This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

362 F. HERZFELD

rusnucleinsäure. Die D eutung dieser Befunde soll einer bereits begonnenen A rbeit Vorbehalten b lei­ben, die sich m it dem Einfluß bestim m ter Kationen und anderer M ilieufaktoren auf die S tabilitä t und die Form bzw. S truk tur der isolierten Poliovirus- N ucleinsäure befaßt.

Die Untersuchungen wurden mit Unterstützung der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t und des V e r e i n s z u r F ö r d e r u n g d e r E r f o r ­s c h u n g u n d B e k ä m p f u n g d e r K i n d e r ­l ä h m u n g e. V. (Bielefeld) durchgeführt. Frau L . L e p t h ie n danken wir für gewissenhafte technische Assi­stenz.

Kinetik der Hemmung des Peptidkettenwachstums an Ribosomen von Reticulocyten

F r a n k H e r z f e l d *

Max-Planck-Institut für Virusforschung Tübingen

(Z. Naturforschg. 21 b, 362—365 [1966] ; eingegangen am 6. September 1965)

An isolierten Reticulocyten wurde die Wirkung von Tryptamin auf die Proteinsynthese unter­sucht. Es ist bekannt, daß Tryptamin die Aktivierung des Tryptophans hemmt, so daß das Wachs­tum der Peptidketten nicht über die Tryptophanstellen hinaus erfolgen sollte. Die Experimente ergaben, daß ein begrenztes Wachstum von Peptiden an den Ribosomen stattfindet, während die Synthese fertiger Proteinmoleküle sehr stark gehemmt ist.

Ferner wurde bei der zellfreien Proteinsynthese die inhibierende Wirkung der Bestrahlung der isolierten Ribosomen mit Ultraviolett gemessen. Es ergab sich, daß ein einzelner Treffer genügt, um die Fähigkeit eines Ribosoms, Peptide fertigzustellen und in Lösung abzugeben, zu zerstören. An den getroffenen Ribosomen erfolgt jedoch noch ein begrenztes Wachstum von Peptidketten.

Sowohl Tryptaminhemmung als auch UV-Bestrahlung der Ribosomen führen somit zu einer Unterbrechung des Kettenwachstums auf den Ribosomen, die eine teilweise Synthese von Peptiden noch gestattet, jedoch nicht mehr zur Fertigstellung und Ablösung der Proteine führt.

Reticulocyten sind fü r Untersuchungen über den M edianism us der Proteinsynthese besonders geeig­net. Sie synthetisieren vorwiegend eine P ro te inart, die E iweißkom ponente des H äm oglobins. Da neue Ribosomen nicht m ehr synthetisiert werden, erfolgt der E inbau radioaktiver A m inosäuren in der R ibo­som enfraktion n u r in die w adisenden Peptidketten, vorwiegend in die des H äm oglobins ( D i n t z i s , B o r -

s o o k und V i n o g r a d 1) . Der E inbau in die wachsen­den Ketten auf den R ibosom en einerseits und in die fertigen P roteine andererseits läßt sich infolge des verschiedenen Sedim entations-V erhaltens von R ibo­somen und löslichen P roteinen leicht unterscheiden.

An Reticulocyten ist von D in t z is 2 sowie von B i s h o p , L e a h y und S c h w e e t 3 nachgewiesen worden, daß das W achstum der Peptidketten linear vom 1\- zum C-term inalen Ende hin erfolgt. Auf G rund die­ses linearen W achstumsmechanismus erw artet man, daß verschiedene Typen der Inaktiv ierung des Pro- tein-synthetisierenden Systems möglich sind. W ird

* Zur Zeit: Botanisches Institut, Ruhruniversität Bochum.1 M. H. D in t z is , H. B o r s o o k u . J . V in o g r a d , Microsomal Par­

ticles and Protein Synthesis. Pergamon Press, New York, London 1958, p. 95. Herausgeber: R . B . R o b e r t s .

