実験力学 vol.16 no - jst

1

共焦点レーザ顕微鏡による線維肉腫細胞の運動に伴う

焦点接着斑分布解析

菅原路子＊，渡辺健太郎＊＊，劉浩＊＊＊，武居昌宏＊

Distribution of Focal Adhesion in Fibrosarcoma Cells

by Laser Confocal Microscopy

Michiko SUGAWARA , Kentaro WATANABE , Hao LIU and Masahiro TAKEI

Cell movement plays an essential role in embryonic development, wound healing in multicellular organisms and

cancer metastatis. It is known to be a cyclic system of the protrusion at the leading edge, adhesion to the extracellular

matrix via focal adhesions and detachment and retraction at the cell rear. Focal adhesions are one of the key players for

cell movement. However, in case of HT1080 fibrosarcoma cell which is one of the cancer cells, although mechaism of

invasion to the extracellular matrix has been extensively studied, mechanism of adhesion to the extracellular matrix via

focal adhesions has not been well understood. In this study, therefore, an attemp was made to visualize and analyze the

distribution of focal adhesions in HT1080 fibrosarcoma cells expressing RFP-zyxin and GFP-actin by laser confocal

microscopy. As a result, during movement of HT1080 fibrosarcoma cell, focal adhesions appeared at the region of

protrusion whereas they disappeared or remained at the region of retraction, which led to the asymmetric distribution of

focal adhesions in the cell. On the other hand, when a cell showed staying behavior during movement, focal adhesions

equally distributed close to the edge of the cell.

Key words: Laser confocal microscopy, Fibrosarcoma cells, Cell movement, Focal adhesion, Digital image processing

１．緒論

細胞が時間とともに移動にする細胞運動は，神経細胞の

軸索伸展 1)，白血球のアメーバ様運動 2)，および創傷治癒

過程 3)などの人間の生命活動を維持する上で重要な役割を

果たしている．Fig. 1 に，細胞運動の模式図を示す．細胞

運動は，細胞膜（cell membrane）の前方への突出（protrusion），

細胞膜と細胞外基質（ extracellular matrix）との接着

（adhesion），および細胞体が進行方向へ引っ張られる退

縮（retraction）の 3 つのサイクルを繰り返すことで行われ

る 4)．細胞膜の突出は，細胞骨格の一種であるアクチンタ

ンパク質（actin）が細胞膜直下に集合してアクチンフィラ

メント（actin filament）を形成し，それらから緻密なネッ

トワーク状の構造体が形成されることにより生じる．接着

では，細胞膜に存在する膜貫通型タンパク質であるインテ

グリン（integrin）を介し，細胞膜と細胞外基質が接着する．

細胞内部に露出したインテグリン構造の一端には．パキシ

リン，テーリン，ビンキュリン，ジキシン（zyxin）などと

いった 50 種類以上ものタンパク質が集積し，複合体である

焦点接着斑（focal adhesion）を形成することが知られてい

る 5)．この焦点接着斑が，細胞運動において細胞膜と細胞

外基質との接着を担う足場としての役割を果たす 4)．また，

焦点接着斑を構成する一部のタンパク質は，細胞骨格であ

るアクチンフィラメントとの結合部位を有することから，

焦点接着斑は細胞内部の骨格構造とも連結し，細胞構造を

支える重要な役割を果たす．一方，細胞後方において焦点

接着斑が解離すると，そこに結合したアクチンフィラメン

トの収縮に伴い細胞体が進行方向へ引っ張られる退縮が生

じ，細胞は前方へと移動する．

細胞運動のメカニズムを解明するうえで，焦点接着斑は

重要であり，線維肉腫細胞（癌細胞）についても例外では

Fig. 1 Schematic of the mechanism of cell movement

原稿受付 2015 年 4 月 9 日＊正会員千葉大学大学院工学研究科（〒263-8522 千葉

県千葉市稲毛区弥生町 1-33）＊＊千葉大学工学部（〒263-8522 千葉県千葉市弥生町 1-33）＊＊＊千葉大学大学院工学研究科（〒263-8522 千葉県千葉市

稲毛区弥生町 1-33）

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2

ない．しかし，線維肉腫細胞に対し細胞運動に伴う浸潤に

関する研究 6)は報告があるものの，線維肉腫細胞の運動メ

カニズムは未だ解明されていない．二次元ガラス基板上で

は，ガン化していない線維芽細胞において，細胞運動中の

焦点接着斑形成に関し多くの研究が報告されている．既知

の運動メカニズムとの比較の観点から，二次元ガラス基板

上における線維肉腫細胞の運動を観察し解析することは，

そのメカニズムを明らかにするうえで重要であるといえる．

そこで本研究では，細胞運動時の線維肉腫細胞のメカニ

ズムを解明するためのファーストステップとして，共焦点

レーザ顕微鏡を用いて，運動時における線維肉腫細胞の焦

点接着斑の分布を経時観察する．そして，画像解析に基づ

き，焦点接着斑分布と細胞運動との関係を明らかにするこ

とを目的とする．

２．実験と画像処理方法

２．１細胞

実験には，ヒト線維肉腫細胞より樹立された株化培養細

胞（HT1080，American Type Culture Collection CCL-121）を

用いた．線維肉腫細胞の培養にあたり，継代培地には 10%

FBS と抗生物質を添加した MEM（GIBCO）を用い，37℃，

CO2濃度 5%の条件下で，培養用 CO2 インキュベータ内で

培養した．

焦点接着斑の分布を経時的に観察するにあたり，線維肉

腫細胞に蛍光タンパク質ベクターpTagRFP-zyxin（Evrogen）

を遺伝子導入した．またこのとき同時に細胞輪郭を抽出す

るため，pAcGFP1-actin（Clontech）も遺伝子導入した．遺

伝子導入には，リポフェクション用脂質試薬 FuGENE HD

(Promega)を用い，蛍光ジキシンおよび蛍光アクチンを一過

性に発現させた．なお，遺伝子導入にあたり，FuGENE HD

に添付のマニュアルに従った．その際，低血清培地

Opti-MEM (GIBCO) 100 l に蛍光タンパク質ベクター

pTagRFP-zyxin および pAcGFP1-actin を各 1 g 添加して混

合し，その後 FuGENE HD を 7 l 添加したうえで再度混合

し，室温で 15 分放置した．その混合液を，35 mm 細胞培

養ディッシュに約 80 %コンフルエントの線維肉腫細胞に

ふりかけ，細胞を培養用CO2インキュベータ内に静置した．

24 時間経過後の導入効率，すなわち全細胞に対し遺伝子導

入された細胞の割合は，目視で約 30 %であった．

細胞運動を経時観察するにあたり，細胞接着因子の一種

であるフィブロネクチン（日本 BD）を濃度 30 g/ml で 30

分間吸着させたガラス基板上に，上述のリポフェクション

による遺伝子導入から 1 日経過後の細胞を 1×104 cells/ml

の濃度に調整し，2 ml の培地中に播種した．その後，培養

用 CO2インキュベータ内に約 3 時間静置し，細胞が基板上

に十分伸展したことを確認したうえで，経時観察を開始し

た．

２．２実験装置と方法

本研究に用いた実験装置の概略図を Fig. 2 に示す．観察

には，共焦点レーザ顕微鏡（A1R, ニコン）を用いた．蛍

光タンパク質 GFP および RFP の観察にあたり，それらを

励起するため，波長 = 488 nm および 561 nm のレーザを搭

載した．また，GFP および RFP に対する吸収フィルタを，

525/50 nm および 595/50 nm とし，二種類の蛍光を分離して

検出した．また，透過ユニット（transmitted detector）を通

して，微分干渉像を得た．観察には，開口数 1.40 の油浸

60 倍対物レンズ（CFI Plan Apo 60×）を用い，顕微鏡ステ

ージ用 CO2 インキュベータ内でサンプルの雰囲気を CO2

5%，37℃に保ちながら，細胞運動を観察した．

共焦点レーザ顕微鏡を用いた観察画像の取得方法を，

Fig. 3 に示す．観察の際は，ガラス基板直上の細胞底面近傍

において，蛍光ジキシン像に最も焦点が合う面を中心とし，

その上下各 0.6 m の範囲を 0.2 m 間隔で撮影し，7 枚のス

Fig. 2 Experimental setup for observing a cell expressing

GFP-actin and RFP-zyxin by laser confocal microscopy

Fig. 3 Schematics of image acquisition for a cell on a glass

substrate

実験力学 Vol. 16, No .2 pp.154-161（2016 年６月）

154

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共焦点レーザ顕微鏡による線維肉腫細胞の運動に伴う

焦点接着斑分布解析

菅原路子＊，渡辺健太郎＊＊，劉浩＊＊＊，武居昌宏＊

Distribution of Focal Adhesion in Fibrosarcoma Cells

by Laser Confocal Microscopy

Michiko SUGAWARA , Kentaro WATANABE , Hao LIU and Masahiro TAKEI

Cell movement plays an essential role in embryonic development, wound healing in multicellular organisms and

