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Grammann / Eiden BioAnalytik

BioAnalytik : 12015-2016

- Standort Recklinghausen-

Wintersemester 2015-16

BioanalytikBioanalytik23.11.1523.11.15

ImmunoassaysImmunoassays007_001007_001

Rev. 1.5 | 091206

Fol

ienb

asis

: Pro

f. B

eyer



fatty acid-binding protein, FABP

Das Fettsäure bindende Protein (fatty acid-binding pr otein, FABP) wurde erstmals als Blutmarker für die Diagnos e eines akuten Myokardinfarkts 1988 vorgeschlagen. FA BP spielt heute eine wichtige Rolle für die Diagnose v on Patienten mit Brustschmerz, besonders in den frühen Stunden nach Einsetzen der Symptome

Die biochemischen Marker haben jedoch den Nachteil, dass nach einem AMI (akuter Myokardinfarkt) ihre Blut-konzentration erst etwa 4 (CKMB) oder 4 – 6 h (bei Troponinen) nach Einsetzen der Symptome ansteigt.

Sowohl bei Myoglobin als auch bei dem Fettsäure bind enden Protein (FABP) erhöhen sich die Konzentrationen im Blut inner halb von 2 h nach dem Einsetzen der Symptome.Klinische Studien haben gezeigt, dass FABP spezifis cher ist als Myoglobin. Das macht FABP zum bevorzugten Blutmarker für die Früherkennu ng oder den Ausschluss eines AMI.



fatty acid-binding protein, FABP



• Fettsäurebindungsproteine (FABPs) als Marker für Gewebeschädigungen(gewebespezifische Expression der unterschiedlichen Typen)

• bereits etabliert: Herz hFABP wird bei Herzinfarkten freigesetzt

• Projekt: Wird intestinales iFABP bei Darmschädigungen freigesetzt?

• Testsystem: Retrospektive Analyse von Serum von Neugeborenen mitenterkolitischen Komplikationen

Reinigung & Assay-Etablierung – ein Fallbeispiel



ampr

ori

hI-FABP

Bam HI

Nde I

T7 promoter

T7 terminator

pEThI-FABP(5018 bp)

RBS

E. coli BL21(DE3)pLysS pEThI-FABP

0,4 mM IPTG Nach 3 h Zellernte, Zentrifugation

Bakterienpellet

Benzonuklease (15 Min, 37°C), Aufschluss mit Ultraschall

(30 W, 3 x 15 s, 0°C)

Aufgeschlossene Bakterien

Zentrifugation � Ammoniumsulfat-Präzipitation

Lysat

1. Heterologe Expression

Fallbeispiel iFABP



0 100 200 300 400

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7Sephadex G25 (5 cm x 20 cm)10 mM Tris/HCl pH 7.45 ml/min

OD

280

Volumen [ml]

2. Reinigung

2. 1. Entsalzen(Gelfiltration)

0 300 600 900 1200

0.0

0.4

0.8

1.2

0

20

40

60

80

100

120

140

OD

280

Volumen [ml]

Lei

tfähi

gkei

t [m

Si/c

m]

Q-Sepharose BB (5 cm x 20 cm)10 mM Tris HCl, 230 mM NaCl, pH 7.45 ml/min

2. 2. Ionenaustausch-Chromatographie

Fallbeispiel iFABP



0 20 40 60 80 100 120 140

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4Superdex (1.6 cm x 60 cm)10 mM Na-phosphate, 154 mM NaCl, pH 7.40.75 ml/min

OD

280

Volumen (ml)

3. Polishing

mixed-bed GelfiltrationReinigungsfortschritt

SDS-PAGE

Fallbeispiel iFABP



rec. Human I-FABP

Generierung monoklonaler AK

I-FABP Sepharose oder ProteinA-Sepharose

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60

0.0

0.1

0.2

0.3

0.8

0.9

Puf

fer

B (

%)

Volumen

I-FABP Sepharose (1 cm x 6 cm)PBS, 1 ml/minElution 0.1 M Glycin pH 2.8

OD

280

1 ml Anti-I-FABP

Modifizierung der Anti-I-FABP IgGmit Biotin

5. Generierung & Biotinylierung von Antikörpern

Affinitätsgereinigte Anti-I-FABP IgG

Fallbeispiel iFABP



I-FABP [ng/ml]