der elementare Schritt der Peptidsynthese, die V er­längerung eines Peptides um eine A m inosäure, durch einen einzelnen inaktivierenden V organg voll­ständig blockiert, so erw artet man eine exponentielle Inaktivierung, die in gleicher W eise den Einbau radioaktiver A m inosäure in die wachsenden P ep tid ­ketten der Ribosomen und in die abgelösten P ro ­teine reduziert. A ußerdem sind aber auch Inaktivie- rungs-M echanismen denkbar, bei denen ein begrenz­tes Wachstum der Peptidkette am Ribosom noch nach der Inaktivierung möglich ist, aber keine fe rti­gen Peptidketten m ehr abgelöst werden können. Solche unterbrechenden Inaktivierungen sollten ebenfalls zu einer starken Reduktion des Einbaues von Aminosäuren in die abgelösten Proteine führen, jedoch zugleich eine wesentlich geringere Reduktion des Einbaues in die wadisenden Ketten an den R ibo­somen zur Folge haben. Im folgenden werden M es­sungen zur Kinetik der Inaktivierung des letztge­nannten Typs beschrieben. D afür erwies sich Trvpt-

- M. H. D in t z is , Proc. nat. Acad. Sei. USA 47, 247 [1961].3 J. B is h o p , J. L e a h y u . R. S c h w e e t , Proc. nat. Acad. S e i . USA

46. 1030 [I960].

HEMMUNG DES PEPTIDKETTENW ACHSTUM S 363

am in als geeignet, das nach S h a r o n und L ip m a n 4

die A ktivierung von T ryptophan kompetitiv hemmt. Auch die Bestrahlung von Ribosomen m it U ltra­violett vor der Proteinsynthese im zellfreien System führt zu einer Inaktiv ierung der zuletzt genannten Form .

Material und Methoden

Die Gewinnung der Reticulocyten, die Lyse der Zel­len und die Zellfraktionierungen, der Einbau radio­aktiver Aminosäuren, die Fällung der Proteine und die Messung der Radioaktivität wurden entsprechend den Angaben von B o r s o o k , F is c h e r und K e ig h l e y 0, K ru h und B orsoo k 6 und S c h w e e t , L a m fr o m und A l le n 7 aus­geführt. Die Hemmung des Peptidkettenwachstums durch Tryptamin wurde durch Einbau von 14C-Valin in ganze Reticulocyten bei verschiedenen Tryptamin- Konzentrationen gemessen (Abb. 1). Die höchste Tryptamin-Konzentration im Einbaumedium war 10_2-molar. Bei höheren Konzentrationen fand wäh­rend des Einbaues eine teilweise Lyse der Reticulo­cyten statt. Das Tryptamin wie auch alle anderen Ein­baufaktoren wurde bereits vor der Inkubation bei 0 °C zu den Reticulocyten gegeben. Anschließend wurde im Wasserbad für 10 min bei 37 "C mit 14C-Valin inku­biert. Die Zellen wurden danach lysiert und durch Zentrifugation in Ribosomen und Überstand getrennt 7.

Für die UV-Bestrahlung der isolierten Ribosomen wurde eine Niederdruck-Hg-Lampe vom Typ Hanau N.N. 15/44 VK verwendet. Etwa 90% der Strahlungs­energie werden bei einer Wellenlänge von 254 m̂ t/ ab­gestrahlt. Die restliche Energie verteilt sich über den Bereich von 297 bis 436 m/u. Die Ribosomen (10 mg/ ml) waren in Medium A 8 gelöst. Die Schichtdicke be­trug 0,3 Zentimeter. Die Lösung wurde durch einen Vibrator während der Bestrahlung ständig durchmischt. Eine Kontrolle unter sonst gleichen Bedingungen, aber ohne Bestrahlung, ergab keine ins Gewicht fallende Inaktivierung.

Ergebnisse

a) H em m ung des Peptidkettenwachstums durch Tryptamin

Die Am inosäuresequenz des Kaninchenhäm oglo­bins ist noch nicht vollständig bekannt. Das T rypto­phan kommt in den vier Peptidketten des K anin­

4 N. S h a r o n u . F . L ip m a n , Arch, biochem. Biophysics 69, 219 [1957].

5 H. B o r s o o k . E. H. F is c h e r u. G. K e ig h l e y , J. biol. Chemistry 229, 1059 [1957].

6 J. K r u h u . H. B o r s o o k , J. biol. Chemistry 220, 905 [1956].

chenhämoglobins wie auch im Humanhämoglobin nur sechsmal vor ( B r a u n i t z e r , H i l s e , R u d l o f f und H i l s c h m a n n 9 ) . Das Kaninchenhämoglobin hat nach den bisherigen Untersuchungen große Ähnlichkeit mit dem Pferdehämoglobin (private Mitteilung G. B r a u n i t z e r ) . Bei den bisher untersuchten Hämoglo- binen wurde Tryptophan in der a- und /?-Kette in Position 14 oder 15, in der /?-Kette außerdem in Po­sition 37 gefunden. Vermutlich findet sich Trypto­phan auch im Kaninchenhämoglobin an den entspre­chenden Stellen.

