des Zytoskeletts der Zelle. Solche Veränderun-gen können im Moment nur aufwendig durch immun-fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen aufge-zeigt werden, wobei mit Fluoreszenzfarbstoffen mar-kierte Antikörper, die gegen bestimmte Strukturen der

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Zellmembran oder des Zytoskeletts, wie z. B. Tubulingerichtet sind, dazu verwendet werden, Ausprägungund Form dieser Strukturen sichtbar zu machen. DenErfindern ist jedoch aufgefallen, dass diese Verfah-ren sehr zeitaufwändig und teuer sind, weshalb siesich nicht für eine Anwendung im großen Maßstabeignen. Hierbei ist der hohe Zeitaufwand ein wichti-ger Punkt, da es wichtig ist, die Qualität kurzfristigbestimmen zu können. Insbesondere bei Präparatenmit kurzer Lagerungszeit von weniger als 5 Tagenist eine Qualitätsuntersuchung, die mehrere Tage inAnspruch nimmt, von geringem praktischen Nutzen.Eine wichtige Perspektive der vorgelegten Erfindungist, dass diese Methode eine Qualitätskontrolle beiAusgabe oder kurz vor Ausgabe eines zellulären Blut-produktes ermöglicht, womit Schädigungen des Ein-zelproduktes erkannt werden können. Diese produkt-spezifische Qualitätskontrolle ist derzeit nicht mit denklassischen Methoden der Qualitätssicherung durch-führbar.

[0011] Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, diegenannten Probleme zumindest teilweise zu lindern.

[0012] Die Erfindung wird durch Anspruch 1 defi-niert. In den abhängigen Ansprüchen werden bevor-zugte Ausführungsformen der Erfindung definiert.

[0013] Gemäß Anspruch 1 wird ein Verfahren zurQualitätskontrolle von zellulären Blutprodukten defi-niert. Dieses Verfahren soll feststellen, ob ein be-stimmtes zelluläres Blutprodukt den Anforderungenfür eine medizinische Anwendung genügt. Anders ge-sagt kann überprüft werden, ob ein solches zellulä-res Blutprodukt zur Verwendung für einen Patienten kgeeignet ist. Unter einem zellulären Blutprodukt wirdi.A. ein Produkt verstanden, welches aus den Zel-len hergestellt ist oder diese enthält, die im mensch-lichen Blut vorhanden sind. Das Verfahren kann ana-log auch dazu verwendet werden zelluläre Blutpro-dukte anderer Spezies in gleicher Weise zu untersu-chen und zu beurteilen, z.B. bei Bluttransfusionen inder Veterinärmedizin.

[0014] Das Zytoskelett einer Zelle, insbesondere ei-ner Blutzelle, reagiert empfindlich auf unterschiedli-che Lagerungsbedingungen bzw. auf eine Pathogen-kontamination (siehe z.B. I. Lopez-Vilchez et al., „In-ternalization of Tissue Factor-Rich Microvesicles byPlatelets Occurs Independently of GPIIb-IIIa, and In-volves CD36 Receptor, Serotonin Transporter andCytoskeletal Assembly“, J. Cell Biochem., Vol. 117,Ausgabe 2, 448-457). Jede Veränderung der Zell-Oberflächenrezeptoren erfordert eine Veränderungdes Zytoskeletts, an das diese Rezeptoren gebun-den sind. Deshalb ist eine Untersuchung des Zytos-keletts erfolgversprechend für Verfahren zur Quali-tätskontrolle. Des Weiteren hat das Zytoskelett ei-nen maßgeblichen Einfluss auf die mechanischen Ei-genschaften einer Zelle. Somit kann durch Bestim-

mung der mechanischen Eigenschaften einer Zelleüberprüft werden, wie sich das Zytoskelett verhält.Dies erlaubt Rückschlüsse auf die Zellbiologie derzu untersuchenden Zellen und somit auf die Qualitätdes zellulären Blutprodukts. Daher kann das Bestim-men der mechanischen Eigenschaft von Zellen alszusätzlicher Marker zur Qualitätskontrolle herange-zogen werden. Hierdurch kann die Qualitätskontrol-le von Blutprodukten einfacher und aussagekräftigergestaltet werden.