cancer metastatis. It is known to be a cyclic system of the protrusion at the leading edge, adhesion to the extracellular

matrix via focal adhesions and detachment and retraction at the cell rear. Focal adhesions are one of the key players for

cell movement. However, in case of HT1080 fibrosarcoma cell which is one of the cancer cells, although mechaism of

invasion to the extracellular matrix has been extensively studied, mechanism of adhesion to the extracellular matrix via

focal adhesions has not been well understood. In this study, therefore, an attemp was made to visualize and analyze the

distribution of focal adhesions in HT1080 fibrosarcoma cells expressing RFP-zyxin and GFP-actin by laser confocal

microscopy. As a result, during movement of HT1080 fibrosarcoma cell, focal adhesions appeared at the region of

protrusion whereas they disappeared or remained at the region of retraction, which led to the asymmetric distribution of

focal adhesions in the cell. On the other hand, when a cell showed staying behavior during movement, focal adhesions

equally distributed close to the edge of the cell.

Key words: Laser confocal microscopy, Fibrosarcoma cells, Cell movement, Focal adhesion, Digital image processing

１．緒論

細胞が時間とともに移動にする細胞運動は，神経細胞の

軸索伸展 1)，白血球のアメーバ様運動 2)，および創傷治癒

過程 3)などの人間の生命活動を維持する上で重要な役割を

果たしている．Fig. 1 に，細胞運動の模式図を示す．細胞

運動は，細胞膜（cell membrane）の前方への突出（protrusion），

細胞膜と細胞外基質（ extracellular matrix）との接着

（adhesion），および細胞体が進行方向へ引っ張られる退

縮（retraction）の 3 つのサイクルを繰り返すことで行われ

る 4)．細胞膜の突出は，細胞骨格の一種であるアクチンタ

ンパク質（actin）が細胞膜直下に集合してアクチンフィラ

メント（actin filament）を形成し，それらから緻密なネッ

トワーク状の構造体が形成されることにより生じる．接着

では，細胞膜に存在する膜貫通型タンパク質であるインテ

グリン（integrin）を介し，細胞膜と細胞外基質が接着する．

細胞内部に露出したインテグリン構造の一端には．パキシ

リン，テーリン，ビンキュリン，ジキシン（zyxin）などと

いった 50 種類以上ものタンパク質が集積し，複合体である

焦点接着斑（focal adhesion）を形成することが知られてい

る 5)．この焦点接着斑が，細胞運動において細胞膜と細胞

外基質との接着を担う足場としての役割を果たす 4)．また，

焦点接着斑を構成する一部のタンパク質は，細胞骨格であ

るアクチンフィラメントとの結合部位を有することから，

焦点接着斑は細胞内部の骨格構造とも連結し，細胞構造を

支える重要な役割を果たす．一方，細胞後方において焦点

接着斑が解離すると，そこに結合したアクチンフィラメン

トの収縮に伴い細胞体が進行方向へ引っ張られる退縮が生

じ，細胞は前方へと移動する．

細胞運動のメカニズムを解明するうえで，焦点接着斑は

重要であり，線維肉腫細胞（癌細胞）についても例外では

Fig. 1 Schematic of the mechanism of cell movement

原稿受付 2015 年 4 月 9 日＊正会員千葉大学大学院工学研究科（〒263-8522 千葉

県千葉市稲毛区弥生町 1-33）＊＊千葉大学工学部（〒263-8522 千葉県千葉市弥生町 1-33）＊＊＊千葉大学大学院工学研究科（〒263-8522 千葉県千葉市

