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- II -
Tag der mündlichen Prüfung: 27.07.2012
Gutachter:
Prof. Dr.-Ing. Bernd Niemeyer
Helmut-Schmidt-Universität / Universität der Bundeswehr Hamburg
Prof. Dr. rer. nat. Andreas Prange
Universität Hamburg
- III -
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juni 2007 bis März 2011 im Helmholtz-
Zentrum Geesthacht Zentrum für Material- und Küstenforschung angefertigt.
Ich möchte besonders Prof. Dr.-Ing. Bernd Niemeyer für die Bereitstellung des
interessanten Themas, für die sehr guten Bedingungen im Labor sowie für die
wissenschaftliche Betreuung und vielfältigen Diskussionen danken.
Herrn Prof. Dr. Andreas Prange danke ich für die Anfertigung des Zweitgutachtens.
Besonders möchte ich mich bei Dr.-Ing. Henning Rosenfeld für die vielfältige
Betreuung und der großen Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit bedanken.
Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern in Geesthacht danke ich für die sehr gute
Zusammenarbeit. Mein besonderer Dank gilt Rainer Jablonski für die Hilfe im Labor,
Dr. Jürgen Gandraß und Stephan Lassen für die Hilfe an verschiedenen Massen-
spektrometern. Des Weiteren danke ich Sven Reinecke, der im Rahmen seiner
Diplom- und Studienarbeit zu dieser Dissertation beigetragen hat.
Dr. Simone Hubo, Cristiam Vargas und Moundih Fonka von der Helmut-Schmidt-Uni-
versität / Universität der Bundeswehr Hamburg danke für die sehr gute Zusammen-
arbeit.
Bei Annika, Britta, Dana, Jan-Henrik, Mechthild, Nadine und Sven möchte ich mich für
die schöne Zeit außerhalb des Laboralltages bedanken.
Meinen Eltern und meiner Familie möchte ich für die stetige Unterstützung danken.
Danijela, du bist einfach ein wunderbarer Mensch.
- IV -
Abkürzungs- und Symbolverzeichnis - V -
Abkürzungsverzeichnis
4-MeBT 4-Methyl-1H-benzotriazol
5-MeBT 5-Methyl-1H-benzotriazol
AAL Aleuria Aurantia Lektin
ABA m-Aminophenylboronsäure
Abb. Abbildung
Aeats 1-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilan
amu atomare Masseneinheit
APS-Silica mit Aptes silanisiertes Silica
Aptes Aminopropyltriethoxysilan
ASF Asialofetuin
BFD Benzoylformiatdecarboxylase
BSA Bovines Serumalbumin
BT 1H-Benzotriazol
ca. circa
Con A Concanavalin A bzw. Concanavalin Agglutinin
cps counts per second (Einheit der Intensität der dargestellten Massenspektren)
d Dublett (NMR)
Da Dalton
DC Dünnschichtchromatographie
dd Dublett von Dublett (NMR)
DMF Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
DMSO-D6 Deuteriertes Dimethylsulfoxid für die NMR-Spektroskopie
DTT Dithiothreitol
EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
ELLA Enzyme-linked Lectin Assay
ESI Elektrospray Ionisation
et al. et alii
GHS Globally Harmonized System of Classification, Labelling and Packaging of Chemicals (Global harmonisiertes System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien)
GOD Glucose Oxidase
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
IAA Iodoacetic acid (Iodessigsäure)
IFC integrated micro-fluidic cartridge (Fließsystem im Biacore 3000)
IPG immobilisierter pH-Gradient
IS interner Standard
LC/MS Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie
LC-TBL triazinbasierter Ligand für die Adsorption von Benzotriazolen
m Multiplett (NMR)
m/z Masse-zu-Ladungsverhältnis
MALDI Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation
Man Mannose
MOPAC Molecular Orbital Package
MRM Multiple Reaction Monitoring (Scan-Modus in der Massenspektrometrie)
MS Massenspektrometrie
MWCO Molecular Weight Cut Off (Membrandurchlässigkeit für Proteine)
n.d. nicht durchgeführt
Abkürzungs- und Symbolverzeichnis - VI -
n.n. nicht nachweisbar
NH2-TBL aminofunktionalisierter triazinbasierter Ligand
NHS N-Hydroxysuccinimid
NMR Nuclear Magnetic Resonance (Kernmagnetische Resonanz)
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PDB Protein Data Base
ppb parts per billion
ppm parts per million
ppt parts per trillion
q Quartett (NMR)
quint Quintett (NMR)
RCA Ricinus Communis Agglutinin
rel. relativ
Rf-Wert Retentionsfaktor-Wert
RT Raumtemperatur
RU Resonance Units (Resonanzeinheiten)
Rx organischer Rest eines Moleküls
SAM Self Assembled Monolayer (Selbstorganisierende Monoschicht)
SDS Sodium dodecylsulfate (Natriumdodecylsulfat)
SPR Surface Plasmon Resonance (Oberflächenplasmonresonanz)
t Triplett (NMR)
TBL triazinbasierter Ligand
TG Thyroglobulin
TOF Time of Flight (Flugzeit)
TPP Thiaminpyrophosphat
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Symbolverzeichnis
[A] Konzentration des Analyten
[L] Konzentration des Liganden
[LA] Konzentration des Ligand-Zielmolekül-Komplexes
GB geschätzte freie Bindungsenergie
A Enzymaktivität [U/mL]
ABFD Flächenbedarf BFD [nm2]
AO Oberflächenbelegung [µmol/m2]
AV volumenunabhängige Enzymaktivität [U/mg]
C Konzentration [M] = [mol/L]
CProtein Proteinkonzentration [mg/mL]
d Küvettenschichtdicke [cm]
dSub Abstand Substituenten [Å]
J Kopplungskonstante [Hz]
KA Assoziationskonstante [L/mol]
ka, kd Geschwindigkeitskonstante für die Hin- und Rückreaktion
Ka-ester Säurekonstante eines Boronsäureesters
Ka-säure Säurekonstante einer Boronsäure
KD Dissoziationskonstante [mol/L]
Keq Kombination von Ktrigonal und Ktetraedrisch
Ktetraedrisch Assoziationskonstante der Boronsäureesterbildung aus dem tetraedrischen Zustand
Abkürzungs- und Symbolverzeichnis - VII -
Ktrigonal Assoziationskonstante der Boronsäureesterbildung aus dem trigonalen Zustand
log KOW dekadischer Logarithmus des Oktanol/Wasser-Verteilungskoef-fizienten [dimensionslos]
M Molare Masse [g/mol], bei Makromolekülen in [Da]
m Masse
mAPS Masse APS-Silica [g]
MLigand Molare Masse der Liganden [g/mol]
mSi,O Masse der übrigen Elemente, insbesondere Silicium und Sauerstoff [g]
mTBL berechnete Masse TBL1 oder TBL2 [g]
NA Avogadrokonstante [6,022·1023 mol-1]
q* Gleichgewichtsbeladung Silica [mg/g]
RGG Resonanzsignal im Gleichgewicht
Rmax Resonanzsignal bei vollständiger Belegung
V Volumen
w%C-APS prozentualer Kohlenstoffmassenanteil in APS-Silica
w%C-TBL prozentualer Kohlenstoffmassenanteil in TBL1 oder TBL2
w%H-APS prozentualer Wasserstoffmassenanteil in APS-Silica
w%H-TBL prozentualer Wasserstoffmassenanteil in TBL1 oder TBL2
w%N-APS prozentualer Stickstoffmassenanteil in APS-Silica
w%N-TBL prozentualer Stickstoffmassenanteil in TBL1 oder TBL2
w%Si,O prozentualer Anteil der übrigen Elemente in TBL1 oder TBL2
E Extinktionsänderung [min-1]
chemische Verschiebung [ppm]
BFD molarer Extinktionskoeffizient von BFD [0,032 L·mmol-1·cm-1]
- VIII -
1 Einleitung und Zielsetzung...............................................................................1
2 Allgemeine Grundlagen ....................................................................................4
2.1 Grundlagen der Glycobiologie ..................................................................4
2.2 Vorstellung der Interaktionspartner...........................................................5
2.2.1 Boronsäurebasierte Liganden und damit prozessierte Glycosysteme ...........................................................................................6
2.2.2 Triazinliganden und damit prozessierte Glyco- und Schadstoffsysteme ...................................................................................6
2.2.3 Lektine ......................................................................................................7
2.3 Prinzip der Affinitätsseparation .................................................................8
2.4 Wechselwirkungsmechanismen..............................................................10
2.4.1 Molekulare Interaktion durch kovalente Wechselwirkungen...................10
2.4.2 Molekulare Interaktion durch nicht-kovalente Wechselwirkungen ..........10
3 Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung....................16
3.1 Einführung ..............................................................................................16
3.1.1 Strukturelle Voraussetzungen der Wertstoffe .........................................16
3.1.2 Prinzip der Wechselwirkung ...................................................................17
3.2 ABA-Affinitätsseparation von Glycoproteinen.........................................20
3.2.1 Immobilisierung von m-Aminophenylboronsäure....................................20
3.2.2 Blutplasma ..............................................................................................21
3.2.3 Synthetische Proteinmischungen ...........................................................23
3.2.4 Rückschlüsse..........................................................................................26
3.3 Entwicklung eines Aufreinigungsverfahrens für Benzoylformiatdecarboxylase.................................................................26
3.3.1 Benzoylformiatdecarboxylase.................................................................26
3.3.2 Beschreibung der ligandvermittelten Affinitätsseparation .......................28
3.3.3 Verwendete Trägermaterialien und Immobilisierung vonTPP.................29
3.3.4 Bindungsstudien mit TPP am ABA-Adsorbens.......................................30
3.3.5 Bindungsstudien mittels 31P-NMR-Spektroskopie...................................33
3.3.6 Affinitätsseparation .................................................................................36