Wird den Zellen bei der Proteinsynthese im Ein­baugemisch an Stelle des Tryptophans das Trypto­phan-analoge Tryptamin zum Einbau angeboten, so kann dieses Analog nicht in die Peptidkette einge­baut werden, da ihm die Carboxylgruppe des Trypto­phans fehlt.

V VCH2-C-C00H ---c— ch2— C-H

Nh2 NH2

ATryptophan und Tryptamin

Die Aktivierung des Tryptophans wird durch das Tryptamin kompetitiv gehemmt ( L ip m a n et a l .4). Man erwartet daher, daß die Peptidketten am Ribo­som jeweils bis zur nächsten Tryptophanstelle, aber je nach dem Grad der Hemmung nur sehr langsam oder gar nicht darüber hinaus wachsen können. Ab­gelöste, fertige Peptidketten können nicht mehr oder nur noch in sehr kleinen Mengen gebildet werden. Als Maß des Peptidkettenwachstums in der Anwe­senheit von Tryptamin wurde der Einbau von 14C- Valin benutzt. Dabei ergibt sich eine Abhängigkeit der Proteinsyntheserate von der Tryptamin-Konzen­tration, wie sie in Abb. 1 dargestellt ist. Wie erwar­tet, wird der Einbau in die Ribosomenfraktion durch das Tryptamin wesentlich weniger reduziert als der Einbau in die löslichen Proteine. Die Anwesenheit des Tryptamins hemmt also die Synthese vollständi­ger Proteinmoleküle unter Bedingungen, unter denen eine teilweise Synthese von Peptiden am Ribosom noch erfolgt.

7 R . Sch w eet, H . L a m f r o m u . E. A lle n , P roc. nat. A cad. S e i. U S A 44, 1029 [1958].

8 E. B . K e l l e r u . P. C. Z a m e c n ik , J. biol. Chemistry 221, 45 [1956].

9 G. B r a u n it z e r , K . H i l s e , V. R u d l o f f u. N. H il s c h m a n n , Ad­vances Protein Chem. 19, 1 [1964].

364 F. HERZFELD

Tryptamin (molar) [-1Ö3] — *~

Abb. 1. Hemmung der Proteinsynthese durch Tryptamin. 0 - 0 - 0 = 14C-Val-Einbau in lösliche Proteine. • - • - • = 14C-Val-Einbau in Ribosomen. Das Tryptamin wurde vor der Inkubation zu dem Einbaugemisch gegeben. Das Einbau­system enthielt ganze Reticulocyten und die üblichen Einbau­komponenten 5’ 6, aber kein Tryptophan. Nach der Tryptamin- zugabe wurde im Wasserbad bei 37 °C für 10 min inkubiert. Danach wurden die Zellen bei + 4 °C lysiert und Ribosomen und lösliche Proteine durch Zentrifugation getrennt. Im An­schluß daran wurde das Protein mit Trichloressigsäure gefällt

und die Radioaktivität gemessen 7.

b) H em m ung des Peptidkettenwachstum s durch UV-Bestrahlung

Bei der Untersuchung der inaktivierenden W ir­kung der UV-Bestrahlung auf die Proteinsynthese wurde das zellfreie E inbausystem nach S c h w e e t et al. 7 verwendet. Nach der Isolation w urde die R ibo­som enfraktion zunächst m it UV-Licht bestrahlt. Dann erfolgte bei 37 c C die Inkubation mit den für den Einbau notwendigen K om ponenten und rad io ­aktiv m arkierten A m inosäuren. Nach dem Einbau wurde die R ibosom enfraktion von löslichen P ro ­teinen (Häm oglobin) durch Zentrifugieren getrennt.