稲毛区弥生町 1-33）

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ない．しかし，線維肉腫細胞に対し細胞運動に伴う浸潤に

関する研究 6)は報告があるものの，線維肉腫細胞の運動メ

カニズムは未だ解明されていない．二次元ガラス基板上で

は，ガン化していない線維芽細胞において，細胞運動中の

焦点接着斑形成に関し多くの研究が報告されている．既知

の運動メカニズムとの比較の観点から，二次元ガラス基板

上における線維肉腫細胞の運動を観察し解析することは，

そのメカニズムを明らかにするうえで重要であるといえる．

そこで本研究では，細胞運動時の線維肉腫細胞のメカニ

ズムを解明するためのファーストステップとして，共焦点

レーザ顕微鏡を用いて，運動時における線維肉腫細胞の焦

点接着斑の分布を経時観察する．そして，画像解析に基づ

き，焦点接着斑分布と細胞運動との関係を明らかにするこ

とを目的とする．

２．実験と画像処理方法

２．１細胞

実験には，ヒト線維肉腫細胞より樹立された株化培養細

胞（HT1080，American Type Culture Collection CCL-121）を

用いた．線維肉腫細胞の培養にあたり，継代培地には 10%

FBS と抗生物質を添加した MEM（GIBCO）を用い，37℃，

CO2濃度 5%の条件下で，培養用 CO2 インキュベータ内で

培養した．

焦点接着斑の分布を経時的に観察するにあたり，線維肉

腫細胞に蛍光タンパク質ベクターpTagRFP-zyxin（Evrogen）

を遺伝子導入した．またこのとき同時に細胞輪郭を抽出す

るため，pAcGFP1-actin（Clontech）も遺伝子導入した．遺

伝子導入には，リポフェクション用脂質試薬 FuGENE HD

(Promega)を用い，蛍光ジキシンおよび蛍光アクチンを一過

性に発現させた．なお，遺伝子導入にあたり，FuGENE HD

に添付のマニュアルに従った．その際，低血清培地

Opti-MEM (GIBCO) 100 l に蛍光タンパク質ベクター

pTagRFP-zyxin および pAcGFP1-actin を各 1 g 添加して混

合し，その後 FuGENE HD を 7 l 添加したうえで再度混合

し，室温で 15 分放置した．その混合液を，35 mm 細胞培

養ディッシュに約 80 %コンフルエントの線維肉腫細胞に

ふりかけ，細胞を培養用CO2インキュベータ内に静置した．

24 時間経過後の導入効率，すなわち全細胞に対し遺伝子導

入された細胞の割合は，目視で約 30 %であった．

細胞運動を経時観察するにあたり，細胞接着因子の一種

であるフィブロネクチン（日本 BD）を濃度 30 g/ml で 30

分間吸着させたガラス基板上に，上述のリポフェクション

による遺伝子導入から 1 日経過後の細胞を 1×104 cells/ml

の濃度に調整し，2 ml の培地中に播種した．その後，培養

用 CO2インキュベータ内に約 3 時間静置し，細胞が基板上

に十分伸展したことを確認したうえで，経時観察を開始し

た．

２．２実験装置と方法

本研究に用いた実験装置の概略図を Fig. 2 に示す．観察

には，共焦点レーザ顕微鏡（A1R, ニコン）を用いた．蛍

光タンパク質 GFP および RFP の観察にあたり，それらを

励起するため，波長 = 488 nm および 561 nm のレーザを搭

載した．また，GFP および RFP に対する吸収フィルタを，

525/50 nm および 595/50 nm とし，二種類の蛍光を分離して

検出した．また，透過ユニット（transmitted detector）を通

して，微分干渉像を得た．観察には，開口数 1.40 の油浸

60 倍対物レンズ（CFI Plan Apo 60×）を用い，顕微鏡ステ

ージ用 CO2 インキュベータ内でサンプルの雰囲気を CO2

5%，37℃に保ちながら，細胞運動を観察した．

共焦点レーザ顕微鏡を用いた観察画像の取得方法を，

Fig. 3 に示す．観察の際は，ガラス基板直上の細胞底面近傍

において，蛍光ジキシン像に最も焦点が合う面を中心とし，

その上下各 0.6 m の範囲を 0.2 m 間隔で撮影し，7 枚のス

Fig. 2 Experimental setup for observing a cell expressing

GFP-actin and RFP-zyxin by laser confocal microscopy

Fig. 3 Schematics of image acquisition for a cell on a glass

substrate

実験力学 Vol. 16, No .2（2016 年 6 月）

155

- 53 -

3

ライス画像を取得した．これにかかるサンプルにレーザが

照射された時間は，約 10 秒であった．その後サンプルに

50 秒間レーザを照射せず，前スライス画像取得開始から 1

分後に，再度スライス画像を取得した．このように，1 分

間隔で 60 分間撮影することにより，微分干渉画像，蛍光ア

クチン画像，および蛍光ジキシン画像を取得した．取得画

像の大きさは 512×512 pixels であり，その解像度は 0.32

μm/pixel であった．なお，共焦点レーザ顕微鏡のレーザ強

度および検出器の増幅度は，細胞ごとに撮影直前に設定し，

その後撮影終了までそれらの値を一定とした．また，撮影

開始直後，および 60 分後の蛍光像を比較したところ，蛍光

の褪色は確認されなかった．

２．３画像処理方法

２．３．１蛍光アクチン画像の輪郭の抽出方法

アクチンタンパク質は，細胞質に広く分布するタンパク

質であり，細胞運動時には特に細胞膜直下に集合し，重合

する 7), 8)．そこで本研究では，共焦点レーザ顕微鏡によっ

て得られた蛍光アクチン画像から，Fig. 4 に示すようにそ

の輪郭を抽出することを試みた．各時間において，得られ

た 7 枚の蛍光アクチン画像（Fig. 4(a), left）に対し max

intensity projection (MIP)処理を施し，一枚の蛍光アクチン画

像を合成した（Fig. 4(a), right）．合成した MIP 画像は，輝

度値（intensity）0（黒色）から 4095（白色）までの，4096

階調グレイスケール画像であり，Fig. 4(b)にその輝度値ヒ

ストグラムを示す．なお，ヒストグラムを作成する際は，

4096 階調を 32 分割した．例えば，ヒストグラムの最も左

のビンは，画像において輝度値が 0 から 127 の範囲の値を

有するピクセルの数を表す．本研究において解析したすべ

ての蛍光アクチン画像において，その輝度値ヒストグラム

は Fig. 4(b)に示されるように，輝度値 0 近傍にピークを，

また輝度値 2000 近傍に比較的小さなピークを有した．前者

は画像背景部位を，後者は蛍光アクチンが分布する部位の

輝度値を示すと考えられた．そこで，Fig. 4(a)に示す MIP

画像に対し，Otsu の方法 9)により二値化したところ，閾値

(threshold)の輝度値が 1349 と求められた．これにより得ら

れた二値化画像を，Fig. 4(c)に表す．得られた画像に対し，

膨張，クロージング，収縮，および微小領域（例えば Fig. 4(c)，

赤点線丸）除去処理を行い，二値化画像の輪郭を抽出した．

その結果を Fig. 4(d)に示す．ここに，C は輪郭に囲まれる

領域の図心位置を表す．

得られた輪郭（Fig. 4(d)）を，Fig. 4(a)と同時に取得した

細胞の微分干渉像（differential interference contrast image:

DIC image）と比較した．その結果を Fig. 5 に示す．左図は

細胞の微分干渉像であり，右図はそれと輪郭を重ね合わせ

た図である．線維肉腫細胞では，微分干渉像から，細胞輪

郭に沿って主に 3 種類の構造が見られることが，目視より

確認された．すなわち，数m 以上の幅を有する比較的大

きな突起状の構造（赤矢印），細胞膜が幅広く薄く延びた

Fig. 4 Image processing for extracting outline from

fluorescent actin image

(a) Max intensity projection (MIP) image constructed

from 7 fluorescent sliced images

(b) Intensity histogram for MIP image in (a)

(c) Binarized image of MIP image in (a)

(d) Finally extracted outline with area centroid C

Fig. 5 DIC image of the cell and the extracted outline from the


構造（赤線に沿った部位），および 1m 程度の幅を有する

微小な突起構造（シアン矢印）である．この細胞輪郭を，

蛍光アクチン画像から抽出された輪郭と比較すると，赤色

で示した部位は輪郭が一致したものの，シアン色で示した

1m程度の細く微小な構造に沿った部位では輪郭は一致し

なかった．本研究において画像取得し解析したいずれの画

像においても，同様の結果であった．しかし次節以降にお

いて，抽出された輪郭に基づき，細胞の運動方向および細

胞底面の変化をマクロな観点から解析することをふまえる

と，シアン矢印で示した 1m 程度の幅を有する微小な突起

構造が解析に及ぼす影響は小さいと予想され，この構造に

沿って正確に輪郭が抽出される必要性は低いと考えられた．

そこで本研究では，蛍光アクチン画像から抽出された輪郭

を細胞輪郭，それに囲まれる領域を細胞底面と定義した．

２．３．２細胞運動方向の解析方法

各時間において，細胞底面の図心ベクトルCを，Eq. (1)

4

に基づき求めた．

C = 1

Amiri

i∑ (1)

ここに， miは時間 t における各ピクセルの輝度値であり，二値化画像においては，細胞底面は 1（白），その他の領域は 0（黒）である．また， r iは各ピクセルの座標である．Aは細胞底面の面積であり，Eq. (2)から得られる．

A = mii∑ (2)

時間 t1から t2の図心の移動ベクトルL を Eq. (3)から求め，

これを細胞運動ベクトルと定義した．

L =Ct2 −

Ct1 (3)

２．３．３細胞運動に伴う細胞底面の変化の解析方法

時間 t = t1から t = t2の細胞底面の変化を求めた．その解

析方法を Fig. 6に示す．時間 t = t1および t = t2の細胞輪郭

を重ね（Fig. 6, left），それぞれの細胞底面を比較したとき，t = t1の細胞底面から増加した領域，すなわち突出した領域

を赤で示し，減少した領域，すなわち退縮した領域を青で

示した（Fig. 6, middle）．ここに，Cは時間 t = t1における細

胞底面の図心であり，L は Eq. (3)から求められた細胞運動

Fig. 6 Difference in cell area between t = t1 and t = t2

ベクトルを表す．このとき，実際の運動ベクトルの大きさ

の 4倍に拡大して示した．また，細胞底面を分割して解析を行う場合は，図心 C を原点として細胞底面を 16 分割した（Fig. 6, right）．ここに，図における数字は，領域番号を表す．

２．３．４焦点接着斑の分布および時間変化の解析方法

ジキシンは，焦点接着斑を構成するタンパク質の一つで

ある 5）．そこで，蛍光ジキシンが局在する部位を，焦点接

着斑の位置とした．本研究では，Fig. 3 に示した方法により，共焦点レーザ顕微鏡によって 7枚の蛍光アクチン画像と同時に 7枚の蛍光ジキシン画像を取得した．それらを，max intensity projection処理し，一枚の蛍光ジキシン画像を合成した．次に，運動する線維肉腫細胞の焦点接着斑の分布および

時間変化を解析した．合成した蛍光ジキシン画像に対し，

メディアンフィルタ（3×3領域）を適用しゴマ塩状ノイズを除去した．フィルタ適用後の画像の輝度値ヒストグラム

を求め，その上位 0.5%の輝度値を閾値とし，二値化を行った．これにより抽出された構造のうち，明らかに細胞輪郭

外に存在するものを除去するとともに，細胞輪郭内に存在

するものについても，大きさが 3ピクセル以下のものはノイズと考え，4 ピクセル以上の連結した構造を接着班と定義し，焦点接着斑の数を数え，それらの細胞底面における

分布を求めた．また，時間 t = t1における蛍光ジキシン画像

に対して赤色の擬似カラーをつけ，時間 t = t2における蛍光

ジキシン画像に対して緑色の擬似カラーをつけ，それらの

蛍光ジキシン画像を重ねることにより，焦点接着斑の時間

変化の画像を得た．重ねた蛍光ジキシン画像において，黄

色で表された焦点接着斑は，時間 t1および t2において，そ

の位置が変化しなかったと判断した．なお，２．３．1節に示した細胞輪郭の抽出から２．３．４節に示した焦点接着班分布までの一連の解析には，MATLAB (MathWorks)によるオリジナルのプログラムを用いた．