3.3.6.1 Aufschluss der rekombinanten E. coli-Bakterien ....................................36
3.3.6.2 BFD-Aktivitätstest und Proteinkonzentrationsbestimmung.....................36
3.3.6.3 2D-Gelelektrophorese, Tryptischer Verdau und MALDI-MS...................37
3.3.6.4 TPP-vermittelte Affinitätsseparation .......................................................38
3.3.6.5 Affinitätstrennung mit direkt immobilisiertem TPP ..................................41
3.4 Rückschlüsse..........................................................................................42
4 Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung ............................44
4.1 Synthetische Liganden für Glycoproteine - Stand der Wissenschaft ..........................................................................................44
4.2 Vorstellung der verwendeten Triazinliganden.........................................46
4.3 Triazinliganden in der Affinitätsseparation..............................................47
4.4 Synthese der Triazinliganden .................................................................50
4.4.1 Synthese von TBL1 und TBL2................................................................50
4.4.2 Synthese von NH2-TBL1 und NH2-TBL2.................................................51
4.5 Grundlagen der Surface Plasmon Resonance und Funktionsweise des Biacore 3000 ..........................................................52
4.6 Immobilisierungen...................................................................................57
4.6.1 Immobilisierung von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 auf Sensorchips............57
4.6.2 Immobilisierung von TBL1 und TBL2 auf Silica ......................................63
- IX -
4.6.2.1 Ergebnisse der Elementaranalyse..........................................................64
4.6.2.2 Ergebnisse der massenspektrometrischen Charakterisierung ...............67
4.7 Interaktionsstudien..................................................................................71
4.7.1 SPR-Interaktionsstudien mit NH2-TBL1 und NH2-TBL2..........................71
4.7.2 Adsorptionsexperimente mit TBL1-Silica und TBL2-Silica......................75
4.7.2.1 Glucose Oxidase ....................................................................................75
4.7.2.2 Zucker.....................................................................................................76
4.7.3 Vergleichende SPR-Interaktionsstudien mit natürlichen Liganden .................................................................................................82
4.8 Molecular Modeling und Docking............................................................85
4.8.1 Grundzüge des Molecular Modeling und Docking ..................................85
4.8.2 Durchführung der Simulationen ..............................................................86
4.8.3 Ergebnisse der Simulationen..................................................................88
4.8.3.1 Stärke der Wechselwirkung - Bindungsenergien....................................88
4.8.3.2 Bindungsmodus der Saccharide.............................................................90
4.8.3.3 Bindungsmodus von Glucose Oxidase...................................................93
4.9 Rückschlüsse..........................................................................................94
5 Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung und als Erkennungselemente chemischer Sensoren................................................96
5.1 Schadstoffauswahl..................................................................................96
5.2 Chemische Sensoren .............................................................................97
5.3 Anreicherungsverfahren .........................................................................98
5.4 Ligandenentwicklung ..............................................................................99
5.5 Self Assembled Monolayer als Grundlage chemisch-sensitiver Oberflächen ..........................................................................................102
5.5.1 Herstellung und Charakterisierung der SAMs auf den Sensorchips ..........................................................................................103
5.5.1.1 Kontaktwinkelmessung .........................................................................103
5.5.1.2 Reinigung und Aufbringen des Monolayers ..........................................104
5.5.2 Verifizierung der SAM-Herstellung mittels Lektinen..............................105
5.5.2.1 Concanavalin A und GOD ....................................................................105
5.5.2.2 Ricinus Communis Agglutinin und ASF ................................................107
5.6 Rückschlüsse........................................................................................108
6 Zusammenfassung........................................................................................110
7 Summary ........................................................................................................114
8 Anhang ...........................................................................................................117
8.1 Ergänzende Abbildungen und Tabellen................................................117
8.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien.......................................................133
8.3 Chemikalien ..........................................................................................135
9 Abbildungsverzeichnis .................................................................................140
10 Tabellenverzeichnis ......................................................................................146
11 Literaturverzeichnis ......................................................................................147
- X -
Einleitung und Zielsetzung - 1 -
1 Einleitung und Zielsetzung Im Jahr 2010 wurde in Deutschland mit Biopharmazeutika ein Umsatz von 5,17
Milliarden Euro erzielt [1, Seite 9]. Biopharmazeutika sind Arzneimittel, zu denen auch
jene zählen, die mit Hilfe gentechnisch veränderter Organismen hergestellt werden.
Am gesamten deutschen Pharmamarkt haben Produkte der medizinischen Bio-
technologie einen Anteil von ca. 17 %, wobei die Bedeutung weiter zunimmt [1, Seite 9].
Ende 2010 waren in Deutschland 198 Biopharmazeutika zugelassen. Davon machen
115 rekombinant hergestellte Proteine (u.a. Insulin, Wachstumshormone, Gerinnungs-
modulatoren, Enzyme, Epoetin) sowie 25 monoklonale Antikörper den größten Anteil
aus [1, Seite 10].
Ein Kostenfaktor ist das Downstream Processing, die Aufreinigung von Bio-
pharmazeutika oder anderen Wertstoffen aus den Organismen. Der Kostenanteil liegt
bei ca. 50-70 % und kann für hochreine pharmazeutische Produkte bis zu 90 % der
gesamten Produktionskosten ausmachen [2, Seite 279]. Hier besteht ein hohes
Einsparpotential, wenn Verfahrensschritte sorgfältig ausgewählt werden [3, Seite 35].
Der Downstream-Prozess wird von chromatographischen Verfahren dominiert, wobei
bis zum finalen Produkt zwei bis vier dieser Schritte eingesetzt werden [4, Seite 3; 5,
Seite 139]. Unter den chromatographischen Verfahren ragt die Affinitätsseparation,
deren Grundprinzip die biospezifische Interaktion zwischen einem an ein Träger-
material immobilisierten Liganden und einem Wertstoff ist, hinsichtlich ihrer
Leistungsfähigkeit und hohen Selektivität heraus. Durch diesen Schritt kann die
Reinheit des Produktes um das 1000-fache erhöht werden, bei gleichzeitig sehr hohen
Ausbeuten, die bis zu 99 % betragen. Mittels eines geeigneten Affinitätstrennschrittes
kann sich somit die Anzahl nachfolgender Aufreinigungsschritte reduzieren, was
wiederum eine Zeit- und Kostensenkung im Downstream Processing nach sich zieht.
Der Nachteil der Affinitätstrennverfahren liegt in der Verwendung von Naturstoffen als
Liganden. Viele dieser biospezifischen, insbesondere proteinogenen, Liganden sind
aufgrund ihrer Struktur sehr instabil. Sie können durch Mikroorganismen abgebaut
werden und besitzen nur eine geringe Stabilität gegenüber harschen physikalischen
und chemischen Einflüssen. Weiterhin sind viele natürliche Liganden toxisch und
zudem in ihrer Gewinnung kostenintensiv [5, Seite 148-149].
Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, durch Anwendung stabiler, synthetischer
Liganden diese Nachteile zu kompensieren und die Vorteile für Affinitätsseparations-
verfahren zu nutzen. Des Weiteren soll überprüft werden, ob sich die in dieser Arbeit
verwendeten synthetischen Liganden als selektive chemische Erkennungselemente für
Sensoren eignen, die durch ihre Affinität chemische Verbindungen in wässrigen
Medien detektieren können.
Einleitung und Zielsetzung - 2 -
Zwei Stoffklassen werden auf ihre Eignung als synthetische Liganden untersucht.
Dabei handelt es sich um Boronsäure- und Triazinderivate, die beide durch
unterschiedliche Bindungsmechanismen mit Zuckerstrukturen interagieren können.
Zur Evaluation beider Stoffklassen werden in dieser Arbeit Glycoproteine und
Saccharide herangezogen. Die sich daraus ergebenden Erkenntnisse wurden
verwendet, um optimierte Anwendungen für die untersuchten Liganden zu entwerfen,
die gezielt die Vorteile der molekularen Interaktionen ausnutzen, die diese Liganden
auszeichnen.