0 1 2 3 4

OD

490

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

y= - 0.060 x2 + 0.726 x + 0.074r2 = 0.9999

Detection limit: 0.05 ng/mlmeasurement range: 0.1 - 4 ng/ml

dilution of serum: 1 : 10Inter-Assay Varianz ~ 5%

Y BSA

bioHRP

I-FABP

OPDStreptavidin

490 nm

Optimierte Parameter: Konz. Fänger- Detektorantikörper,Sav-HRPInkubationszeiten

7. Etablierung des Sandwich ELISA

Fallbeispiel iFABP



7. Etablierung des Sandwich ELISA - Charakterisierun g

Fallbeispiel iFABP

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

OD

490

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

rekomb. I-FABP [ng/ml]

Rekombinantes und Plasma-

human I-FABP sind äquivalent

plasma I-FABP [plasma dilution factor]

0 20 40 60 80 100



Immunoassays



Immunoassays z.B. im klinischen Umfeld - Serumanalyti k

„klassische“ Auswertung der Antigen-Antikörperreaktion:Agglutination = Zusammenklumpen durch Präzipitatbildung

Ausführung (a) ⇒ als „Tüpfeltest“ auf Objektträgern oder kleinen Vertiefungen

(b) im Mittel-/Hochdurchsatz:optische Detektionsmethodenzur Trübungsmessung

⇒ Turbidimetrie (s. weitere Folien)

⇒ Nephelometrie (s. weitere Folien)

Serologie: Agglutinationstests

anti-A

anti-B



Heidelberger Kurve!

Agglutination: Präzipitatbildung durch Immunkomplexe

(AG mit monovalenten Epitopen, z.B. Protein) +/- lineare Beziehung AG - Signal



Agglutination: Präzipitatbildung durch Immunkomplexe



Latex-verstärkte Agglutination

Detektion spezifischer AK Latexpartikel mit AG gecoatet: (Partikel < λ� interferieren nicht mit Lichtstrahl)

Sie bilden jedoch poly valente Bindungspartner für die AK� große AG/AK-Komplexe

AK-Assay: direkt �

AG-Assay: kompetitiv �

(Anm.: ggf. können auch die AK die an die Latexpartikelgekoppelt werden!)



Optische Detektion der Präzipitat- / Immunkomplexbild ung

hν-Streuung � viele optische Effekte: Nebel, Milch, blauer Himmel…

Streuung physikalische Beschreibung:

Elastische Streuung(keine Energieübertragung an die Probe)

- Diffraktion (Röntgenstreuung an Kristallen)

- Rayleigh-, Mie-Streuung sichtbaren Lichts an suspendierten bzw. kolloiden Teilchen (Parameter in Formeln: Winkel, Partikelgröße und Wellenlänge)

Inelastische Streuung (Energieübertragung zwischen Probe und Strahlung)

- Ramanspektroskopie

Agglutination: Messung



FL D

c kleinefür ckI ⋅=

Turbidimetrie

FL D

• Ausblenden des Lichtstrahls• Detektion

der (Vorwärts-)Streuung

Nephelometrie

Turbidimetrie � Trübungsmessung / Nephelometrie � Streulicht-Messung

Agglutination: Messung

Eλ

= lg(I0/I) = ελ·c·d



Laborautomaten

Vorteile :

• bar-code gesteuerte Erfassung & Prozessierung

• Medium & high througput

• Reagenzien on board(Vorratsflaschen)

• schnelle Messung• Hohe Reproduzierbarkeit � gering Systemvarianz

Agglutinationstest im Labor



Latex-Agglu-Test entwickelt Anfang der 1980er, angewendet u.a. in folgenden heute gängigen Tests:

• Nachweis v. Antistaphylolysin(ein Staphylokokken-Enzym)

• Antistreptolysin-Test(bei Streptokokkeninfektion)

• Nachweis von C-reaktivem Protein, einem Entzündungsmarker

• Immunglobulin M-Nachweis

• Latex-RF-Test(Nachweis von Rheumafaktoren)

• Schwangerschaftstest (Nachweis von beta-HCG)

Agglutination: Testkits

Evaluation of Latex Agglutination Tests for Establishing Coagulase Status of Staphylococci from Milk;

Can J. Comp Med 1984; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1236043/pdf/compmed00006-0101.pdf



… im klinischen Zentrallabor

Nephelometrie ( vs. Turbidimetrie ): besseres Signal-Rausch Verhältnis im Bereich geringer Signale, weil c=0 � I = 0 (vs. c = 0 � I = max.)