[0015] Derzeit existieren verschiedene Verfahren,die mechanische Eigenschaften von Zellen bestim-men, die in zellulären Blutprodukten enthalten sind.Dabei kann es sich um eine beliebige mechanischeEigenschaft wie z. B. die Elastizität oder die Visko-sität („Viskoelastizität“) der Zelle handeln, es kön-nen jedoch auch andere mechanische Eigenschaf-ten verwendet werden, solange sie das mechanischeVerhalten der Zelle beschreiben. Bei diesen Verfah-ren wird ein Wert der mechanischen Eigenschaft be-stimmt, d.h. es wird gemessen, „wie groß“ die Elasti-zität bzw. Viskosität ist. Insbesondere ist die Raster-kraftmikroskopie oder das Verwenden eines OpticalStretchers (Guck, J.; et al. (2001). „The Optical Stret-cher: A Novel Laser Tool to Micromanipulate Cells“.Biophys. J. 81 (2): 767-784) geeignet, wobei jedoch,wie später im Detail erläutert werden wird, Echtzeit-verfahren, insbesondere im Rahmen der „Real-TimeDeformability Cytometry“, bevorzugt werden.

[0016] Die bestimmte mechanische Eigenschaft derZellen wird mit einer vorher festgelegten Referenzverglichen. Dies umfasst, dass man eine Verteilungder mechanischen Eigenschaften von allen Zellen indem Blutprodukt bestimmt und dann lediglich die me-chanischen Eigenschaften einer bestimmten Subpo-pulation dieser Zellen mit einem Referenzwert bzw.einer Referenzverteilung vergleicht. Ein solcher Re-ferenzwert bzw. Referenzverteilung beschreibt dastypische mechanische Verhalten des jeweiligen un-tersuchten Zelltyps.

[0017] Das hier vorgestellte Verfahren bestimmt diemechanischen Eigenschaften der Zellen im Rah-men der „Real-time deformability cytometry“. Auf die-se Weise kann eindeutig zwischen den verschiede-nen zellulären Bestandteilen von Blut unterschiedenwerden, weshalb man in der Lage ist, Leukozyten,Thrombozyten oder Erythrozyten selektiv zu untersu-chen.

[0018] Als ein weiterer Schritt wird zumindest teil-weise basierend auf diesem Vergleich entschieden,ob das zelluläre Blutprodukt die erforderliche Quali-tät hat. In diesem eigentlichen Qualitätskontrollschrittwird basierend auf dem Vergleich der mechanischenEigenschaften mit der Referenz eine Entscheidunggetroffen, ob das untersuchte Blutprodukt zur Anwen-dung bei einem Patienten geeignet ist. Dies kann als

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einen weiteren Schritt umfassen, dass das zelluläreBlutprodukt als nicht den Qualitätsanforderungen ge-nügend markiert wird und somit verworfen werdenmuss. Dies kann eine physische Markierung z.B. aufeinem Behälter, der das zelluläre Blutprodukt enthält,umfassen, kann aber auch ein Eintrag in einer Daten-bank, in der die einzelnen Blutprodukte verzeichnetsind, sein.

[0019] Im vorgelegten Verfahren wird die zu unter-suchte Produktprobe mit einer Referenz bzw. mitbekannten Referenzdaten verglichen. Treten Abwei-chungen von der Referenz auf, kann daraus ge-schlossen werden, dass durch Änderungen der me-chanischen Eigenschaften der Zelle auch ihre biologi-schen Eigenschaften beeinflusst sind, was zur Sper-rung des Produkts führt.Der umgekehrte Schritt ist nicht unbedingt der Fall:Aus „korrekten“ mechanischen Eigenschaften derZelle kann nicht bzw. nicht notwendigerweise ge-schlossen werden, dass die Zellen für die Verwen-dung beim Patienten geeignet sind.

[0020] Da zumindest einige Verfahren zum Bestim-men von mechanischen Eigenschaften von Zellenschnell durchführbar sind und eine hohe Qualitätan Daten liefern, können solche Verfahren schnellund effizient umgesetzt werden und sind somit viel-versprechend für den Einsatz in der Qualitätskon-trolle von Blutprodukten in einem PharmazeutischenUnternehmen oder einem transfusionsmedizinischenLabor (Blutbank). Es hat sich gezeigt, dass das RT-DC Verfahren sensitiver auf Veränderungen der Zellereagiert als andere Qualitätskontrollverfahren.