Für Boronsäurederivate wird in diesem Zusammenhang die ligandvermittelte
Aufreinigung des rekombinanten Enzyms Benzoylformiatdecarboxylase aus E. coli-
Fermentationsaufschlüssen vorgestellt. Triazinderivate zeigen hohe Affinitäten und
Selektivitäten zu einigen Benzotriazolen, die als anthropogene Schadstoffe in die
Umwelt gelangen. Dies soll für sensorische Anwendungen genutzt werden, die eine
permanente Umweltüberwachung erlauben. Dabei sollen ausgewählte Boronsäure-
und Triazinderivate im Idealfall folgenden Anforderungen genügen:
Affinität / Selektivität: möglichst ähnliche Affinitäten und Selektivitäten zu
ausgewählten Wertstoffen entsprechend ihren natürlichen
Analoga
Zugänglichkeit: kommerziell erhältlich oder kostengünstige Synthese
Stabilität: hohe Stabilität gegenüber harschen chemischen und
physikalischen Konditionen; kein mikrobieller Abbau;
kovalente Immobilisierung am Trägermaterial
Toxizität: keine Humantoxizität; bei Freisetzung keine Umwelt-
auswirkungen
Der Aufbau der Arbeit ist durch die Untersuchung der beiden Ligandenklassen
gekennzeichnet.
Allgemeine theoretische Grundlagen werden in Abschnitt 2 erläutert. In Abschnitt 3
erfolgt die Charakterisierung eines Boronsäureliganden. Im ersten Teil dieses
Abschnitts werden die Trenneigenschaften für Glycoproteine erörtert. Im zweiten Teil
wird die Entwicklung eines Affinitätsseparationsverfahrens für das Enzym
Benzoylformiatdecarboxylase ausführlich dargestellt.
Einleitung und Zielsetzung - 3 -
Triazinbasierte Liganden für Glycoproteine werden eingehend in Abschnitt 4
behandelt. Es wird die Synthese und Immobilisierung der Liganden dargestellt, gefolgt
von einem Verfahren zur Charakterisierung oberflächengebundener Triazinliganden
mittels Massenspektrometrie. Detailliert erfolgt die Darstellung der Ergebnisse zur
Eignung für die Affinitätsseparation von Triazinderivaten.
Nicht nur in der Affinitätsseparation sind selektive und spezifische Interaktionen
notwendig. Die Untersuchung der Eignung von Triazinmolekülen als chemisches
Erkennungselement für Sensoren wird in Abschnitt 5 überprüft. Des Weiteren wird
hier ein Verfahren für die Immobilisierung von Liganden auf planaren
Sensorgoldoberflächen mittels Self Assembled Monolayer vorgestellt. Die
Immobilisierung wird aufgrund der definierten Interaktionen zunächst mit Lektinen
vollzogen.
Allgemeine Grundlagen - 4 -
2 Allgemeine Grundlagen Im nachfolgenden Abschnitt sollen allgemeine Grundlagen und die in dieser Arbeit
verwendeten Reaktionssysteme erläutert werden. Relevante Aspekte der Glycobiologie
werden beleuchtet, da ein Themenschwerpunkt die Entwicklung von Aufreinigungs-
strategien für Glycokonjugate mit Hilfe synthetischer Liganden ist. Anschließend
werden die verwendeten Interaktionspartner bzw. Bindungspartner vorgestellt. Auf die
Grundlagen der Affinitätsseparation und den dabei auftretenden Wechselwirkungs-
mechanismen zwischen den Interaktionspartnern wird im darauffolgenden Unter-
abschnitt eingegangen.
2.1 Grundlagen der Glycobiologie Kohlenhydrate sind die am häufigsten vorkommenden Biomoleküle auf der Erde.
Einerseits sind Kohlenhydrate am strukturellen Aufbau von Lebewesen beteiligt,
andererseits stellen sie eine wichtige Energiespeicherform dar. Daneben kommt den
Kohlenhydraten auch als Informationsträger eine wichtige Rolle zu Teil. Viele
biologische Mechanismen laufen auf Grundlage von molekularen Erkennungs-
prozessen von Kohlenhydratstrukturen ab [6, Seite 741].
Die für die molekulare Erkennung wichtigen Kohlenhydrate liegen dabei als
Glycokonjugate vor. Es handelt sich um Verbindungen zwischen Kohlenhydraten und
anderen biochemischen Stoffgruppen. Typische makromolekulare Vertreter sind
Glycoproteine, Proteoglycane oder Glycolipide [7, Seite 255-256]. Aber auch
niedermolekulare Verbindungen wie Steroide, Alkaloide oder Polyphenole können
glycosyliert vorliegen [8, Seite 1303-1328].
Glycoproteine liegen zum einen als Zellmembranproteine oder innerhalb der Zelle in
verschiedenen Zellorganellen vor. Die meisten Proteine des Blutplasmas sind ebenfalls
glycosyliert [9, Seite 514]. Dagegen sind Proteoglycane und Glycolipide ausschließlich
Bestandteil von Zellmembranen. Die Gesamtheit der Kohlenhydratstrukturen auf der
Zellmembran wird als Glycocalix bezeichnet [7, Seite 255-256]. In eukaryotischen
Zellen treten zwei posttranslationale Glycosylierungsformen von Proteinen auf. Zum
einen kann das erste Monosaccharid, für gewöhnlich N-Acetylgalactosamin, über eine
-O-glycosidische Bindung mit der OH-Gruppe der Seitenkette von Serin oder
Threonin verknüpft werden, man spricht von einer O-Glycosylierung [10; Seite 89].
Beim zweiten Typ (N-Glycosylierung) wird ein größer verzweigtes Oligosaccharid über
eine -N-glycosidische Bindung an die Amid-Gruppe aus Asparagin gehängt [10; Seite
73]. Die Glycosylierung findet im Endoplasmatischen Retikulum und im Golgi-Apparat
durch verschiedene Glycosyltransferasen statt.
Allgemeine Grundlagen - 5 -
Mit Hilfe von Lektinen werden die in den Kohlenhydratstrukturen gespeichterten
Informationen “abgerufen”. Bei Lektinen handelt es sich um Proteine, die in der Lage
sind, hochspezifisch und reversibel an bestimmte Kohlenhydratstrukturen von
Glycokonjugaten zu binden [11, Seite 1593]. Im Gegensatz zu Enzymen modifizieren
sie die Zuckerstrukturen nicht und benötigen im Gegensatz zu Antikörpern keinen
antigenen Impuls zur Synthese. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Grenzen
zunehmend verschwimmen. Jedes Lektin besitzt typischerweise zwei oder mehrere
Kohlenhydratbindungsstellen. Lektine können in fast allen Organismen gefunden
werden und variieren in ihrer Größe, chemischen Zusammensetzung und
Kohlenhydratspezifität. Einen Überblick zu Lektinen bietet der Review von Lis und
Sharon [12, Seite 637-674].
Die molekulare Erkennung zwischen Glycokonjugaten und Lektinen ist Grundlage für
eine Vielzahl biologischer Mechanismen und Effekte. Zelluläre Mechanismen sind
beispielsweise die Zell-Zell-Erkennung oder die Signalübertragung zwischen Zellen [13,
Seite 860]. Aber auch bei der Pathogenese von Infektionskrankheiten und
Entzündungsvorgängen sowie der Immunantwort hierauf sind Wechselwirkungen von
Glycokonjugaten und Lektinen vielfältig beteiligt [14, Seite 43; 15, Seite 2370]. Ein
aktuelles Beispiel verdeutlicht die Relevanz. Die im Frühsommer 2011 ausgebrochene
schwere Verlaufsform des hämolytisch-urämischen Syndroms (HUS) wird durch
enterohämorrhagische Escherichia coli-Bakterien (EHEC) verursacht [16, Seite 2].
EHEC bildet bestimmte toxische Lektine, sogenannte Shiga-like Toxine. Diese können
nach Eintritt in den Blutkreislauf an Globotriaosylceramid, einem Glycolipidrezeptor, der
sich auf den Endothelzellen der Blutgefäße der Nierenkörperchen befindet, binden.
Dadurch kommt es zu einer Einstülpung der Endothelzellmembran, was die Aufnahme
der Lektine in die Zelle bewirkt. Dort schädigen sie die Ribosomen, behindern somit die
Proteinbiosynthese und bewirken das Absterben der Endothelzellen. Neben einer
massiven Schädigung des Dickdarms kann es im Verlauf einer EHEC-Infektion zu
Nierenversagen kommen [17, Seite 673; 18, Seite 1077].