３．実験結果

３．１細胞運動時の線維肉腫細胞の画像解析結果

本実験では，ガラス基板上の単一の線維肉腫細胞の様子

を 17 例観察した．それらのうち，細胞運動時の観察は 11例，細胞が１ヶ所に留まる停滞過程の観察は 6例あった．そこではじめに，本実験で撮影した細胞運動時の線維肉腫

細胞について，運動方向を転換した典型例の時間 t = 0 min, 20 min，および 40 minの画像を Fig. 7に示す．(a)は微分干

Fig. 7 Time-lapse images of HT1080 fibrosarcoma during cell movement

(a) Differential interface contrast images (b) GFP-actin images (c) RFP-zyxin images

菅原，渡辺，劉，武居：共焦点レーザ顕微鏡による線維肉腫細胞の運動に伴う焦点接着斑分布解析

156

- 54 -

3

ライス画像を取得した．これにかかるサンプルにレーザが

照射された時間は，約 10 秒であった．その後サンプルに

50 秒間レーザを照射せず，前スライス画像取得開始から 1

分後に，再度スライス画像を取得した．このように，1 分

間隔で 60 分間撮影することにより，微分干渉画像，蛍光ア

クチン画像，および蛍光ジキシン画像を取得した．取得画

像の大きさは 512×512 pixels であり，その解像度は 0.32

μm/pixel であった．なお，共焦点レーザ顕微鏡のレーザ強

度および検出器の増幅度は，細胞ごとに撮影直前に設定し，

その後撮影終了までそれらの値を一定とした．また，撮影

開始直後，および 60 分後の蛍光像を比較したところ，蛍光

の褪色は確認されなかった．

２．３画像処理方法

２．３．１蛍光アクチン画像の輪郭の抽出方法

アクチンタンパク質は，細胞質に広く分布するタンパク

質であり，細胞運動時には特に細胞膜直下に集合し，重合

する 7), 8)．そこで本研究では，共焦点レーザ顕微鏡によっ

て得られた蛍光アクチン画像から，Fig. 4 に示すようにそ

の輪郭を抽出することを試みた．各時間において，得られ

た 7 枚の蛍光アクチン画像（Fig. 4(a), left）に対し max

intensity projection (MIP)処理を施し，一枚の蛍光アクチン画

像を合成した（Fig. 4(a), right）．合成した MIP 画像は，輝

度値（intensity）0（黒色）から 4095（白色）までの，4096

階調グレイスケール画像であり，Fig. 4(b)にその輝度値ヒ

ストグラムを示す．なお，ヒストグラムを作成する際は，

4096 階調を 32 分割した．例えば，ヒストグラムの最も左

のビンは，画像において輝度値が 0 から 127 の範囲の値を

有するピクセルの数を表す．本研究において解析したすべ

ての蛍光アクチン画像において，その輝度値ヒストグラム

は Fig. 4(b)に示されるように，輝度値 0 近傍にピークを，

また輝度値 2000 近傍に比較的小さなピークを有した．前者

は画像背景部位を，後者は蛍光アクチンが分布する部位の

輝度値を示すと考えられた．そこで，Fig. 4(a)に示す MIP

画像に対し，Otsu の方法 9)により二値化したところ，閾値

(threshold)の輝度値が 1349 と求められた．これにより得ら

れた二値化画像を，Fig. 4(c)に表す．得られた画像に対し，

膨張，クロージング，収縮，および微小領域（例えば Fig. 4(c)，

赤点線丸）除去処理を行い，二値化画像の輪郭を抽出した．

その結果を Fig. 4(d)に示す．ここに，C は輪郭に囲まれる

領域の図心位置を表す．

得られた輪郭（Fig. 4(d)）を，Fig. 4(a)と同時に取得した

細胞の微分干渉像（differential interference contrast image:

DIC image）と比較した．その結果を Fig. 5 に示す．左図は

細胞の微分干渉像であり，右図はそれと輪郭を重ね合わせ

た図である．線維肉腫細胞では，微分干渉像から，細胞輪

郭に沿って主に 3 種類の構造が見られることが，目視より

確認された．すなわち，数m 以上の幅を有する比較的大

きな突起状の構造（赤矢印），細胞膜が幅広く薄く延びた

Fig. 4 Image processing for extracting outline from


(a) Max intensity projection (MIP) image constructed

from 7 fluorescent sliced images

(b) Intensity histogram for MIP image in (a)

(c) Binarized image of MIP image in (a)

(d) Finally extracted outline with area centroid C

Fig. 5 DIC image of the cell and the extracted outline from the


構造（赤線に沿った部位），および 1m 程度の幅を有する

微小な突起構造（シアン矢印）である．この細胞輪郭を，

蛍光アクチン画像から抽出された輪郭と比較すると，赤色

で示した部位は輪郭が一致したものの，シアン色で示した

1m程度の細く微小な構造に沿った部位では輪郭は一致し

なかった．本研究において画像取得し解析したいずれの画

像においても，同様の結果であった．しかし次節以降にお

いて，抽出された輪郭に基づき，細胞の運動方向および細

胞底面の変化をマクロな観点から解析することをふまえる

と，シアン矢印で示した 1m 程度の幅を有する微小な突起

構造が解析に及ぼす影響は小さいと予想され，この構造に

沿って正確に輪郭が抽出される必要性は低いと考えられた．

そこで本研究では，蛍光アクチン画像から抽出された輪郭

を細胞輪郭，それに囲まれる領域を細胞底面と定義した．

２．３．２細胞運動方向の解析方法

各時間において，細胞底面の図心ベクトルCを，Eq. (1)

4

に基づき求めた．

C = 1

Amiri

i∑ (1)

ここに， miは時間 t における各ピクセルの輝度値であり，二値化画像においては，細胞底面は 1（白），その他の領域は 0（黒）である．また， r iは各ピクセルの座標である．Aは細胞底面の面積であり，Eq. (2)から得られる．

A = mii∑ (2)

時間 t1から t2の図心の移動ベクトルL を Eq. (3)から求め，

これを細胞運動ベクトルと定義した．

L =Ct2 −

Ct1 (3)

２．３．３細胞運動に伴う細胞底面の変化の解析方法

時間 t = t1から t = t2の細胞底面の変化を求めた．その解

析方法を Fig. 6に示す．時間 t = t1および t = t2の細胞輪郭

を重ね（Fig. 6, left），それぞれの細胞底面を比較したとき，t = t1の細胞底面から増加した領域，すなわち突出した領域

を赤で示し，減少した領域，すなわち退縮した領域を青で

示した（Fig. 6, middle）．ここに，Cは時間 t = t1における細

胞底面の図心であり，L は Eq. (3)から求められた細胞運動

Fig. 6 Difference in cell area between t = t1 and t = t2

ベクトルを表す．このとき，実際の運動ベクトルの大きさ

の 4倍に拡大して示した．また，細胞底面を分割して解析を行う場合は，図心 C を原点として細胞底面を 16 分割した（Fig. 6, right）．ここに，図における数字は，領域番号を表す．

２．３．４焦点接着斑の分布および時間変化の解析方法

ジキシンは，焦点接着斑を構成するタンパク質の一つで

ある 5）．そこで，蛍光ジキシンが局在する部位を，焦点接

着斑の位置とした．本研究では，Fig. 3 に示した方法により，共焦点レーザ顕微鏡によって 7枚の蛍光アクチン画像と同時に 7枚の蛍光ジキシン画像を取得した．それらを，max intensity projection処理し，一枚の蛍光ジキシン画像を合成した．次に，運動する線維肉腫細胞の焦点接着斑の分布および