In Abb. 2 sind die D aten eines derartigen E xperi­mentes in relativen Einheiten aufgetragen. Es zeigt

Abb. 2. UV-Inaktivierung der Proteinsynthese, o—o -o = 14C- Leu-Einbau in lösliche Proteine. • - • - • = 14C-Leu-Einbau in Ribosomen. Die Ribosomen wurden vor dem Einbau mit UV bestrahlt. Nach der Inkubation bei 37 °C für 15 min wur­den durch Zentrifugation die Ribosomen von den löslichen Proteinen getrennt. Im Anschluß daran wurde das Protein mit Trichloressigsäure gefällt und die Radioaktivität ge­

messen 7.

sich, daß der Einbau der Am inosäuren in das abge­löste P rotein exponentiell m it der B estrahlungsdauer reduziert wird. Ein einzelner Treffer zerstört also die Fähigkeit des Ribosoms, eine fertige Peptidkette zu bilden und in die lösliche F raktion abzugeben. Der Kurvenverlauf zeigt weiter, daß der E inbau in die Ribosom enfraktion durch die UV-Bestrahlung etwa dreim al langsam er reduziert w ird, als der E in ­bau in die löslichen Proteine. H ieraus folgt, daß mindestens ein Teil der UV-Treffer am Ribosom zwar die Bildung vollständiger Proteinm oleküle ver­hindern, eine teilweise Synthese von Peptiden h in ­gegen noch zulassen. W ürde die Peptidkette an vie­len Stellen zugleich voneinander unabhängig gebil­det, so wären für eine erhebliche R eduzierung des Einbaues viele Treffer nötig. Da der E inbau in die Ribosom enfraktion nur etwa um den F aktor 3 lang­sam er reduziert wird als der E inbau in das fertig ­gestellte Protein, genügen wenige Treffer, um das W achstum der Peptidkette zu reduzieren. Dies schließt ein Wachstum der Peptidketten von vielen Stellen aus und ist mit dem W achstum von n u r einem Ende her am besten zu erklären.

Es wird somit geschlossen, daß häufig die P eptid ­kette am UV-getroffenen Ribosom noch ein Stück wachsen kann, ohne jedoch fertiggestellt und abge­löst zu werden. Dieser Befund kann auf zweierlei Weise gedeutet werden: entweder w ird der Syn­thesevorgang am Ribosom so stark verlangsam t, daß die Fertigstellung der Kette nur selten erfolgt, oder die Synthese wird an einer bestim m ten Stelle der Peptidkette unterbrochen. Um zwischen beiden Möglichkeiten zu entscheiden, wurde die K inetik des Einbaues in Ribosom enfraktion und abgelöstes P ro ­tein mit und ohne UV-Bestrahlung gemessen. Das Ergebnis zeigt Abb. 3 a und b. Wie in den bereits beschriebenen Versuchen ist der E inbau in fertiges P rotein stark, der Einbau in die Ribosom enfraktion schwächer reduziert. Der E inbau in die R ibosom en­fraktion erreicht sowohl mit als auch ohne UV-Be­strahlung bereits nach 3 bis 5 min einen Sättigungs­wert. Dieser Sättigungswert liegt jedoch m it UV- Bestrahlung niedriger als ohne UV-Bestrahlung. Nach 10 min läuft die Proteinsynthese noch weiter (Abb. 4 b ) , das zellfreie E inbausystem ist also nicht erschöpft. W ürde die UV-Bestrahlung n u r die Syn­thesegeschwindigkeit herabsetzen, jedoch nicht zu einer Inaktivierung führen, so würde im bestrah l­ten System nach längerer Einbauzeit derselbe S ätti­gungswert erreicht, wie im unbestrahlten System.

Zeit der Bestrahlung

HEMMUNG DES PEPTIDKETTENW ACHSTUM S 365

| 1600I 1400

^1200•§ 1000 6

'S 600 I" 400

200

600

• 1600s . • -------- i 1400

1200 __1000/ *

7 f 600 o/ 600

400 - 0 /!--1---L. 1 1

2001 1 11 2 3 10 12 3

Onkubationszeit [m inj—Abb. 3 a Abb. 3 b

Abb. 3. Zeitverlauf der Proteinsynthese bei Ribo­somen ohne UV-Bestrahlung und nach UV-Bestrah­lung. Inkubation für verschiedene Zeiten bei 37 °C. Im Anschluß an die Inkubation Trennung von Ribosomen und löslichen Proteinen durch Zentrifu­gation, danach Fällung und Messung der Radio­

aktivität 7.• = 14C-Leu-Einbau in die Ribosomen ohne

vorhergehende UV-Bestrahlung.H.—̂ —'% = 14C Leu-Einbau in die Ribosomen nach UV-Bestrah­lung (Abb. 3 a ) . o—0 - 0 = 14C-Leu-Einbau in lös­liche Proteine ohne vorhergehende UV-Bestrahlung der Ribosomen. ^ = 14C-Leu-Einbau in lös­

liche Proteine nach UV-Bestrahlung (Abb. 3 b ) .