[0021] Das vorgelegte Verfahren ermöglicht auchdie Entscheidung, ob Thrombozytenkonzentrate län-ger als die derzeit vorgeschriebenen 4 Tage verwen-det werden können. Insofern könnten aufwendigeNachweise von Zellfunktionen oder von im Produktenthaltenen Pathogenen entfallen oder zumindestminimiert werden. Außerdem können Veränderungenim Zytoskelett der Zelle schnell erkannt werden, ohneauf die vergleichsweise zeitaufwendige Immunfluo-reszenzmikroskopie zurückgreifen zu müssen.

[0022] Für Thrombozytenkonzentrate sind die Un-terschiede besonders prägnant. Prinzipiell ist es je-doch möglich, das Verfahren auf beliebige anderezelluläre Blutprodukte oder auf beliebige andere Zel-len anzuwenden. Letzteres liegt daran, dass das Zy-toskelett bei menschlichen und tierischen Zellen ausähnlichen Proteinen besteht, die somit ähnlich aufVeränderungen der Umgebung reagieren. Bevorzugtwerden in dem Zusammenhang menschliche Zel-len, auch aufgrund der höheren klinischen bzw. wirt-schaftlichen Relevanz.

[0023] Bevorzugt wird, dass die zellulären Blutpro-dukte humanes Blutplasma als Trägermedium der

Zellen aufweisen und bevorzugt daraus bestehenoder aber dass die zellulären Blutprodukte kein hu-manes Blutplasma in dem Trägermedium aufweisen.Insbesondere die Verwendung von humanem Blut-plasma als Trägermedium ist dahingehend von Vor-teil, dass entsprechende Blutprodukte gut für die Ver-wendung bei menschlichen Patienten geeignet sind.

[0024] Weiterhin wird bevorzugt, dass das zellulä-re Blutprodukt zur Erhöhung der Verträglichkeit desBlutprodukts bestrahlt wird, insbesondere mit Gam-ma-Strahlen, UVA-Licht, UVB-Licht und/oder UVC-Licht. Eine entsprechende Behandlung führt dazu,dass das Blutprodukt eine geringere Gefahr hat eineGraft-versus-host Reaktion auszulösen, was für dieAnwendung von Vorteil ist.Weiterhin wird bevorzugt, dass das zelluläre Blutpro-dukt ferner einem Verfahren zur Verringerung der An-zahl an Pathogenen und/oder einem Verfahren zurVerhinderung der Zellteilung unterzogen wird. Hier-durch kann die Vermehrung von Pathogenen, insbe-sondere von Bakterien und anderen Krankheitserre-gern, minimiert bzw. unterdrückt werden, was für dieQualität des Blutprodukts von Vorteil ist und auch zuweniger Komplikationen bei den Patienten führt, beidenen das Blutprodukt zum Einsatz kommt. Mit sol-chen Verfahren behandelte Blutprodukte können län-ger gelagert werden.

[0025] Besonders bevorzugt wird, dass die mecha-nischen Eigenschaften der Zellen in Echtzeit gemes-sen werden, mittels einer „Real-Time DeformabilityCytometry“-Vorrichtung. Durch das Messen der me-chanischen Eigenschaften in Echtzeit wird eine Be-schleunigung des Verfahrens ermöglicht, die insbe-sondere bei einer klinischen oder industriellen An-wendung hoch relevant ist. Bei der Real-Time Defor-mability Cytometry („RT-DC“) handelt es sich um dasVerfahren, welches z. B. in der WO 2015/024690 A1und in Otto, O. et al., Real-time deformability cyto-metry: on-the-fly cell mechanical phenotyping (12,199-202, 4 Folgeseiten von 202 (2015)) beschriebenwird. Bei RT-DC handelt es sich um ein Verfahrenzur mechanischen Charakterisierung von Zellen mitDurchsatzraten von bis zu 1000 Zellen pro Sekundein Echtzeit. Im Gegensatz zu etablierten Verfahrender Zell- und Molekularbiologie, welche oft auf einerMarkierung der zu messenden Eigenschaften beru-hen (z. B. Durchflusszytometrie bzw. „FACS“) analy-siert RT-DC die intrinsischen Eigenschaften von Zel-len, d.h. es werden keine Markierungen benötigt.

[0026] RT-DC beruht auf dem hydrodynamischenPrinzip der Verformung bewegter Objekte in ei-nem Geschwindigkeitsgradienten. Dabei fließen Zel-len durch einen Kanal von z. B. 15 µm × 15 µm Quer-schnitt. Die Interaktion mit dem parabolischen Fluss-profil führt zu einer Verformung in Abhängigkeit dermechanischen Eigenschaften der Zelle, welche maß-

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geblich durch das Zytoskelett der Zelle beinflusst wer-den.