時間変化を解析した．合成した蛍光ジキシン画像に対し，

メディアンフィルタ（3×3領域）を適用しゴマ塩状ノイズを除去した．フィルタ適用後の画像の輝度値ヒストグラム

を求め，その上位 0.5%の輝度値を閾値とし，二値化を行った．これにより抽出された構造のうち，明らかに細胞輪郭

外に存在するものを除去するとともに，細胞輪郭内に存在

するものについても，大きさが 3ピクセル以下のものはノイズと考え，4 ピクセル以上の連結した構造を接着班と定義し，焦点接着斑の数を数え，それらの細胞底面における

分布を求めた．また，時間 t = t1における蛍光ジキシン画像

に対して赤色の擬似カラーをつけ，時間 t = t2における蛍光

ジキシン画像に対して緑色の擬似カラーをつけ，それらの

蛍光ジキシン画像を重ねることにより，焦点接着斑の時間

変化の画像を得た．重ねた蛍光ジキシン画像において，黄

色で表された焦点接着斑は，時間 t1および t2において，そ

の位置が変化しなかったと判断した．なお，２．３．1節に示した細胞輪郭の抽出から２．３．４節に示した焦点接着班分布までの一連の解析には，MATLAB (MathWorks)によるオリジナルのプログラムを用いた．

３．実験結果

３．１細胞運動時の線維肉腫細胞の画像解析結果

本実験では，ガラス基板上の単一の線維肉腫細胞の様子

を 17 例観察した．それらのうち，細胞運動時の観察は 11例，細胞が１ヶ所に留まる停滞過程の観察は 6例あった．そこではじめに，本実験で撮影した細胞運動時の線維肉腫

細胞について，運動方向を転換した典型例の時間 t = 0 min, 20 min，および 40 minの画像を Fig. 7に示す．(a)は微分干

Fig. 7 Time-lapse images of HT1080 fibrosarcoma during cell movement

(a) Differential interface contrast images (b) GFP-actin images (c) RFP-zyxin images

実験力学 Vol. 16, No .2（2016 年 6 月）

157

- 55 -

5

Fig. 8 Time sequence of outline of the cell

渉画像，(b)は蛍光アクチン画像，そして，(c)は蛍光ジキシ

ン画像である．また，蛍光アクチン画像から 6 分間隔で抽

出した細胞輪郭の時間変化を Fig. 8 に示す．この図より，

濃紺および青色の線で示した t = 0 minから12 minにかけて，

線維肉腫細胞は右方向へ運動し，青およびシアン色の線で

示した t = 12 min から 18 min では運動速度が小さく細胞は

停滞し，緑から赤色で示した t = 18 min から 42 min にかけ

て細胞は左方向へ運動した．そこで次に，線維肉腫細胞の

運動において，運動過程および運動停滞過程に分け，画像

解析結果を示す．

３．１．１運動過程における焦点接着斑の解析結果

前述の Fig. 8 に示した細胞輪郭の時間変化の中から t = 0

min から 12 min の運動過程を取り出した図を Fig. 9(a)に示

す．さらに詳細を検討するために，t = 0 min から 5 min の

細胞輪郭を抽出した図を Fig. 9(b)に示す．次に，異なる時

間における蛍光ジキシン画像の重ね合わせ図を Fig. 10 に

示す．Fig. 10(a)は，t1 = 0 min および t2 = 1 min の蛍光ジキ

シン像をそれぞれ赤色と緑色として重ね合わせた図，(b)

は t1 = 2 min および t2 = 3 min の蛍光ジキシン像をそれぞれ

赤色と緑色として重ね合わせた図，(c)は t1 = 4 min および

t2 = 5 min の蛍光ジキシン像をそれぞれ赤色と緑色として

重ね合わせた図である．これらの重ね合わせ図において，

二枚の画像の蛍光ジキシンの位置が重なる部分は黄色で表

される．

Fig. 9(b)に示す t = 0 min から 5 min の細胞輪郭の時間変

化に表される細胞運動においては，Fig. 10 に示す蛍光ジキ

シン画像のように，焦点接着斑が分布する領域としない領

域があり，その分布に偏りがみられた．そこで，細胞底面

の変化および焦点接着斑の分布に対し，さらに詳細な解析

を行った．t1 = 0 min から t2 = 5 min の細胞運動に伴う細胞

底面の変化および細胞運動ベクトルを Fig. 11(a)に，16 分割

した細胞の各領域に存在する焦点接着斑の数を Fig. 11 (b)

に示す．なお，Fig. 11(a)における数字は，16 分割した細胞

の領域番号を表す．Fig. 11(a)に示すように，細胞底面が増

大すなわち突出した領域（赤色）と，減少すなわち退縮し

た領域（青色）には偏りが見られた．このとき，Fig. 11(b)

に示すように，t1 = 0 min および t2 = 5 min のいずれの時間

Fig. 9 Time sequence of outline of the cell during movement

(a) Outlines of the cell from t1 = 0 min to t2 = 12 min

(b) Outlines of the cell from t1 = 0 min to t2 = 5 min

Fig. 10 Merged images of RFP-zyxin during cell movement

(a) Red: t1 = 0 min; green: t2 = 1 min

(b) Red: t1 = 2 min; green: t2 = 3 min

(c) Red: t1 = 4 min; green: t2 = 5 min

Fig. 11 Differences in cell region and distribution of focal

adhesion between t1 = 0 min and t2 = 5 min

(a) Difference in cell region

(b) Distribution of focal adhesion

においても，焦点接着斑の数は，領域 1, 5, 11, 16 において

その隣接領域よりも多く分布した．これらの領域は，Fig.

11(a)における赤色の突出した領域と一致した．以上より，

細胞の運動過程では，焦点接着斑の分布に偏りがみられ，

細胞底面が増大，すなわち突出した領域に，焦点接着斑が

より多く分布することがわかった．

次に，焦点接着斑の分布の時間変化を調べた．Fig. 10 の

蛍光ジキシン画像の重ね合わせにおいて，緑色で示される

焦点接着斑は新たに出現したもの，黄色で示される焦点接

着斑は位置を変化させなかったもの，そして赤色で示され

る焦点接着斑は時間経過に伴い消滅したものである．図よ

6

り，位置に変化がみられなかった黄色で示される焦点接着

斑が概して多く分布するものの，一部の領域においては緑

色や赤色で示される出現ないしは消滅した焦点接着斑も見

られた．そこで，焦点接着斑の分布の変化を詳細に調べる

ために，細胞底面を 16 分割し，各領域において細胞底面の

変化と焦点接着斑の数の変化を求めた．t1 = 0 minから t2 = 1

min における変化を Fig. 12(a)に，t1 = 4 min から t2 = 5 min

における変化を Fig. 12(b)に示す．Fig. 12(a)に示す t1 = 0 min

から t2 = 1 min では，左の図より，赤色で示される細胞が突

出した領域が複数存在した．各領域における面積変化を示

すグラフから，領域 1, 5, 11, 13~16 において細胞底面が増

大したことが確認された．このとき，細胞底面が増大する

領域では，焦点接着斑の数が増加した．また，それとは反

対に減少する領域 2, 3, 7, 8, 9, および 12 では，焦点接着斑

の数も減少した．Fig. 12(b)に示す t1 = 4 min から t2 = 5 min

でも同様に，細胞底面の増大が顕著な領域 1 および 16 では

焦点接着斑の数が増加し，減少する領域 5 から 9 の範囲で

は，焦点接着斑の数が減少ないしは変化がみられなかった．

前述の細胞運動方向と焦点接着班の数の変化の関係は，

線維芽細胞のように方向性を有し運動する細胞の進行方向

前方において，突出膜の広がりに伴い新たな接着班が頻繁

に形成され 10)，後方では退縮に伴い接着班が消失する結果

と同様であった．従って，線維肉腫細胞のように様々な方

向に頻繁に進行方向を変化させる細胞においても，一方向

に進行する時間のみを抽出した場合に，細胞運動方向と接

着班分布の傾向は，線維芽細胞と同じであるといえた．

同様の運動過程を示す他の例として，前述の Fig. 8 に示

した細胞輪郭の時間変化の中から，t = 18 min から 42 min

Fig. 12 Difference in area and difference in number of focal

adhesions between two time series in each region

(a) Difference between t1 = 0 min and t2 = 1 min

(b) Difference between t1 = 4 min and t2 = 5 min

Fig. 13 Time sequence of outline of the cell during cell

movement

(a) Movement from t = 18 min to 42 min

(b) Movement from t = 22 min to 26 min

Fig. 14 Merged images of RFP-zyxin at t = t1 and t = t2 during

cell movement



にも着目した．その運動過程を取り出した図を Fig. 13(a)

に示す．さらに詳細を検討するために，t = 22 min から 26

min の細胞輪郭を重ねた図を Fig. 13(b)に示す．次に，前述

の Fig. 7(c)の蛍光ジキシン画像に対し，焦点接着斑分布の

時間変化画像を求めた．その結果を Fig. 14 に示す．Fig.