2.2 Vorstellung der Interaktionspartner Zur Gewährleistung eines besseren Überblicks werden in den nachfolgenden
Abschnitten, die verwendeten Reaktionssysteme vorgestellt. Da diese Arbeit
kapitelweise nach den Liganden gegliedert ist, werden diese, um Redundanzen zu
vermeiden, ausführlich in den jeweiligen Kapiteln vorgestellt. Hier wird detaillierter auf
das Vergleichssystem der Lektine und Glycoproteine eingegangen.
Allgemeine Grundlagen - 6 -
2.2.1 Boronsäurebasierte Liganden und damit prozessierte Glycosysteme
Als boronsäurebasierter Ligand wird m-Aminophenylboronsäure (ABA) verwendet.
Dieser Ligand wird ausführlich in Abschnitt 3 vorgestellt.
Um Trenneigenschaften von ABA für Glycoproteine zu evaluieren, werden Glucose
Oxidase, Fetuin und Asialofetuin als Modellverbindungen verwendet. Glucose
Oxidase (GOD) stellt ein Flavoenzym dar, das die Oxidation von -D-Glucose zu -
Gluconolacton und Wasserstoffperoxid mittels Sauerstoff katalysiert. Für die
experimentellen Studien wird GOD aus dem Schimmelpilz A. niger verwendet.
Zusätzlich zu GOD aus A. niger werden Molecular Modeling-Studien mit GOD aus dem
Schimmelpilz P. amagasakiense durchgeführt. In beiden Fällen ist GOD ein
homodimeres Enzym mit einer molaren Masse von ca. 160 kDa. Jede Untereinheit des
glycosylierten Enzyms besitzt einen FAD-Cofaktor. Der Kohlenhydratanteil von GOD
aus A. niger beträgt ca. 24-30 %, der von GOD aus P. amagasakiense ca. 13 % [19,
Seite 141; 20, Seite 505].
Das verwendete Fetuin wird aus Kälberblut isoliert. Der Kohlenhydratanteil von Fetuin
liegt bei etwa 26 % und das Molekülgewicht beträgt 44,8 kDa [21, Seite 2863]. Fetuin
besitzt insgesamt sechs Glycane, wobei drei O-verknüpft und drei N-verknüpft sind [22,
Seite 18255]. Durch Abspaltung endständiger Sialinsäuren der Glycane von Fetuin
erhält man Asialofetuin. Als komplexes Vielstoffgemisch wird Seehund-Blutplasma
verwendet.
Das andere Zielmolekül für ABA Benzoylformiatdecarboxylase wird in Abschnitt 3
ebenfalls detailliert behandelt.
2.2.2 Triazinliganden und damit prozessierte Glyco- und Schadstoff-systeme
Zwei verschiedene triazinbasierte Liganden (TBL), TBL1 und TBL2, werden für die
Interaktion mit Glycoproteinen verwendet. Die Liganden TBL-LC2, TBL-LC11,
TBL-LC19 und TBL-LC20 werden auf ihre Eignung für sensorische Anwendungen
aufgrund ihrer Bindungseigenschaften zu Benzotriazolen untersucht. In Abschnitt 4
und 5 werden die Liganden ausführlich vorgestellt.
Als Glycoproteine werden ebenfalls GOD (s.o.) und zusätzlich Thyroglobulin (TG)
verwendet. TG ist ein dimeres Protein aus zwei identischen Untereinheiten [23, Seite
491]. Es konnten 20 potentielle Glycosylierungsstellen identifiziert werden, von denen
zwei mit Glycanen verknüpft sind. Ein Glycan von TG ist fucosyliert. Der
Kohlenhydratanteil des ca. 660 kDa schweren Proteins beträgt je nach Organismus ca.
8-10 % [24, Seite 1981; 25, Seite 695; 26, Seite 164]. Anzutreffen ist es in der
Allgemeine Grundlagen - 7 -
Schilddrüse von Wirbeltieren, wo es an der Bildung von Schilddrüsenhormonen
beteiligt ist [23, Seite 491].
Die Untersuchung der Eignung für sensorische Bestimmungen von Benzotriazolen wird
mit 1H-Benzotriazol und 5-Methyl-1H-benzotriazol durchgeführt. Die Vorstellung
erfolgt in Abschnitt 5.
2.2.3 Lektine Lektine sind der Maßstab für synthetische Kohlenhydratliganden. Sie werden in dieser
Arbeit als Referenz zur Beurteilung der Eignung synthetischer Kohlenhydratliganden in
der Affinitätsseparation herangezogen.
Lektine finden vielfach Anwendung als Werkzeuge in der Glycokonjugat-Forschung,
unter anderem zur Quantifizierung von Glycokonjugaten mittels Microarray-Techniken.
Durch Gelelektrophorese getrennte Glycokonjugate können mit Hilfe der Lektinblotting-
Technik nachgewiesen werden [27, Seite 726; 28, Seite 907].
In der Affinitätsseparation werden Lektine als Liganden zur Aufreinigung von
Glycokonjugaten, insbesondere von Glycoproteinen, eingesetzt [29, Seite 2926; 30,
Seite 62; 31, Seite 86; 32, Seite 85; 33, Seite 130; 34, Seite 427]. Daneben erhält man
Informationen über die Kohlenhydratzusammensetzung, die unter Verwendung
verschiedener Lektine mit unterschiedlicher Spezifität verfeinert werden können [35,
Seite 137].
Concanavalin A (Con A) wird aus der Schwertbohne isoliert und besteht aus vier
homologen Untereinheiten, von denen jede 26,5 kDa schwer ist und aus 238
Aminosäuren besteht. Für die kohlenhydratbindende Funktion benötigt das Lektin
Mn2+- und Ca2+-Ionen. Con A bindet mannose- und glucosehaltige Glycoproteine.
Dabei wird Mannose bevorzugt gebunden. Das Lektin besitzt eine konservierte
Monosaccharid-Bindungsstelle, in dessen erweiterten Umfeld sich die Bindungs-
regionen für Oligosaccharide befindet [36, Seite 19].
Aus den Ricinusbohnen, den Samen des Wunderbaums, können zwei verschiedene
Lektine isoliert werden. Dabei handelt es sich um Ricinus communis agglutinin
(RCA120) und um Ricin (RCA60). Beide sind stark toxisch. Das verwendete Glycoprotein
RCA120 ist 120 kDa schwer und besteht aus zwei Untereinheiten. Es besitzt eine
Affinität zu Galactose [37, Seite 227].
Aus den Fruchtkörpern des orangeroten Becherlings (Aleuria aurantia), einem Pilz,
wird das fucosespezifische Aleuria aurantia Lektin (AAL) isoliert. Das homodimere
Lektin ist 72 kDa schwer [38, Seite 27062].
Als Modellglycoprotein für Con A wird GOD, für RCA120 wird Asialofetuin und für AAL
wird TG verwendet.
Allgemeine Grundlagen - 8 -
2.3 Prinzip der Affinitätsseparation Die Affinitätsseparation ist eine Trenntechnik, die es ermöglicht, Biomoleküle anhand
ihrer Funktion oder Struktur aus der Flüssigphase abzutrennen. Das Prinzip beruht auf
der Bildung stabiler, spezifischer und reversibler Komplexe zweier Bindungspartner.
Ein Bindungspartner bzw. Interaktionspartner, der Ligand, wird an einem festen
Trägermaterial kovalent immobilisiert [39, Seite 9]. Mit dieser stationären Phase
(Adsorbens) kann der andere Bindungspartner, das Zielmolekül oder Wertstoff,
aufgereinigt werden. Grundvoraussetzung ist eine hohe Bindungsstärke (Affinität), die
durch die Dissoziationskonstante KD beschrieben werden kann. KD sollte einen Wert
von kleiner 10-5 mol/L annehmen, was einen on/off-Mechanismus in Form eines
Adsorptions- und Desorptionschrittes ermöglicht [40, Seite 87]. Faktoren wie der pH-
Wert, Ionenstärke, Druck und Temperatur, sterische Zugänglichkeit der verwendeten
Liganden beeinflussen die Lage des Gleichgewichts und somit den Trennprozess.
Vom Liganden kann das Zielmolekül zum einen spezifisch durch kompetitive
Verdrängung desorbiert werden. Dabei kann ein Überschuss an Molekülen im
Desorptionspuffer verwendet werden, die mit den Zielmolekülen um die
Bindungsstellen am Liganden konkurrieren. Zum anderen kann die Desorption
unspezifisch durch deformierende Bedingungen erfolgen. Solche Bedingungen können
z.B. durch Temperatur- oder pH-Änderung erreicht werden. Ändert sich die räumliche
Struktur von mindestens einem Bindungspartner, wird das Zielmolekül vom Adsorbens
entfernt [39, Seite 10]. Abb. 1 zeigt schematisch einen Affinitätsseparationszyklus.
Abb. 1: Grundschema der Affinitätsseparation. Die Einteilung der Verfahrensschritte erfolgt in Adsorption (1), Waschen (2), Desorption (3) und Regeneration (4).