[0027] Gegenüber herkömmlichen zeitaufwendigenVerfahren, die vorrangig die Zellfunktion und den Zell-metabolismus analysieren, ist RT-DC in der Lage,sehr sensitiv und schnell Veränderungen in den me-chanischen Eigenschaften der Zellen nachzuweisen,um somit Rückschlüsse auf die Zellfunktion und denZellmetabolismus ziehen zu können. Dies prädesti-niert dieses Verfahren für einen Einsatz in der routi-nemäßigen Qualitätskontrolle von zellulären Blutpro-dukten. Dieses Verfahren ist sehr schnell durchführ-bar, ist jedoch auch in der Lage, sehr geringe Unter-schiede zu erkennen, wie dies in den oben genann-ten Publikationen zu RT-DC beschrieben wird.

[0028] Besonders bevorzugt wird, dass die mecha-nische Eigenschaft eine Elastizität und/oder eine Vis-kosität umfasst. Diese beiden Eigenschaften sindvergleichsweise einfach zu messen und sind charak-teristisch für das mechanische Verhalten einer Zelle.Die Zellen werden hierbei in einem isotonischen Me-dium oder Plasma gemessen. Die Temperatur desMediums bzw. Puffers wird so gewählt, dass die Zel-len keinen Schaden nehmen. Die restlichen Parame-ter, insbesondere bei RT-DC die Flussrate, die ge-naue Art des Mediums, die Zellkonzentration in der zumessenden Probe und die Anzahl der zu messendenZellen werden zellspezifisch angepasst, dass aussa-gekräftige Ergebnisse erzielt werden.

[0029] Eine andere, einfachere Messung wäre es,lediglich zu überprüfen, wie stark sich die Zellen ver-formen, ohne hieraus eine Elastizität bzw. Viskositätzu bestimmen. D.h. man würde lediglich eine Verfor-mung (z.B. als Abweichung der Form der Zellen vonder Norm) messen. Eine solche Messung korreliertmit der Steifigkeit der Zelle und erlaubt daher Rück-schlüsse auf deren mechanische Eigenschaften undsomit auf das Verhalten von deren Zytoskelett.

[0030] Hierbei wird insbesondere bevorzugt, dassdas Vergleichen umfasst, dass bestimmt wird, obeine durchschnittliche Elastizität der Zellen einenGrenzwert überschreitet. Ein solcher Vergleich istleicht durchführbar.

[0031] Weiterhin wird die technische Aufgabe durcheine Vorrichtung gelöst, die für das Durchführen desVerfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprü-che ausgestaltet ist. Eine entsprechende Vorrichtunghat die jeweiligen Vorteile, die weiter oben diskutiertwurden.

Figurenliste

Abb. 1 zeigt Scatterplots von bei 20 bis 24 °Cund bei 2-6 °C gelagerten Thrombozyten ausThrombozytenkonzentraten an Tag 1, 4 und 7nach Herstellung.

Abb. 2 zeigt Immunfluoreszenzbilder von bei 20bis 24 °C und bei 2-6 °C gelagerten Thrombozy-ten aus Thrombozytenkonzentraten an Tag 1, 4und 7 nach Herstellung. In den Zellen wurde F-Actin und a-Tubulin angefärbt.

Detaillierte Beschreibung der Abbildungen

[0032] Die Abbildungen zeigen exemplarisch die Er-gebnisse von Untersuchungen an einem Thrombo-zytenkonzentraten, das entweder bei Raumtempera-tur oder bei 4 °C über einen Zeitraum von 10 Ta-gen gelagert wurden. Insgesamt wurden je 12 Throm-bozytenkonzentrate untersucht. Innerhalb des Lage-rungszeitraums wurden an den Tagen 1, 4, 7 und 10Parameter hinsichtlich des Thrombozytenstoffwech-sels sowie der Zellfunktion überprüft und verglichen.Neben diesen auch in der Qualitätskontrolle und beiValidierung im Rahmen von Neuzulassungen vor-geschriebenen und angewendeten Untersuchungenwurden zusätzlich Veränderungen im Zytoskelett mit-tels Immunfluoreszenzmikroskopie und RT-DC unter-sucht.