14(a)は，t1 = 22 min における蛍光ジキシン画像を赤色， t2 =

24 minにおける蛍光ジキシン画像を緑色として重ね合わせ

た図であり，Fig. 14(b)は t1 = 24 min における画像を赤色，

t2 = 26 min における画像を緑色として重ね合わせた図であ

る．また，細胞底面の増減を示す図を，それぞれの蛍光ジ

キシン重ね合わせ画像の下に示す．

Fig. 14(a)および(b)のどちらにおいても，細胞底面が増加

した領域 A と B では，蛍光ジキシン画像の重ね合わせにお

いて緑色で示されるように，新しい焦点接着斑が出現した．

これに対して細胞底面が減少した領域 C と D では，t = t1

の時点で焦点接着斑はほとんど存在せず，退縮した後の t =

t2においても，新たな焦点接着斑は出現しなかった．また，


158

- 56 -

5

Fig. 8 Time sequence of outline of the cell

渉画像，(b)は蛍光アクチン画像，そして，(c)は蛍光ジキシ

ン画像である．また，蛍光アクチン画像から 6 分間隔で抽

出した細胞輪郭の時間変化を Fig. 8 に示す．この図より，

濃紺および青色の線で示した t = 0 minから12 minにかけて，

線維肉腫細胞は右方向へ運動し，青およびシアン色の線で

示した t = 12 min から 18 min では運動速度が小さく細胞は

停滞し，緑から赤色で示した t = 18 min から 42 min にかけ

て細胞は左方向へ運動した．そこで次に，線維肉腫細胞の

運動において，運動過程および運動停滞過程に分け，画像

解析結果を示す．

３．１．１運動過程における焦点接着斑の解析結果

前述の Fig. 8 に示した細胞輪郭の時間変化の中から t = 0

min から 12 min の運動過程を取り出した図を Fig. 9(a)に示

す．さらに詳細を検討するために，t = 0 min から 5 min の

細胞輪郭を抽出した図を Fig. 9(b)に示す．次に，異なる時

間における蛍光ジキシン画像の重ね合わせ図を Fig. 10 に

示す．Fig. 10(a)は，t1 = 0 min および t2 = 1 min の蛍光ジキ

シン像をそれぞれ赤色と緑色として重ね合わせた図，(b)

は t1 = 2 min および t2 = 3 min の蛍光ジキシン像をそれぞれ

赤色と緑色として重ね合わせた図，(c)は t1 = 4 min および

t2 = 5 min の蛍光ジキシン像をそれぞれ赤色と緑色として

重ね合わせた図である．これらの重ね合わせ図において，

二枚の画像の蛍光ジキシンの位置が重なる部分は黄色で表

される．

Fig. 9(b)に示す t = 0 min から 5 min の細胞輪郭の時間変

化に表される細胞運動においては，Fig. 10 に示す蛍光ジキ

シン画像のように，焦点接着斑が分布する領域としない領

域があり，その分布に偏りがみられた．そこで，細胞底面

の変化および焦点接着斑の分布に対し，さらに詳細な解析

を行った．t1 = 0 min から t2 = 5 min の細胞運動に伴う細胞

底面の変化および細胞運動ベクトルを Fig. 11(a)に，16 分割

した細胞の各領域に存在する焦点接着斑の数を Fig. 11 (b)

に示す．なお，Fig. 11(a)における数字は，16 分割した細胞

の領域番号を表す．Fig. 11(a)に示すように，細胞底面が増

大すなわち突出した領域（赤色）と，減少すなわち退縮し

た領域（青色）には偏りが見られた．このとき，Fig. 11(b)

に示すように，t1 = 0 min および t2 = 5 min のいずれの時間

Fig. 9 Time sequence of outline of the cell during movement

(a) Outlines of the cell from t1 = 0 min to t2 = 12 min

(b) Outlines of the cell from t1 = 0 min to t2 = 5 min

Fig. 10 Merged images of RFP-zyxin during cell movement



(c) Red: t1 = 4 min; green: t2 = 5 min





においても，焦点接着斑の数は，領域 1, 5, 11, 16 において

その隣接領域よりも多く分布した．これらの領域は，Fig.

11(a)における赤色の突出した領域と一致した．以上より，

細胞の運動過程では，焦点接着斑の分布に偏りがみられ，

細胞底面が増大，すなわち突出した領域に，焦点接着斑が

より多く分布することがわかった．

次に，焦点接着斑の分布の時間変化を調べた．Fig. 10 の

蛍光ジキシン画像の重ね合わせにおいて，緑色で示される

焦点接着斑は新たに出現したもの，黄色で示される焦点接

着斑は位置を変化させなかったもの，そして赤色で示され

る焦点接着斑は時間経過に伴い消滅したものである．図よ

6

り，位置に変化がみられなかった黄色で示される焦点接着

斑が概して多く分布するものの，一部の領域においては緑

色や赤色で示される出現ないしは消滅した焦点接着斑も見

られた．そこで，焦点接着斑の分布の変化を詳細に調べる

ために，細胞底面を 16 分割し，各領域において細胞底面の

変化と焦点接着斑の数の変化を求めた．t1 = 0 minから t2 = 1

min における変化を Fig. 12(a)に，t1 = 4 min から t2 = 5 min

における変化を Fig. 12(b)に示す．Fig. 12(a)に示す t1 = 0 min

から t2 = 1 min では，左の図より，赤色で示される細胞が突

出した領域が複数存在した．各領域における面積変化を示

すグラフから，領域 1, 5, 11, 13~16 において細胞底面が増

大したことが確認された．このとき，細胞底面が増大する

領域では，焦点接着斑の数が増加した．また，それとは反

対に減少する領域 2, 3, 7, 8, 9, および 12 では，焦点接着斑

の数も減少した．Fig. 12(b)に示す t1 = 4 min から t2 = 5 min

でも同様に，細胞底面の増大が顕著な領域 1 および 16 では

焦点接着斑の数が増加し，減少する領域 5 から 9 の範囲で

は，焦点接着斑の数が減少ないしは変化がみられなかった．

前述の細胞運動方向と焦点接着班の数の変化の関係は，

線維芽細胞のように方向性を有し運動する細胞の進行方向

前方において，突出膜の広がりに伴い新たな接着班が頻繁

に形成され 10)，後方では退縮に伴い接着班が消失する結果

と同様であった．従って，線維肉腫細胞のように様々な方

向に頻繁に進行方向を変化させる細胞においても，一方向

に進行する時間のみを抽出した場合に，細胞運動方向と接

着班分布の傾向は，線維芽細胞と同じであるといえた．

同様の運動過程を示す他の例として，前述の Fig. 8 に示

した細胞輪郭の時間変化の中から，t = 18 min から 42 min

Fig. 12 Difference in area and difference in number of focal

adhesions between two time series in each region

(a) Difference between t1 = 0 min and t2 = 1 min

(b) Difference between t1 = 4 min and t2 = 5 min

Fig. 13 Time sequence of outline of the cell during cell

movement

(a) Movement from t = 18 min to 42 min

(b) Movement from t = 22 min to 26 min


cell movement



にも着目した．その運動過程を取り出した図を Fig. 13(a)

に示す．さらに詳細を検討するために，t = 22 min から 26

min の細胞輪郭を重ねた図を Fig. 13(b)に示す．次に，前述

の Fig. 7(c)の蛍光ジキシン画像に対し，焦点接着斑分布の

時間変化画像を求めた．その結果を Fig. 14 に示す．Fig.