Agglutinationstests

Zentrallabor Universitätsklinikum Schleswig-Holstei n Campus Kiel



kinetische vs. fixed time (Endpunkt-) Methode

� Abwarten des Gleichgewichtes kann umgangen werden, indem die Anfangssteigung (meist aus 2 frühen Messpunkten) bestimmt wird

Messung:



Turbidimetrischer, immunologischer Inhibierungsassay

direkt vs. kompetitiv (Variante: Inhibition)

Test-Setup



Z.B. in der Mikrobiologie: Bakterienwachstum

Messung von Streustrahlung im Mikrotiterplattenformat

Messung im 96er-Format



Feinstaubmessung

Andere Einsatzgebiete der Nephelometrie

Detektor

Referenz-Detektor

Lichtquelle(LED)



Strip-Tests



� Geschwindigkeit� Zuverlässigkeit

… im Zusammenhang mit …

• Wissenschaftlicher Analytik� Exaktheit zählt;

Aufwand & Zeit sind nebensächlich

• Klinischer Labor-Diagnostik� Hochdurchsatz bei geringem Aufwand� Zuverlässigkeit� definierte Genauigkeit

• Schnellanalytik � geringer Aufwand� Robustheit

-- Biosensoren (Immunsensoren)-- Strip-Tests

Praxisanforderungen



Spezielle Membranen

• Nitrozellulose (High Protein Binding) • Cellulose Acetate (Low Protein Binding) • Glass Fiber Membranes (Non-Protein Binding)

Immunoschnelltest - Teststreifen

Parameter: Porengröße,Oberflächen-

beschaffenheit

Integration der Reagenzien

• Immobilisierte Fänger- und Kontroll-Antikörper• markierte Detektor-Antikörper in Matrix (lösliche Form)

Andere Bezeichungen:

• Lateral Flow Tests• Strip Assay• Immunochromatographie

Strip Assays

Prinzip: AG (oder AK) aus Probe fließt (Kapillarkräfte!) über Teststreifen;� wird an durch AG-AK-Interaktion an „reagent line“ fest gehalten



Kinetische Parameter: einfach vs. Sandwich / direkt vs. kompetitiv

• Einstellung der Flussrate (Antrieb: Kapillarkraft ) � Analysenzeit, Empfindlichkeit, Hintergrund, Reagenzienverbrauch

• visuelle Detektion: AK-Markierung mit kolloidalem Gold (ca. 30nm) oder gefärbten Mikropartikeln (Latex, ca. 300nm) � Größe sollte max. 10% der Porengröße betragen!

z.B. Sandwich:größere Antigene

(mit mehreren Epitopen)• Plasma Proteine• GVO-Nachweis

z.B. kompetitiv:kleine Antigene

(mit nur einem Epitop)• Schwangerschaftstest

hCG - human chorionicgonadotropin

Strip-Assays: Setup



C T

Negativ-Kontrolle � markierte Antikörper werden auf der Kontrolllinie C abgefangen

C T

Beispiel für einen kompetitiven Teststreifen

Strip-Assays



C T

Viel AG in der Probe � markierte Antikörper werden maskiert und auf der Testlinie T von Anti-IgG gebunden

C T

Strip-Assays



In einem Bild: kompetitiver Strip Assay

Bevorzugt für kleine AG / Haptene: Medikamente, Drogen, kleine Hormone

Wo ist C? T?

Strip-Assays



Beispiel für einen Sandwich-Teststreifen

Strip-Assays

positiv negativ



• poröse Materialien (Pads, Membran)• (lyophilisierte) Reagenzien• Laminierungsmaterialien• Gehäuse

Bestandteile eines Teststreifens:

Optimierungsziel: Vorgaben erfüllen, Kosten im Cent-Bereich

Strip-Assays



GVO Nachweis auf Protein-Ebene

Vorteile? Nachteile?

relevante Proteine:

- Bacillus Thuringiensis (Bt)-Toxin,

- Agrobacterium sp. CP4 - EPSPS (alle Roundup Ready Konstrukte)(5-enol-pyruvyl-shikimate-3-phosphate Synthase, Schlüsselenzym der Val/Leu/Ile-Biosynthese, Glyphosat-[in]sensitiv)

Anwendungsbeispiel GVO AnalytikPoint-of-Sale Messungen (z.B. Wareneingangskontrolle )!

Strip-Assays



Low Te

ch abe

r : ei

nfach

und sc

hnell!!

Strip-Assays



Einsatzgebiete in der klinischen Analytik

Roche

Point of Care Diagnostik

⇒ Aufwendigeres Design

Strip-Assays



Aspekte

Fallbeispiel:• Klonierung / Überexpression• Vorbereitung / Evaluierung des ELISA

Agglutionstionstests• Turbidimetrie vs. Nephelometrie: Detektionsprinzip• Heidelberger Kurve• Fixed time (kinetisch) vs. Endpunkt • Latextest: Prinzip der Signalverstärkung

Strip Assays• Funktionsweise (direkt vs. kompetitiv)• Beispielanwendungen



„ To live, to err, to fall, to triumph, to recreate life out of life!“James Joyce

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