[0033] Für die RT-DC-Untersuchungen wurden zumjeweiligen Zeitpunkt Proben aus dem Thrombozyten-konzentrat entnommen. Je 50 µl dieser Probe wur-de mit 450 µl des Cellcarrier-Puffers (PBS mit 0,5Gewichtsprozent Methylcellulose) verdünnt und an-schließend auf einen Chip mit integrierten Flußkanä-len mit definiertem Durchmesser pipettiert. Auf demChip wird die Zellsuspension aus einem Reservoirdurch einen engen Kanal mit einer vorher definiertenFlussrate gepumpt, den die Zellen einzeln passieren.Beim Eintritt in den Kanal und während der Passagewirken auf die Zellen sowohl Scherkräfte als auch un-terschiedliche Druckgradienten.

[0034] Die durch diese äußeren Kräfte auftretenden,sichtbaren Verformungen der Zellen werden mittelseiner Hochgeschwindigkeitskamera aufgenommen.Die einzelnen Bilder werden dann mit einem Aus-wertealgorithmus analysiert und die Deformation dereinzelnen Zellen in einem Diagramm gegenüber derZellgröße (Querschnittsfläche) dargestellt. Das ver-wendete Verfahren wird in der WO 2015/024690 A1offenbart.

[0035] Die gemessenen metabolischen Parameterzeigen keinen wesentlichen Unterschied zwischenbeiden Lagerungsbedingungen. Auch die Untersu-chungen zur Zellfunktion wiesen keinen signifikantenUnterschied zwischen den Einflüssen beider Lage-rungsmethoden auf.

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[0036] Ein anderes Ergebnis zeigt sich jedoch beider Untersuchung mittels RT-DC und Immunfluores-zenzmikroskopie.

[0037] Die Kaltlagerung der Thrombozyten führt zueiner Zunahme der Zelloberfläche (Abb. 1). Die De-formation der bei Raumtemperatur gelagerten Zellenweist eine deutlich größere Verteilungsbreite auf alsdie der kalt gelagerten Thrombozyten. Die mittlereDeformation ist bedingt durch die Kaltlagerung derThrombozyten erheblich reduziert ( Abb. 1) .

[0038] Wie aus diesen beiden Abbildungen deutlichwird, kann man anhand der Deformationsergebnis-se eindeutig zwischen den bei 2 bis 6 °C und denbei 20 bis 24 °C gelagerten Zellen unterscheiden.Die Verwendung der RT-DC zur Bestimmung der De-formationsfähigkeit der Zellen ist ein empfindlichesVerfahren, um zwischen verschiedenen Lagerungs-bedingungen zu unterscheiden. Daraus folgt, dassman die mittels RT-DC bestimmten mechanischenEigenschaften der Zellen, wie z.B. die Deformationals einen zusätzlichen Marker bei der Qualitätskon-trolle von Zellen einsetzen kann.

[0039] Diese Ergebnisse werden durch die Immun-fluoreszenzbilder bestätigt (Abb. 2). Mittels an Fluo-reszenzfarbstoff gekoppelte Antikörper wurden dieZytoskelettstrukturen ß1-Tubulin und F-Actin ange-färbt.

[0040] Bei Thrombozyten mit intaktem Zytoskelettliegt ß1-Tubulin als ein Ring vor, der die Zelle um-gibt. Bereits nach 24 Stunden Lagerung bei 4 °C anTag 1 erscheint das ß1-Tubulin nicht mehr als einRing, sondern diffus verteilt. Außerdem ist die Größeder Zellen erhöht. Die Lagerung bei Raumtemperaturbeeinflusst die Ausprägung des ß1-Tubulin-Rings je-doch nicht (Abb. 2).

[0041] Das vorliegend beschriebene Verfahren kannals neuer Marker zur Qualitätskontrolle von zellulä-ren Produkten eingesetzt werden. Die derzeit beste-hende kurze Lagerungszeit von Thrombozytenkon-zentraten könnte verlängert werden, wenn es gelingt,sensitiv thrombozytäre Veränderungen nachzuwei-sen, bzw auszuschließen, die zum einen durch Än-derung der Lagerungsbedingungen und zum ande-ren aus Interaktionen mit Pathogenen im Thrombo-zytenkonzentrat resultieren. Das Verfahren soll beieiner routinemäßigen Kontrolle jedes Thrombozy-tenkonzentrats eingesetzt werden, um zu entschei-den, ob dieses Thrombozytenkonzentrat den Spezi-fikationen nach Hämotherapie-Richtlinien entspricht.In Deutschland werden allein 300.000 Thrombozy-tenkonzentrate pro Jahr transfundiert, weshalb einentsprechendes Qualitätskontrolle-Verfahren von er-heblicher wirtschaftlicher Relevanz ist. Ähnliche An-wendungen ergeben sich auch für Erythrozytenkon-

zentrate oder Stammzellprodukte. Auch wird eine An-wendung bei allen Blutspendediensten angedacht.