Dies ist im Zeitbereich bis 10 m in aber nicht der Fall. Es ist daher wahrscheinlich, daß das Wachstum der Peptidkette nicht n u r verlangsam t, sondern an einer bestim m ten Stelle unterbrochen wird.

Diskussion

Durch das Tryptophan-analoge T ryptam in wird die Synthese fertiger Proteine stärker inh ib iert als das Peptidkettenwachstum auf den Ribosomen. H ier handelt es sich wahrscheinlich überw iegend um eine Hem m ung des Peptidkettenwachstum s an den Tryptophanstellen. E in W achstum der Peptidketten über die T ryptophanstellen hinaus ist in Anwesen­heit des Tryptam ins gehemmt.

F ür die Stärke der H em m ung des E inbaues von 14C-Valin durch das T ryptam in gilt folgende Ü ber­legung: Nach den U ntersuchungen von D i n t z is 2 ist das Kettenwachstum der Geschwindigkeits-bestim- mende Schritt in der H äm oglobinsynthese. E in R ibo­som ist also im Mittel m it einer halben Peptidkette (5,25 Val-Reste) beladen. W ächst die Peptidkette vom /V-terminalen Ende her, so sind im gehemmten System die Ribosom en in den meisten Fällen bis Position 14 in der a-Kette und Position 15 in der /?-Kette beladen und enthalten je 2 Valinreste. Die Fälle, in denen das W achstum bei der Position 37 unterbrochen w ird, können fü r eine grobe A b­schätzung vernachlässigt werden. F ü r das V erhältnis des V alin-Einbaues in die R ibosom en im vollständig gehemmten zu dem im ungehem m ten System giltalso annähernd der W ert = 0 ,38.

5,25Die M essungen ergeben eine Hem m ung des E in ­

baues in der angegebenen G rößenordnung im K on­zentrationsbereich von 5 '1 0 ~ 3-ra. T ryptam in. Bei

höheren K onzentrationen sinkt aber das gemessene V erhältnis von gehem m ter zu ungehem m ter R ibo­som enbeladung weiter ab und erreicht bei 1 0 -2 -m. den Wert 0 ,16. Dies weist darau f hin, daß die W irkun­gen des T ryptam ins nicht allein auf einer H em m ung der T ryptophanaktivierung beruhen, sondern daß zumindest bei hohen K onzentrationen bereits Sekun­däreffekte eine Rolle spielen. D arauf deutet auch die Lyse der Zellen bei noch höheren Tryptam in-Kon- zentrationen hin.

Die M essung der K inetik der U V -Inaktivierung zeigte, daß einzelne Treffer von UV auf einem R ibo­som genügen, um den Einbau von A m inosäuren in fertige, von den Ribosomen abgelöste P roteinm ole­küle zu verhindern. Solche Ribosomen sind dann aber noch zu einer begrenzten Synthese von P epti­den befähigt. Diese Peptide werden im allgem einen nicht mehr von den Ribosom en abgelöst. Die K inetik der Hemm ung des Peptidkettenwachstum s bestätigt auch, daß die Peptidkette n u r von einer oder weni­gen Stellen aus wachsen kann. Ü ber die A rt der Unterbrechung geben diese Versuche keine Aus­kunft. Es kann sich um chemische V eränderungen in der Inform ations-RN S handeln, die zu einem Auflaufen einzelner oder m ehrerer Ribosom en an den getroffenen Stellen der Inform ations-RN S füh­ren. Eine andere Möglichkeit der E rk lärung für eine solche Form der Hem m ung sind Treffer in den ak ti­ven Zentren einzelner Ribosom en in einem Polysom. Das getroffene Ribosom würde dann überhaupt keine Peptide m ehr synthetisieren, die Ablesung der Inform ations-RNS durch noch ungetroffene R iboso­men im gleichen Polysom wäre noch bis zu der P osi­tion des getroffenen Ribosom s möglich, darüber h in ­aus aber verhindert.