Nach Aufgabe eines Substanzgemisches, welches das Zielmolekül und unerwünschte
Verbindungen enthält, bindet das Zielmolekül an den immobilisierten Liganden
(Adsorption). Im Waschschritt werden unerwünschte Verbindungen vom Adsorbens
Allgemeine Grundlagen - 9 -
gespült. Anschließend folgt die Desorption, bei der die Zielmoleküle vom Liganden
entfernt und in aufgereinigter Form zurückgewonnen werden. Im Regenerationsschritt
wird das Adsorbens für eine erneute Verwendung equilibriert.
In Abb. 2 ist eine mögliche Einteilung von Affinitätsseparationsverfahren auf Grundlage
der verwendeten Liganden dargestellt [41, Seite 71]. Zu unterscheiden sind Verfahren,
die mit biospezifischen Liganden oder mit pseudo-biospezifischen Liganden durch-
geführt werden. Biospezifische Liganden können in hochspezifische und gruppen-
spezifische Liganden eingeteilt werden. Gruppenspezifische Liganden können im
Gegensatz zu hochspezifischen Liganden eine bestimmte Affinität zu Zielmolekülen
einer bestimmten Substanzklasse besitzen [39, Seite 32].
Abb. 2: Klassifizierung der Affinitätsseparationsverfahren auf Basis der benutzten Liganden nach Vijayalakshmi [41, Seite 71]. In den Klammern sind mögliche Zielmoleküle der aufgeführten Liganden angegeben.
Auch das verwendete Trägermaterial besitzt einen Einfluss auf die Affinitätsseparation.
Trägermaterialien sollen eine schnelle Immobilisierungschemie sowie eine hohe
mechanische, chemische und mikrobiologische Stabilität aufweisen. Zur Vermeidung
unspezifischer Wechselwirkungen zwischen Trägermaterial und Zielmolekülen sollte
die Oberfläche hydrophil sein und keine hydrophoben oder ionogenen Bereiche
aufweisen [31, Seite 84]. Des Weiteren soll das Trägermaterial eine hohe Kapazität für
ein bestimmtes Zielmolekül aufweisen. Die Kapazität hängt von der zugänglichen
Oberfläche des Trägermaterials und der effektiven Ligandendichte auf der Oberfläche
ab. Zudem muss die Porenweite berücksichtigt werden, denn sie beeinflusst die
Zugänglichkeit der Zielstoffe zu den immobilisierten Liganden bzw. die Art des dazu
Allgemeine Grundlagen - 10 -
wirkenden Stofftransportmechanismus. Die Partikelgröße, deren Größenverteilung,
sowie die Rigidität des Trägermaterials besitzen einen Einfluss auf die Fließ-
eigenschaften [42, Seite 2-6]. Trägermaterialien können in natürliche und synthetische
Materialien eingeteilt werden. Zu den natürlichen Materialen zählen beispielsweise
Agarose [42, Seite 6-9] oder Silica [42, Seite 6-9]. Synthetische Materialien werden
durch Polymerisation und Quervernetzung von Monomeren, z.B. von Acrylamid [42,
Seite 16-31] oder verschiedener Methacrylat-Monomere [42, Seite 31-39], hergestellt.
2.4 Wechselwirkungsmechanismen Im nachfolgenden Abschnitt werden die Mechanismen erläutert, die für die Bindung
zwischen Ligand und Zielmolekülen verantwortlich sind. Dabei kann zwischen
kovalenten und nicht-kovalenten Wechselwirkungen unterschieden werden. Letztere
sollen in Abschnitt 2.4.2 detaillierter beschrieben werden. Kovalente Wechsel-
wirkungen in Affinitätstrennverfahren werden ausführlich in Kapitel 3 behandelt.
2.4.1 Molekulare Interaktion durch kovalente Wechselwirkungen Reversible, kovalente Wechselwirkungen zwischen Ligand und Zielmolekül können für
die Affinitätsseparation genutzt werden. Liganden, welche die Bedingung der
Reversibilität erfüllen, sind Derivate der Borsäure. Eine nicht-reversible Methode, die
folglich die Zerstörung des Zielmoleküls zur Folge hat, basiert auf immobilisiertem
Hydrazin [43, Seite 661].
2.4.2 Molekulare Interaktion durch nicht-kovalente Wechselwirkungen
Nicht-kovalente Wechselwirkungen spielen in der belebten Natur eine entscheidende
Rolle. Sie sind z.B. verantwortlich für die Ausbildung der DNA-Doppelhelix, für die
korrekte Faltung von Proteinen und für die molekulare Erkennung [44, Seite 144]. Im
Folgenden sollen die Prinzipien der molekularen Interaktion durch nicht-kovalente
Wechselwirkungen unter besonderer Berücksichtigung der Kohlenhydraterkennung
durch Lektine und synthetischer Analoga erläutert werden. Zwischen Liganden und
Zielmolekülen treten eine Reihe verschiedener nicht-kovalenter Wechselwirkungen auf.
Sie werden grob in elektrostatische Wechselwirkungen sowie in Induktions- und
Dispersionswechselwirkungen eingeteilt [45, Seite 4].
Ionenpaarwechselwirkungen (Salzbrücken) sind in ihrer Stärke vergleichbar mit denen
chemischer Bindungen. Ihre Stärke beträgt 100 bis 350 kJ/mol [46, Seite 27]. Ion-
Dipol-Wechselwirkungen treten z.B. zwischen einem Na+ und einem Wassermolekül
auf. Ihre Stärke beträgt zwischen 50 bis 200 kJ/mol. Weiterhin zählen zu Ion-Dipol-
Wechselwirkungen koordinative Bindungen, also die Komplexierung von Metallionen
[46, Seite 27]. Die Stärke von Dipol-Dipol-Wechselwirkungen beträgt ca. 5 bis
Allgemeine Grundlagen - 11 -
50 kJ/mol [46, Seite 28]. Als eine besondere Form der Dipol-Dipol-Wechselwirkung
kann die Wasserstoffbrückenbindung aufgefasst werden, bei der ein Wasserstoffatom
an ein elektronegatives Atom oder eine elektronenziehende, funktionelle Gruppe
gebunden ist und von einem Molekül oder einer funktionellen Gruppe mit
Dipolcharakter angezogen wird [46, Seite 29]. Sie ist mit 4 bis 60 kJ/mol zwar ähnlich
stark wie die Dipol-Dipol-Wechselwirkung, jedoch deutlich stärker richtungsabhängig.
Zu den Wasserstoffbrückenbindungen zählen auch sogenannte CH- -, OH- - und NH-
-Wasserstoffbrücken. Sie treten zwischen delokalisierten -Elektronensystemen
aromatischer Verbindungen und an Kohlenstoff, Sauerstoff oder Stickstoff gebundenen
Wasserstoffatomen auf. Mit 6,0 bis 10,5 kJ/mol zählen diese Wechselwirkungen zu den
schwächeren Wasserstoffbrücken. Obwohl sie bereits einen starken dispersiven
Charakter haben, unterscheiden sich diese Wasserstoffbrücken von reinen van der
Waals-Wechselwirkungen durch ihre ausgeprägte Richtungsabhängigkeit. Bei der
molekularen Erkennung von Kohlenhydratstrukturen durch Lektine oder synthetischen
Liganden spielen sie eine wichtige Rolle [47, Seite 6069; 48, Seite 13888-13892; 49,
Seite 6553]. Kationen- -Wechselwirkungen treten zwischen aromatischen
Verbindungen und Kationen auf. Ihre Stärke beträgt 5 bis 80 kJ/mol. Aromatische - -
Wechselwirkungen entstehen zwischen zwei aromatischen Ringen, wobei ein Ring oft
elektronenreich während der andere Ring elektronenarm ist. Ihre Stärke liegt zwischen
0 bis 50 kJ/mol. Dagegen sind van der Waals-Wechselwirkungen (London-Dispersions-
Wechselwirkungen) mit 0 bis 5 kJ/mol deutlich schwächer. Hierbei wird ein unpolares
Molekül durch ein Ion oder Dipol partiell polarisiert, wodurch eine schwache
elektrostatische Anziehung entsteht [46, Seite 27-37; 50, Seite 8-14]. Weiterhin kann
zwischen zwei völlig unpolaren Molekülen ein momentanes Dipolmoment zu einem
bestimmten Zeitpunkt durch die Bewegung der Elektronen um den Atomkern entstehen
[51, Seite 686-688]. Einen Überblick über die beschriebenen zwischenmolekularen
Kräfte gibt Tabelle 1.
Allgemeine Grundlagen - 12 -
Tabelle 1: Zusammenstellung der intermolekularen Kräfte.