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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlichzur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw.Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

- WO 2015/024690 A1 [0025, 0034]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Berger, G. et al., P-Selectin and platelet cle-arance. Blood, 92, 4446-52 (1998) [0009]

- Holme, S. et al., Studies on platelets exposedto or stored at temperatures below 20 degreesC or above 24 degrees C. Transfusion, 37, 5-11 (1997) [0009]

- Milford, E. et al., Comprehensive review ofplatelet storage methods for use in the treat-ment of active hemorrhage. Transfusion, 56Suppl. 2, 140-8 (2016) [0009]

- I. Lopez-Vilchez et al., „Internalization of TissueFactor-Rich Microvesicles by Platelets OccursIndependently of GPIIb-IIIa, and Involves CD36 Receptor, Serotonin Transporter and Cytos-keletal Assembly“, J. Cell Biochem., Vol. 117,Ausgabe 2, 448-457 [0014]

- Guck, J.; et al. (2001). „The Optical Stretcher:A Novel Laser Tool to Micromanipulate Cells“.Biophys. J. 81 (2): 767-784 [0015]

- Otto, O. et al., Real-time deformability cyto-metry: on-the-fly cell mechanical phenotyping(12, 199-202, 4 Folgeseiten von 202 (2015))[0025]

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Patentansprüche

1.  Verfahren zur Qualitätskontrolle von zellulärenBlutprodukten mit folgenden Schritten:- Bestimmen einer mechanischen Eigenschaft vonZellen, die in den zellulären Blutprodukten enthaltensind,- Vergleichen der mechanischen Eigenschaft mit ei-ner vorher festgelegten Referenz und- Entscheiden, basierend zumindest in Teilen auf demErgebnis des Vergleichs, ob das zelluläre Blutprodukteine erforderliche Qualität hat.

2.  Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zellulärenBlutprodukte Thrombozytenkonzentrate, Stammzell-produkte, therapeutische Zell-Subpopulationen mitT-Zellen, B-Zellen, Granulozytenkonzentrate, transfi-zierte T-Zellen, insbesondere CAR-Zellen, und/oderErythrozytenkonzentrate sind.

3.   Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei diezellulären Blutprodukte humanes Blutplasma als Trä-germedium der Zellen aufweisen und bevorzugt dar-aus bestehen oder wobei die zellulären Blutproduktekein humanes Blutplasma in dem Trägermedium auf-weisen.

4.  Verfahren nach einem der vorhergehenden An-sprüche, wobei das zelluläre Blutprodukt zur Vermei-dung der Auslösung einer Graft-versus Host Reaktionim Patienten durch das Blutprodukts bestrahlt wird,insbesondere mit Gamma-Strahlen, UVA-Licht, UVB-Licht und/oder UVC-Licht.

5.  Verfahren nach einem der vorhergehenden An-sprüche, wobei das zelluläre Blutprodukt ferner ei-nem Verfahren zur Verringerung der Anzahl an Pa-thogenen und/oder einem Verfahren zur Verhinde-rung der Zellteilung unterzogen wird.

6.  Verfahren nach einem der vorhergehenden An-sprüche, wobei die mechanische Eigenschaft der Zel-len in Echtzeit, bevorzugt mittels einer „Real-TimeDeformability Cytometry“ (RT-DC)-Vorrichtung ge-messen wird.

7.  Verfahren nach einem der vorhergehenden An-sprüche, wobei die mechanische Eigenschaft eineElastizität, eine Verformung und/oder eine Viskositätumfasst.

8.  Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Verglei-chen umfasst, dass bestimmt wird, ob eine durch-schnittliche Elastizität der Zellen einen Grenzwertüberschreitet.

9.  Vorrichtung, die für das Durchführen eines Ver-fahrens nach einem der vorhergehenden Ansprücheeingerichtet ist.

Es folgen 2 Seiten Zeichnungen

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Anhängende Zeichnungen

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