14(a)は，t1 = 22 min における蛍光ジキシン画像を赤色， t2 =


た図であり，Fig. 14(b)は t1 = 24 min における画像を赤色，

t2 = 26 min における画像を緑色として重ね合わせた図であ

る．また，細胞底面の増減を示す図を，それぞれの蛍光ジ

キシン重ね合わせ画像の下に示す．

Fig. 14(a)および(b)のどちらにおいても，細胞底面が増加

した領域 A と B では，蛍光ジキシン画像の重ね合わせにお

いて緑色で示されるように，新しい焦点接着斑が出現した．

これに対して細胞底面が減少した領域 C と D では，t = t1

の時点で焦点接着斑はほとんど存在せず，退縮した後の t =

t2においても，新たな焦点接着斑は出現しなかった．また，

実験力学 Vol. 16, No .2（2016 年 6 月）

159

- 57 -

7

この例においても前述の運動過程の解析結果と同様に，細

胞底面に対して焦点接着斑の分布に偏りがあり，領域 A と

B では焦点接着斑が多く出現する一方，領域 C と D では出

現がみられなかった．前述の Fig. 12 の結果と比較すると，

細胞底面が増加する領域では共通して焦点接着班の数が増

加した．これに対し，細胞底面が減少する領域では，Fig. 12

では焦点接着班の数が減少ないしは変化がなかったが，

Fig. 14 の結果では，焦点接着班の数に変化がなかったこと

のみが確認された．これらの結果から，細胞がその底面を

増加させ任意の方向に運動する際は，運動方向前方におけ

る新たな焦点接着班の形成が重要であると示唆された．こ

の結果は，線維芽細胞において提唱された，”front-towing

mechanism”，すなわち細胞が運動する際に前方で接着班形

成に伴い強い突出力が働くメカニズム 11)が，線維肉腫細胞

においても任意方向への運動において同様に重要であるこ

とを示す結果と考えられた．

３．１．２運動停滞過程における焦点接着斑の解析結果

前述の Fig. 8 で示した細胞輪郭の時間変化の中から t =

13 min から 15 min における，運動が停滞した過程を取り出

し細胞輪郭を重ねた図を Fig. 15 に示す．この過程では，線

維肉腫細胞において運動はほとんど見られなかった．次に，

前述の Fig. 7 の蛍光ジキシン画像に対し，焦点接着斑分布

の時間変化画像を求めた．その結果を Fig. 16 に示す．Fig.

16(a)は， t1 = 12 min における蛍光ジキシン画像を赤色，t2 =


た図であり，(b)は t1 = 13 min における画像を赤色，t2 = 14

min における画像を緑色として重ね合わせた図である．こ

Fig. 15 Time sequence of outline of the cell during cell staying


cell staying



の図にみられるように，細胞運動が停滞した過程では，黄

色で示される焦点接着斑が細胞底面全体にわたり多く分布

し，すなわち焦点接着斑の位置に変化が見られなかった．

３．２運動停滞過程の線維肉腫細胞の画像解析結果

本実験で撮影した線維肉腫細胞において，運動が停滞し

た細胞の典型例について，時間 t = 0 min, 30 min, および 60

minに撮影された画像を Fig. 17に示す．(a)は微分干渉画像，

(b)は蛍光アクチン画像，(c)は蛍光ジキシン画像である．こ

のとき，t = 40 min から 60 min における細胞輪郭を抽出し

重ねて描画した画像を Fig. 18(a)に示し，さらに運動停滞過

程を詳細に解析するために，t = 49 min から 55 min におけ

る細胞輪郭を抽出し重ねた図を Fig. 18(b)に示す．次に，Fig.

17(c)の蛍光ジキシン画像から，焦点接着斑分布の時間変化

画像を Fig. 19 に示す．Fig. 19(a) は，t1 = 49 min における

蛍光ジキシン画像を赤色，t2 = 52 min における蛍光ジキシ

ン画像を緑色として重ね合わせた図であり，(b)は t1 = 52

min

Fig. 17 Time-lapse images of HT1080 fibrosarcoma during cell

staying

(a) Differential interface contrast images

(b) GFP-actin images

(c) RFP-zyxin images


8

Fig. 19 Merged images of RFP-zyxin during cell staying







における画像を赤色，t2 = 55 min における画像を緑色とし

て重ね合わせた図である．

Fig. 18(b)より，t = 49 min から 55 min において細胞輪郭

が重なり，すなわち細胞運動は停滞し，その時の焦点接着

斑分布は，Fig. 19(a)および(b)のいずれにおいても，細胞輪

郭近傍に偏りなく均一に分布した．また，Fig. 19 において

黄色で示される焦点接着斑が高い割合で存在した．すなわ

ち，焦点接着斑の位置に変化がみられなかった．細胞底面

の変化と焦点接着斑分布をさらに詳細に調べるために，t1 =

49 min から t2 = 52 min までの細胞底面の変化を求め，Fig.

20(a)に表す．また，細胞底面を 16 分割し，各領域に存在

する焦点接着斑の数を，Fig. 20(b)に示す． Fig. 20(a)より，

細胞底面において増加および減少する領域が，細胞輪郭に

沿って交互に現れた．これは，Fig. 11 および Fig. 14 に示し

た，運動過程において細胞輪郭が増加および減少する領域

に偏りがある結果とは異なった．また，16 分割した各領域

における焦点接着斑の分布についても，運動過程における

それを示した Fig. 11(b)では偏りがみられたのに対し，Fig.

20(b)では，t1 = 49 min および t2 = 52 min のいずれにおいて

も偏りはみられず，各領域に存在した．

Fig. 17 に示す細胞は，前節の Fig. 16 に示す細胞，すなわ

ち細胞運動途中の運動停滞過程における細胞の焦点接着班

と同様に，偏りのない分布を示した．しかし，前節に示し

た細胞は，焦点接着班が偏りのない分布を示し運動が停滞

した後に細胞運動過程に移行したのに対し，本節に示した

細胞は，少なくとも 60 分間運動する様子が見られなかった．

従って，細胞が停滞から運動に移行するには，焦点接着班

の分布のみならず，焦点接着班−ガラス基板間の接着の強固

さの度合い，また焦点接着班とそれにつながる細胞骨格の

相互作用といった，他の要因があると予想される．今後は，

線維肉腫細胞における細胞運動メカニズムのさらなる解明

にあたり，焦点接着班の分子機構の観点からの研究が重要

であると考えられる．

４．結言

本研究では，線維肉腫細胞において蛍光アクチンと蛍光

ジキシンを発現させ，共焦点レーザ顕微鏡で経時観察し，

細胞運動時の焦点接着斑分布を解析した．その結果，次の

ことが明らかとなった．

(1) 細胞運動する線維肉腫細胞の場合，細胞底面における

焦点接着斑の分布に偏りがみられた．また，細胞の突

出に伴い新しい焦点接着斑が出現するが，退縮の際，

焦点接着斑は減少ないしは変化がみられなかった．

(2) 運動停滞過程における線維肉腫細胞の場合，焦点接着

斑の分布に偏りがなかった．

参考文献

1) Purves, D., Lichtman, J. W.: Principles of Neural Development,

Sinauer, Sunderland, MA (1985), 81-103. 2) Friedl, P., Weigelin, B.: Interstitial Leukocyte Migration and

Immune Function, Nature Immun. 9 (2008), 960-969.

3) Singer, A. J., Clark, R. A. F.: Cutaneous Wound Healing, N. Eng. J. Med, 341 (1999), 738-746.

4) Alberts, B., et al.: Molecular Biology of the Cell, Newton Press, NY

(2004), 972. 5) Kanchanawong, P., Shtengel, G., Pasapera, A. M., Ramko, E. B.,

Davidson, M. W., Hess, H. F.: Nanoscale architecture of

integrin-based cell adhesions, Nature 468 (2010), 580-586. 6) Jones, P. A., Neustem, H. B., Gonzales, F., Bogenman, E.: Invasion

of an artificial blood vessel wall by human fibrosarcoma cells.

Cancer Res. 41 (1981), 4813-4817. 7) Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D.: Molecular

Mechanisms Controlling Actin Filament Dynamics in Nonmuscle

Cells, Ann. Rev. Biophy. Biomol. Struct. 29 (2000), 545-576. 8) Small, J. V., Rottner, K., Karverna, I., Anderson, K. I.: Assembling

an Actin Cytoskeleton for Cell Attachment and Movement,

Biochimica. et. Biophysica. Acta. 1404 (1998), 271-281. 9) Otsu, N.: A Threshold Selection Method from Gray-Level

Histograms, IEEE Trans. SMC, 9 (1979), 62-66.