Wechselwirkungsart Beispiel Bindungsstärke [kJ/mol]
Bemerkungen Literatur
Ionenpaarwechsel-wirkung
100-350 elektrostatische Wechselwirkung
[46, Seite 27]
Ion-Dipol-Wechsel-wirkung
50-200 elektrostatische Wechselwirkung
[46, Seite 27]
Dipol-Dipol-Wechsel-wirkung
5-50 elektrostatische Wechselwirkung oder Induktions-wechselwirkung
[46, Seite 28]
Wasserstoffbrücken-bindung
3-60 CH- : 6-11
elektrostatische Wechselwirkung oder Induktions-wechselwirkung stark richtungs-abhängig
[46, Seite 29] [48, Seite 13876]
Kation- -Wechsel-wirkung
5-80 Induktions-wechselwirkung
[46, Seite 32] [50, Seite 8-14]
- -Wechselwirkung
0-50 Dispersions-wechselwirkung richtungsab-hängig
[46, Seite 33-35] [50, Seite 8-14]
van der Waals-Wechselwirkung
0-5 Dispersions-wechselwirkung
[46, Seite 35-36] [50, Seite 8-14]
Die Stärke dieser zwischen Ligand und Zielmolekül auftretenden intermolekularen
Wechselwirkungen kann durch die Assoziationskonstante KA bzw. Dissoziations-
konstante KD beschrieben werden. Zwischen dem Liganden L und dem zu bindenden
Zielmolekül M bildet sich folgendes chemisches Gleichgewicht aus.
(1)
Die freie Standardbindungsenthalpie G0 steht dabei über der Assoziationskonstanten
über nachfolgende Beziehung im Zusammenhang. Dabei ist R die universelle
Gaskonstante, T die Temperatur, H0 die Standardbindungsenthalpie und S0 die
Standardbindungsentropie.
00A
0 STHKlnRTG (2)
Allgemeine Grundlagen - 13 -
mit
ML
LMKK 1
DA (3)
Aus Gleichung (2) ist ersichtlich, dass Änderungen der Enthalpie und der Entropie zur
Änderung der gesamten freien Standardbindungsenthalpie G0 beitragen und damit
die Stabilität des Ligand-Zielmolekül-Komplexes beeinflussen. Durch Anlagerung eines
Zielmoleküls an einen Liganden kann die Enthalpie gesenkt bzw. die Entropie erhöht
werden. Daraus resultiert nach der Gibbs-Helmholtz-Gleichung (Gleichung 2) eine
Abnahme der freien Bindungsenthalpie und es kommt zur exergonischen Anlagerung
des Zielmoleküls [52, Seite 1230]
Weiterhin spielt die „geometrische Passung“ von Ligand und Zielmolekül eine wichtige
Rolle. Sie folgt dem Schlüssel-Schloss-Modell, bzw. dem durch Koshland eingeführten
Induced-Fit-Modell [53, Seite 13876]. Bei Letzterem wird eine gewisse Flexibilität von
Ligand und Zielmolekül vorausgesetzt. Die Annäherung des Zielmoleküls an den
Liganden bewirkt eine derartige Änderung der Konformation der Bindungsregion, dass
das Zielmolekül aufgenommen werden kann. Nach der Ausbildung des Ligand-
Zielmolekül-Komplexes können zum Teil erhebliche Konformationsänderungen bei den
Bindungspartnern beobachtet werden [54, Seite 3986]. Abb. 3 zeigt schematisch beide
Modelle.
Abb. 3: Schematische Darstellung des Schlüssel-Schloss-Prinzips (A) und des Induced-Fit-Modells (B)
Der Chelateffekt (Multivalenz) leistet bei natürlichen Liganden einen deutlichen Beitrag
zur Affinität. Dieser Effekt setzt sich additiv aus den Einzelbeiträgen der G0-Werte der
Wasserstoffbrücken aber auch anderer intermolekularer Wechselwirkungen zusammen.
Beispielsweise weisen Lektine zu Oligosacchariden eine höhere Affinität auf als zu
Allgemeine Grundlagen - 14 -
Monosacchariden [55, Seite 955]. Oligosaccharide werden über ein größeres Netzwerk
von Wasserstoffbrücken und hydrophoben Interaktionen gebunden, als es für
Monosaccharide der Fall ist [12, Seite 654; 56, Seite 543]. In Abb. 4 sind
beispielsweise die wichtigsten Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Concana-
valin A und einem Trimannosid dargestellt [57, Seite 975]. In analoger Weise wird
durch den Einbau mehrerer Bindungszentren bei synthetischen Liganden eine
Affinitätssteigerung angestrebt [54, Seite 3984].
Abb. 4: Schematische Darstellung der wichtigsten Wasserstoffbrücken, die an der Bindung zwischen Concanavalin A und eines Trimannosids beteiligt sind. Entnommen aus [57, Seite 975]. Darüber hinaus kommt es bei der Bindung eines Zielmoleküls auch zu entropischen
Veränderungen. Hierbei ändert sich die Anzahl an Translations-, Rotations-,
Schwingungs- und Konformationsfreiheitsgraden durch Bildung des Ligand-Ziel-
molekül-Komplexes [58, Seite 2773]. Beispielsweise wird bei synthetischen Liganden
beobachtet, dass macrocyclische Liganden im Gegensatz zu acyclischen Liganden
eine höhere Affinität zu entsprechenden Zielmolekülen aufweisen. Begründet ist dieser
Effekt unter anderem durch den geringeren Verlust an Konformationsfreiheitsgraden
der macrocyclischen Liganden [59, Seite 22-26]. Häufig ist jedoch die Enthalpie-
Entropie-Kompensation zu beobachten. Der Aufbau einer Wechselwirkung zwischen
mehreren Bindungszentren ist zwar enthalpisch stark begünstigt, führt allerdings oft zu
größeren Einschränkungen der Freiheitsgrade [54, Seite 3986].
Die Affinitätsseparation wird in der Regel in wässrigen Medien durchgeführt. Hier übt
Wasser einen enormen Einfluss auf die Affinität zweier Bindungspartner zueinander
aus. Wasser konkurriert sehr effektiv um polare Bindungsstellen von Liganden und
Allgemeine Grundlagen - 15 -
bildet mit diesen Wasserstoffbrücken aus. Das bedeutet, die Bindungstasche eines
Liganden und das Zielmolekül selbst liegen solvatisiert vor. Daher ist in unpolaren oder
aprotischen Lösungsmitteln die Ausbildung von Wasserstoffbrücken weit effektiver [59,
Seite 39].
In wässrigen Systemen spielen zudem hydrophobe Effekte, auch hydrophobe
Wechselwirkungen oder Interaktionen genannt, eine wichtige Rolle (vgl. Abb. 5). Es
handelt sich hierbei um entropische Effekte.
Abb. 5: Darstellung hydrophober und polarer Bereiche von Kohlenhydraten am Beispiel von -D-Glucose. In Rot dargestellt sind OH-Gruppen, in Blau die hydrophoben Bereiche der Glucose.
Viele Bindungstaschen von Lektinen besitzen ausgeprägte hydrophobe Bereiche durch
aromatische Seitenketten von Aminosäuren, die von Wasser nicht perfekt solvatisiert
werden können. Kommt es zum Kontakt mit hydrophoben Bereichen von Kohlen-
hydraten wie in Abb. 5 dargestellt, die durch aliphatische Protonen (CH-Protonen)
gebildet werden, erfolgt die Freisetzung von Wassermolekülen und es kommt zu einer
Lösungsmittelreorganisation. Die Entropie und somit die freie Standardbildungs-
enthalpie steigt. Zwischen Kohlenhydrat und Zucker entstehen dabei CH- -Bindungen
[60, Seite 2693].
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 16 -
3 Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung
3.1 Einführung Eine der wenigen Möglichkeiten, Wertstoffe mittels Affinitätsseparation abzutrennen,
bei der die Affinität zwischen Ligand und Wertstoff über kovalente Bindungen entsteht,
kann durch Boronsäuren realisiert werden [61, Seite 79]. Hierbei handelt es sich um
organische Derivate der Borsäure mit der allgemeinen Formel R-B(OH)2.
Der erste und bis heute am häufigsten verwendete Boronsäureligand in der Affinitäts-
separation ist m-Aminophenylboronsäure (ABA). Die Aminogruppe in meta-Position
des Phenylrings von ABA dient der Immobilisierung [62, Seite 120]. Als
Trägermaterialien für ABA kommen natürliche Polymere (Agarose, Dextran, Cellulose),
synthetische Polymere (Polymethacrylate, Polyacrylamide, Polystyrene) und Silica zum
Einsatz [63, Seite 76]. Dargestellt ist die Strukturformel von ABA in Abb. 6.
Abb. 6: Strukturformel von m-Aminophenylboronsäure (ABA).
Bei dem Liganden handelt es sich um ein Derivat der Phenylboronsäure. Kuivila et al.
beobachteten zuerst die Affinität von ABA zu Zuckeralkoholen [64, Seite 781]. Erste
systematische Untersuchungen zur Affinität zwischen Phenylboronsäuren und
verschiedenen Substraten, auf die im Folgenden noch eingegangen wird, erfolgten
durch Lorand et al. [65, Seite 769-774].
