06.06.2016

1

Dypsekvensering

Next generation sequencing (NGS)High throughput sequencing (HTS)

Bioingeniørkongressen 03.06.2016

Eidi Nafstad

Avdelingsingeniør

Avdeling for medisinsk genetikk, OUS

Kromosomer og DNA

06.06.2016

2

Fra gen til protein

Standardmetoder på genetisk laboratorium

Southern blotting- store (kb) delesjoner/ekspansjoner

MLPA- delesjoner/duplikasjoner

Fragmentanalyse- Fragmentlengder (ekspansjoner)- Semikvantitativ - trisomier

FISH- påvisning av fravær/tilstedeværelse

av spesifikke sekvenser - informasjon om plassering- avhengig av celler i deling

Karyotyping- påvisning av store

strukturelle feil >5 Mb- påvisning av numeriske feil- avhengig av celler i deling

DNA sekvensering- enkeltbasemutasjoner- små delesjoner/insersjoner

Array CGH- påvisning av

delesjoner/duplikasjoner i hele genomet >50 kb- ser ikke balanserte

kromosomfeil eller triploidi

06.06.2016

3

Monogene sykdommer hos mennesket

Ca. 4700 tilstander/sykdommer har en kjent genetisk årsak (OMIM)

Mange tilstander/sykdommer har fortsatt ingen kjent genetisk årsak

Valgt avgrensning

En gentisk feil kan alene gi en tilstand/sykdom

Økt sekvenseringseffektivitet‐ en genetisk revolusjon

Sangersekvensering:

Sekvensering av ett og ett ekson

(ca. 500 baser i hver reaksjon)

Dypsekvensering:

Massiv parallellisering av sekvenseringen

Kan sekvensere hele genomet på en gang (ca. 3Mb)

06.06.2016

4

Dypsekvensering gir nye muligheter

• Store muligheter for effektivisering– Sykdom/tilstand assosiert med flere gener

– Mange gener kan sekvenseres samtidig

• Bedre diagnostikk av heterogene tilstander– Nye pasientgrupper får tilbud

– Større mulighet til å finne årsak til sykdom

• Ny kunnskap fra forskning kan implementeres raskt i diagnostikk

Dypsekvensering ‐ prinsipp

06.06.2016

5

Ulike mengder DNA sekvenseres

• Målrettet/ targeted sekvensering:– Kun gener analysen er designet for

• Få gener og mange pasienter

• Eksomsekvensering:– alle genene

• Ca. 20 000 gener

• 1‐2 % av genomet

• Mange gener og få pasienter

• Genomsekvensering:– Hele genomet sekvenseres

• Ca. 3 Gb

06.06.2016

6

Maks antall cluster  25 M 400 M 4 000 M 6 000 M

Maks sekvenslengde 2x300 bp 2x150 bp 2x125 bp 2x150 bp

Sekvensmengde/run 15 Gb 120 Gb 1 000 Gb 1 800 Gb

Typisk tid/run 24 timer 24 timer 6 dager 3 dager

Eksempler AMG OUS

Arvelig kreft (17 gener) 24 prøver/run

TruSight One (~5000 gener) 36 prøver/run

Eksom (ca. 20 000 gener) 64 prøver/run

Genom (3 Gb) 16 prøver/run

Dataprosessering

• Demultipleksing– Sortere hvilke sekvenser som tilhører hvilken prøve

• Mapping– Aligne DNA‐sekvensene fra hver prøve mot en referanse

• Variant calling– Finne sekvensvarianter (forskjeller fra referansen)

• Annotering– Legge til informasjon fra eksterne databaser

• Gir sekvensvarianten konsekvenser på proteinnivå?

• Har andre sett sekvensvarianten før, finnes den i databaser?

• Finnes den i forskningsartikler som beskriver varianten?

06.06.2016

7

Dataprosessering

• Krever store mengder datakraft og lagring

Prosesseringstid (cpu timer)

Analysetid (timer)

Lagring (GB)

Eksom 70 11 40

Genom 1000 81 500

Regneklynge

• Bruker “Tjenester for sensitive data” ved UIO

Sikker løsning for prosessering og lagring av data

Over 1500 prosessorkjerner

>1 petabyte lagring (1PB = ~1 000 000 GB)

06.06.2016

8

Visualisering av dataIGV: Integrative Genomics Viewer

06.06.2016

9

Vurdering av varianter

• Kategoriseres inn i fem klasser

1 ‐ dokumentert normal

2 ‐ sannsynlig normal

3 ‐ usikker klinisk betydning (VUS)

4 ‐ sannsynlig sykdomsgivende

5 ‐ dokumentert sykdomsgivende

t ‐ tekniske artefakter

u – utenfor området som skal vurderes

• Varianter i klasse 3‐5 rapporteres til rekvirent

Analyse kun av relevante gener (genlister/genpanel)

• Begrenser

– antall funn som må vurderes

– antall varianter av usikker klinisk betydning (VUS)

– antall utilsiktede funn

• Diagnostiske genlister skal være evidensbaserte

– Evidens for at mutasjon i genet som analyseres forårsaker gitt tilstand

06.06.2016

10

Frekvensdatabaser

• 1000 Genome

• ESP (NHLBI Exome Sequencing Project)

• ExAC (Exome Aggregation Consortium)– Ca. 60 000 individer (ikke i slekt)

• IntDB– Oppsamling av varianter funnet i alle diagnostiske eksomer analysert ved AMG OUS

– Alle syke, men forskjellige sykdommer

– Inneholder ”norske varianter”

06.06.2016

11

Nye utfordringer ved dypsekvensering

• Store datamengder– Lagring– Prosessering– Overføring

• Analyse– Kun få kommersielle programvare for analyse av sekvensdata

– Pipeline må utvikles av våre bioinformatikere

• Kvalitet– Usikker deteksjon av delesjoner og duplikasjoner– Andre metoder kjøres eventuelt parallelt

• Variantvurdering– Mange flere varianter

Genpaneler AMG OUS Antall gener Lab prep kit Sekvensator

Epileptisk encefalopati og psykisk utviklingshemming 57

Agilent Sure Select

50Mb exomeHiSeq 2500

Genetiske bindevevssykdommer 33

Ciliopatier (8 underpaneler) 115

Hereditær spastisk paraparese og hereditær ataksi 51

Iktyose (ikke x‐bundet) 40

Mitokondriesykdommer 115

Epidermolysis bullosa 20

Medfødt glykosyleringsdefekt type 1 25

Ektodermal dysplasi og hypodonti 35

Craniofaciale malformasjoner ca. 60

Primær immunsvikt ca. 300

Trio

Psykisk utviklingshemmng og forsinket utvikling 755

Illumina

TruSight One ~5000 gener

NextSeq 500

Arvelig kreft 17 Illumina Nextera Custom Capture 

MiSeq

Kardiomyopati

?

Illumina

TruSight Cardio

174 gener

MiSeq

06.06.2016

12

Takk for meg!

06.06.2016

13

Vesentlige parametre ved variantvurderingen

• Frekvens i normal populasjoner

• Endringens plassering– Kodende

– ikke-kodende

– i spleisesete

• Type endring– Delesjon, duplikasjon, insersjon

– Enkeltbaseforandring (SNP)

• Arveform (dominant, recessiv, X-bundet)

Ulike analysestrategier

• De novo (trio)

• Resessiv, homozygot

• Resessiv, sammensatt heterozygot

• Flere urelaterte pasienter med samme fenotype

• Filtrering av gener for analyse (genlister)

06.06.2016

14