10) Webb, D. J., Parsons, J. T., Horwitz, A. F.: Adhesion assembly, disassembly and turnover in migrating cells – over and over and

over again, Nat. Cell Biol. 4 (2002), E97-E100.

11) Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M.: Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts, Biophys. J.

80 (2001), 1744-1757.


160

- 58 -

7

この例においても前述の運動過程の解析結果と同様に，細

胞底面に対して焦点接着斑の分布に偏りがあり，領域 A と

B では焦点接着斑が多く出現する一方，領域 C と D では出

現がみられなかった．前述の Fig. 12 の結果と比較すると，

細胞底面が増加する領域では共通して焦点接着班の数が増

加した．これに対し，細胞底面が減少する領域では，Fig. 12

では焦点接着班の数が減少ないしは変化がなかったが，

Fig. 14 の結果では，焦点接着班の数に変化がなかったこと

のみが確認された．これらの結果から，細胞がその底面を

増加させ任意の方向に運動する際は，運動方向前方におけ

る新たな焦点接着班の形成が重要であると示唆された．こ

の結果は，線維芽細胞において提唱された，”front-towing

mechanism”，すなわち細胞が運動する際に前方で接着班形

成に伴い強い突出力が働くメカニズム 11)が，線維肉腫細胞

においても任意方向への運動において同様に重要であるこ

とを示す結果と考えられた．

３．１．２運動停滞過程における焦点接着斑の解析結果

前述の Fig. 8 で示した細胞輪郭の時間変化の中から t =

13 min から 15 min における，運動が停滞した過程を取り出

し細胞輪郭を重ねた図を Fig. 15 に示す．この過程では，線

維肉腫細胞において運動はほとんど見られなかった．次に，

前述の Fig. 7 の蛍光ジキシン画像に対し，焦点接着斑分布

の時間変化画像を求めた．その結果を Fig. 16 に示す．Fig.

16(a)は， t1 = 12 min における蛍光ジキシン画像を赤色，t2 =


た図であり，(b)は t1 = 13 min における画像を赤色，t2 = 14

min における画像を緑色として重ね合わせた図である．こ



cell staying



の図にみられるように，細胞運動が停滞した過程では，黄

色で示される焦点接着斑が細胞底面全体にわたり多く分布

し，すなわち焦点接着斑の位置に変化が見られなかった．

３．２運動停滞過程の線維肉腫細胞の画像解析結果

本実験で撮影した線維肉腫細胞において，運動が停滞し

た細胞の典型例について，時間 t = 0 min, 30 min, および 60

minに撮影された画像を Fig. 17に示す．(a)は微分干渉画像，

(b)は蛍光アクチン画像，(c)は蛍光ジキシン画像である．こ

のとき，t = 40 min から 60 min における細胞輪郭を抽出し

重ねて描画した画像を Fig. 18(a)に示し，さらに運動停滞過

程を詳細に解析するために，t = 49 min から 55 min におけ

る細胞輪郭を抽出し重ねた図を Fig. 18(b)に示す．次に，Fig.

17(c)の蛍光ジキシン画像から，焦点接着斑分布の時間変化

画像を Fig. 19 に示す．Fig. 19(a) は，t1 = 49 min における

蛍光ジキシン画像を赤色，t2 = 52 min における蛍光ジキシ

ン画像を緑色として重ね合わせた図であり，(b)は t1 = 52

min

Fig. 17 Time-lapse images of HT1080 fibrosarcoma during cell

staying

(a) Differential interface contrast images

(b) GFP-actin images

(c) RFP-zyxin images


8

Fig. 19 Merged images of RFP-zyxin during cell staying







における画像を赤色，t2 = 55 min における画像を緑色とし

て重ね合わせた図である．

Fig. 18(b)より，t = 49 min から 55 min において細胞輪郭

が重なり，すなわち細胞運動は停滞し，その時の焦点接着

斑分布は，Fig. 19(a)および(b)のいずれにおいても，細胞輪

郭近傍に偏りなく均一に分布した．また，Fig. 19 において

黄色で示される焦点接着斑が高い割合で存在した．すなわ

ち，焦点接着斑の位置に変化がみられなかった．細胞底面

の変化と焦点接着斑分布をさらに詳細に調べるために，t1 =

49 min から t2 = 52 min までの細胞底面の変化を求め，Fig.

20(a)に表す．また，細胞底面を 16 分割し，各領域に存在

する焦点接着斑の数を，Fig. 20(b)に示す． Fig. 20(a)より，

細胞底面において増加および減少する領域が，細胞輪郭に

沿って交互に現れた．これは，Fig. 11 および Fig. 14 に示し

た，運動過程において細胞輪郭が増加および減少する領域

に偏りがある結果とは異なった．また，16 分割した各領域

における焦点接着斑の分布についても，運動過程における

それを示した Fig. 11(b)では偏りがみられたのに対し，Fig.

20(b)では，t1 = 49 min および t2 = 52 min のいずれにおいて

も偏りはみられず，各領域に存在した．

Fig. 17 に示す細胞は，前節の Fig. 16 に示す細胞，すなわ

ち細胞運動途中の運動停滞過程における細胞の焦点接着班

と同様に，偏りのない分布を示した．しかし，前節に示し

た細胞は，焦点接着班が偏りのない分布を示し運動が停滞

した後に細胞運動過程に移行したのに対し，本節に示した

細胞は，少なくとも 60 分間運動する様子が見られなかった．

従って，細胞が停滞から運動に移行するには，焦点接着班

の分布のみならず，焦点接着班−ガラス基板間の接着の強固

さの度合い，また焦点接着班とそれにつながる細胞骨格の

相互作用といった，他の要因があると予想される．今後は，

線維肉腫細胞における細胞運動メカニズムのさらなる解明

にあたり，焦点接着班の分子機構の観点からの研究が重要

であると考えられる．

４．結言

本研究では，線維肉腫細胞において蛍光アクチンと蛍光

ジキシンを発現させ，共焦点レーザ顕微鏡で経時観察し，

細胞運動時の焦点接着斑分布を解析した．その結果，次の

ことが明らかとなった．

(1) 細胞運動する線維肉腫細胞の場合，細胞底面における

焦点接着斑の分布に偏りがみられた．また，細胞の突

出に伴い新しい焦点接着斑が出現するが，退縮の際，

焦点接着斑は減少ないしは変化がみられなかった．

(2) 運動停滞過程における線維肉腫細胞の場合，焦点接着

斑の分布に偏りがなかった．

参考文献

1) Purves, D., Lichtman, J. W.: Principles of Neural Development,

Sinauer, Sunderland, MA (1985), 81-103. 2) Friedl, P., Weigelin, B.: Interstitial Leukocyte Migration and

Immune Function, Nature Immun. 9 (2008), 960-969.

3) Singer, A. J., Clark, R. A. F.: Cutaneous Wound Healing, N. Eng. J. Med, 341 (1999), 738-746.

4) Alberts, B., et al.: Molecular Biology of the Cell, Newton Press, NY

(2004), 972. 5) Kanchanawong, P., Shtengel, G., Pasapera, A. M., Ramko, E. B.,

Davidson, M. W., Hess, H. F.: Nanoscale architecture of

integrin-based cell adhesions, Nature 468 (2010), 580-586. 6) Jones, P. A., Neustem, H. B., Gonzales, F., Bogenman, E.: Invasion

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Biochimica. et. Biophysica. Acta. 1404 (1998), 271-281. 9) Otsu, N.: A Threshold Selection Method from Gray-Level

Histograms, IEEE Trans. SMC, 9 (1979), 62-66.

10) Webb, D. J., Parsons, J. T., Horwitz, A. F.: Adhesion assembly, disassembly and turnover in migrating cells – over and over and

over again, Nat. Cell Biol. 4 (2002), E97-E100.

11) Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M.: Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts, Biophys. J.

80 (2001), 1744-1757.

実験力学 Vol. 16, No .2（2016 年 6 月）

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