In der vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich ABA als Ligand verwendet, auf den
sich die weiteren Ausführungen beziehen. Nachfolgend werden die strukturellen
Voraussetzungen der Wertstoffe, die zur Ausbildung einer kovalenten Bindung zu ABA
notwendig sind, erläutert. Im Anschluss wird das Prinzip der Wechselwirkung näher
erläutert.
3.1.1 Strukturelle Voraussetzungen der Wertstoffe ABA bildet mit ein- und mehrwertigen Alkoholen, wie Diole und Polyole, unter
basischen Bedingungen stabile Ester. Unter sauren Bedingungen werden die
sogenannten Boronsäureester wieder gespalten [66, Seite 1037]. Handelt es sich um
mehrwertige Alkohole, werden fünf- oder sechsgliedrige cyclische Boronsäureester
gebildet (vgl. Abb. 7). Voraussetzung hierfür ist, dass die Hydroxygruppen 1,2- oder
1,3-ständig zueinander sind, wie es beispielsweise bei 1,2-Propandiol und 1,3-
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 17 -
Propandiol der Fall ist [67, Seite 176; 68, Seite 442]. Kohlenhydrate sind ebenfalls in
der Lage, mit Boronsäuren Ester zu bilden. Liegt ein Monosaccharid in Ringform vor,
ist für die Esterbildung eine coplanare Anordnung der benachbarten Hydroxygruppen
erforderlich, d.h. dass diese cis-ständig zueinander stehen [69, Seite 295]. Bedingt
durch die starre Konformation von Kohlenhydraten bildet ABA mit diesen stabilere
cyclische Ester als mit acyclischen Diolen [68, Seite 442].
In der Affinitätsseparation umfasst das Spektrum der Zielmoleküle von ABA neben
Diolen und Kohlenhydraten auch solche Moleküle, die Diole als funktionelle Gruppen
besitzen. Durch ihren Kohlenhydratanteil können auch Biomakromoleküle wie Glyco-
proteine oder RNA mittels Affinitätsseparation durch ABA als gruppenselektiver Ligand
isoliert werden.
Der Stand der Forschung soll anhand einiger Beispiele aus der Literatur kurz skizziert
werden, in denen ABA als Ligand für Separationsverfahren zur Anwendung kam.
Glad et al. beschreiben die Trennung von Mischungen diverser Mono- und Di-
saccharide [70, Seite 258]. Auch die Isolierung von catechol-haltigen Verbindungen wie
z.B. -Hydroxycarbonsäuren, Polyphenolen und Nukleotiden ist bereits beschrieben
worden [71, Seite 59; 72, Seite 249; 73, Seite 20; 74, Seite 226; 75, Seite 73; 76, Seite
354; 77, Seite 934]. Bei der Anwendung auf Biomakromoleküle wurde durch Ackerman
et al. die Trennung von RNA und DNA untersucht [78, Seite 176]. Die Isolierung von
Glycoproteinen mittels ABA-Affinitätsseparation ist ebenfalls bereits in der Literatur
dargestellt. Als Beispiele sei hier auf die Abtrennung von Immunglobulinen,
glycosylierten Mistel-Lektinen, Ovalbumin, Transferrin und Erythropoetin1 verwiesen
[79, Seite 278; 80, Seite 1681; 81, Seite 3639; 82, Seite 121]. Aber auch in der
klinischen Anwendung zur Diagnose von Diabetes mellitus wird ABA als Ligand zur
Trennung von glycosylierten und nicht-glycosylierten Hämoglobin verwendet [83, Seite
23].
Biomakromoleküle, die keine kovalente Bindung mit ABA eingehen können, lassen sich
durch die sogenannte ligandvermittelte Affinitätsseparation aufreinigen. Das Prinzip
wird in Abschnitt 3.3.2 vorgestellt [62, Seite 122; 63, Seite 78].
Die Desorption des Wertstoffes von der ABA kann zum einen durch pH-Verschiebung
ins Saure erfolgen. Zum anderen ist der Einsatz eines kompetitiv wirkenden Agens
möglich, z.B. Sorbitol oder Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), das mit ABA
selbst einen Ester bildet und so eine Freisetzung des Wertstoffes bewirkt [63, Seite 76].
3.1.2 Prinzip der Wechselwirkung Reaktionsmechanistisch lässt sich die Bildung des cyclischen Esters durch eine Folge
gekoppelter Gleichgewichte beschreiben. Abb. 7A zeigt diese für ABA. Da das 1 Erythropoetin ist ein glycosyliertes Peptidhormon und besser unter dem Namen EPO bekannt.
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 18 -
Boratom von ABA (Abb. 7A 1) eine Lewissäure darstellt, kann es koordinativ ein
Wassermolekül binden. Unter Abgabe eines Protons wird eine kovalente Bindung zum
zuvor koordinativ gebundenen Wasser ausgebildet, so dass sich die tetraedrische
Form 2 der ABA bildet. Das Boratom wird dabei vom sp2- in den sp3-hybridisierten
Zustand überführt. Die tetraedrische Form 2 kann mit einem Diol anschließend zum
cyclischen Ester 4 unter Abgabe von zwei Wassermolekülen weiter reagieren. Ein
zweiter Reaktionsweg ist formal ebenfalls möglich. Hier reagiert das Diol zunächst mit
ABA zum Intermediat 3. Auch das Intermediat 3 ist eine Lewissäure und reagiert sauer,
nachdem ein Wassermolekül koordinativ gebunden wurde. Auch über diesen
Reaktionspfad entsteht der cyclische Ester 4 [67, Seite 177; 84, Seite 14-16].
Da ABA eine Lewissäure ist, ist die Wechselwirkung nicht nur auf Diole beschränkt. Mit
Lewisbasen wie z.B. Citrationen, Imidazol und Phosphationen kann ABA ebenfalls eine
Verbindung eingehen [85, Seite 11180]. Diese Tatsache muss bei der Wahl des
Puffers für die Affinitätstrennung berücksichtigt werden [86, Seite 5298].
Abb. 7: Bildung eines cyclischen Esters aus ABA und einem Diol. In Abb. 7A sind die gekoppelten Gleichgewichte dargestellt. Abb. 7B zeigt, dass Keq eine Kombination von Ktrigonal und Ktetraedrisch ist. Zwecks Übersichtlichkeit fehlt das koordinativ gebundene Wasser in Abb. 7B.
Die Ursache für die Esterbildung ist im Säure-Base-Verhalten von ABA zu suchen. Die
ABA-Ester stellen selbst Säuren dar, die im Vergleich zur freien ABA stärker sind.
Beispielsweise hat Phenylboronsäure, der im Vergleich zu ABA die Aminogruppe fehlt,
einen pKa-Wert von 9,0. Dagegen besitzt der Fructose-Ester einen Wert von 5,2 [84,
Seite 16]. Bei ABA in Abb. 7A, mit einem pKa-Wert von 8,8, ist daher die
Säurekonstante des Esters (Ka-ester) größer als die Säurekonstante der Boronsäure
(Ka-säure). Jedoch ist die Assoziationskonstante der Esterbildung Ktrigonal aus der
trigonalen ABA-Form häufig um 105 Größeneinheiten kleiner als die Assoziations-
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 19 -
konstante der Esterbildung Ktetraedrisch aus der tetraedrischen ABA-Form [84, Seite 15].
Die Esterbildung findet demnach bevorzugt aus dem tetraedrischen Zustand der ABA
statt. Der Anteil an dieser Zustandsform wird erhöht, wenn der pH-Wert erhöht wird.
Die Hydroxydionen können dann direkt an die trigonale Form der ABA binden und
Ktetraedrisch sowie auch die Esterausbeute erhöhen. Aus kinetischer Sicht ist die Bildung
über die tetraedrische Form ebenfalls um die Größenordnung 104 bis 106 bevorzugt [68,
Seite 443; 84, Seite 15].
Untersuchungen von Yan et al. und Springsteen et al. zur Esterbildung von
Phenylboronsäure mit verschiedenen Diolen verdeutlichen den Einfluss des pH-Wertes.
In diesen Studien wurde die Gesamtassoziationskonstante Keq bestimmt, die die Lage
des Gleichgewichts unter Einbeziehung der trigonalen und tetraedrischen Esterform
beschreibt (Abb. 7B). Exemplarisch sind in Tabelle 2 die Keq-Werte für Glucose und
Fructose bei unterschiedlichen pH-Werten dargestellt. Demnach erhöht sich Keq um
mehr als den Faktor 10, wenn der pH-Wert von 6,5 auf 8,5 ins basische Milieu
verschoben wird [86, Seite 5297; 87, Seite 11208]. Aus Tabelle 2 wird auch ersichtlich,
dass die chemische Natur des Diols einen starken Einfluss auf Keq besitzt.
Tabelle 2: Gesamtassoziationskonstanten Keq von Glucose und Fructose mit Phenyl-boronsäure bei verschiedenen pH-Werten [87, Seite 11208].
Zucker pH-Wert Keq [M-1]
6,5 0,84
7,5 4,6 Glucose
8,5 11
6,5 29
7,5 210 Fructose
8,5 560
Die Keq-Werte sind im Vergleich zu anderen Assoziationskonstanten, die man in der
Affinitätsseparation findet, klein. Bei größeren Wertstoffen ist eine Affinitätssteigerung
durch Mehrfachbindung von ABA an ein einzelnes Wertstoffmolekül möglich, wie es
beispielsweise bei Glycoproteinen durch ihren Kohlenhydratanteil vorstellbar ist.
Details zur Affinitätsseparation von Glycoproteinen mit ABA werden in Abschnitt 3.2
behandelt.
Der hohe pH-Wert, der für die Anwendung von ABA notwendig ist, wirkt sich negativ
auf proteinogene Wertstoffe aus. Hier muss im Vorfeld die pH-Stabilität solcher
biologischen Wertstoffe ermittelt werden. Daher wird auch versucht, organische
Boronsäuren zu synthetisieren, die einen niedrigeren pKs-Wert als ABA aufweisen und
somit Zielmoleküle bei kleineren pH-Werten binden sollten. Jedoch ist kein Ligand
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 20 -
hiervon kommerziell erhältlich [88, Seite 684; 89, Seite 463; 90, Seite 93; 91, Seite 63;
92, Seite 22].
3.2 ABA-Affinitätsseparation von Glycoproteinen Wie in Abschnitt 3.1.1 bereits dargestellt wird ABA als Affinitätsligand für Glycoproteine
verwendet. Im Fokus der Arbeit stand lange Zeit die Isolierung und strukturelle
Charakterisierung von Glycoproteinen mittels Lektinaffinitätsseparation aus Seehund-
blutplasma [29, Seite 2923]. In diesem Abschnitt soll die Eignung von ABA für die
Isolierung von Glycoproteinen aus Blutplasma, das zu den komplexesten Fluiden
überhaupt zählt, überprüft werden. Des Weiteren erfolgt die Anwendung eines
Standardverfahrens zur Trennung von glycosylierten und nicht-glycosylierten Proteinen
aus synthetischen Proteinmischungen [62, Seite 123-125]. Nachfolgend wird zunächst
die notwendige Immobilisierung von ABA an einen Polymerträger beschrieben.
3.2.1 Immobilisierung von m-Aminophenylboronsäure Bei dem Trägermaterial handelt es sich um das Methacrylatpolymer Toyopearl AF-
Tresyl-650M der Firma Tosoh (Stuttgart, Deutschland) mit einer spezifischen Ober-
fläche von 42 m2/g (Herstellerangaben). Das Trägermaterial besitzt eine hydrophile
und nicht geladene Oberfläche, um unspezifische Wechselwirkungen zu reduzieren.
Weiterhin besitzt der Träger eine gute mechanische und chemische Stabilität [31, Seite
84; 93, Seite 149]. Aktiviert ist das Material mit Trifluorethansulfonylchlorid
(Tresylchlorid), somit können Nucleophile leicht immobilisiert werden [42, Seite 86].
Der Reaktionsmechanismus für die Immobilisierung von ABA ist in Abb. 8 aufgezeigt.
Abb. 8: Immobilisierung von m-Aminophenylboronsäure an einen tresylierten Träger. Im Rahmen einer nucleophilen Substitution reagiert die primäre Aminogruppe von ABA mit dem elektrophilen Kohlenstoffatom unter Abspaltung der Tresylgruppe.
Für die Immobilisierung werden 0,5 g Toyopearl AF-Tresyl-650M mit 4 mL einer
21,3 µM ABA-Lösung in Kopplungspuffer (0,5 M Na2HPO4, 0,5 M NaCl, pH 8) versetzt.
Unter leichtem Schütteln ist die Reaktion nach ca. 4 h abgeschlossen. Nicht
umgesetzte Tresylgruppen werden mit Tris-Puffer (0,5 M, pH 8) geblockt. Die
Bestimmung des ABA-Gehaltes im Überstand erfolgt mittels UV/Vis-Spektroskopie bei
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 21 -
einer Wellenlänge von 296 nm in einer Quarzküvette mit einer Schichtdicke von 1 cm.
Als Referenzwert wird der Kopplungspuffer verwendet.
Im trockenen Zustand befinden sich laut Herstellerangaben ca. 80 µmol/g Tresyl-
gruppen auf dem Träger. Da das zu immobilisierende ABA ein kleines Molekül ist und
im Überschuss vorliegt, sollte eine annährend vollständige Substitution der Tresyl-
gruppen erreicht werden.
Der bestimmte ABA-Gehalt nach der Immobilisierung beträgt jedoch 145 µmol/g und
weicht somit um ca. 81 % vom theoretisch möglichen Gehalt ab. Erklärt werden kann
diese Beobachtung dadurch, dass ABA mit der Aminogruppe, den Hydroxygruppen
sowie dem negativ geladenen Boratom Wasserstoffbrückenbindungen mit der
hydrophilen Trägeroberfläche ausbildet.
In einem zweiten Versuch erfolgt die Überprüfung dieser Vermutung, indem ein Träger
mit bereits geblockten Tresylgruppen verwendet wird. Zur Herstellung wird der Träger
einige Stunden mit Kopplungspuffer behandelt und die Tresylgruppen anschließend mit
Trispuffer geblockt. Das Adsorbens wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. 4 mL
der ABA-Lösung in Kopplungspuffer werden zu dem Adsorbens gegeben. Zu erwarten
ist, dass die Konzentration an ABA im Überstand konstant bleibt. Tatsächlich zeigt die
Bestimmung von ABA nach 4 h Einwirkzeit, dass 55 µmol/g physisorbiert sind. Zieht
man diese, durch unspezifische Adsorption erreichte ABA-Beladung vom im ersten
Versuch erhaltenen Beladungswert von 145 µmol/g ab, lässt sich damit der
tatsächliche ABA-Gehalt zu 90 µmol/g abschätzen, der dem theoretischen Wert
deutlich näher kommt und eine vollständige Umsetzung der Tresylgruppen mit ABA
vermuten lässt.
3.2.2 Blutplasma Für die Anreicherung von Glycoproteinen aus der Realprobe Blutplasma werden 0,5 g
trockenes ABA-Adsorbens in eine 10 x 0,5 cm Glassäule überführt und mit Laufpuffer
(0,02 M HEPES, 0,5 M NaCl, 0,02 M MgCl2, pH 8,5) equilibriert. Zur Desorption enthält
der Laufpuffer 70 mM Tris, regeneriert wird mit einem Acetatpuffer (0,2 M
Natriumacetat, pH 4,5). Der Fluss beträgt 1,6 mL/min. Plasmaproben werden im
Vorfeld zu gleichen Teilen mit Laufpuffer verdünnt. 200 µL werden anschließend auf
die Säule gegeben. Die Desorptionsfraktionen werden gesammelt, durch Ultrafiltration
(MWCO 10 kDa (Ausschlussgröße)) in Reinstwasser überführt, gefriergetrocknet und
anschließend der 2D-Gelelektrophorese zugeführt (vgl. Abschnitt 3.3.6.3).
In Abb. 9A ist ein beispielhaftes Chromatogramm zu sehen. Ein schwacher
Desorptionspeak ist zu erkennen, was den Schluss zulässt, dass nur wenig
glycosylierte Proteine an das Trägermaterial gebunden haben. Ebenfalls ist
Trägermaterial ohne ABA-Ligand verwendet worden. Hier erscheint kein
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 22 -
Desorptionspeak (Abb. 9B). Daher kann ein Einfluss des Trägermaterials auf den
Verlauf der Affinitätsseparation ausgeschlossen werden.
Abb. 9: ABA-Affinitätsseparation von Seehundplasma mit ABA-Toyopearl AF-Tresyl-650M (A). Daneben ist eine Auftragung von Plasma auf den Träger ohne ABA-Liganden zu sehen (B).
Abb. 10A zeigt ein 2D-Gel mit dem aufgetrennten Blutplasma. Bei dem rechten Gel
(Abb. 10B) handelt es sich um die Visualisierung der Desorptionsfraktionen. Jedoch ist
hier nur ein schwacher, sehr breiter Spot bei etwas unterhalb des 72 kDa-
Markerproteins zu erkennen. In Abb. 10B ist dieses Protein ebenfalls als verschmierter
Spot zu erkennen. Dies deutet daraufhin, dass in diesem Fall nur das Serumalbumin
aus dem Seehundplasma angereichert wird. Zum Vergleich: Bovines Serumalbumin
(BSA) ist ca. 66 kDa und humanes Serumalbumin ca. 65 kDa groß [7, Seite 88; 94,
Seite 639]. Dies lässt den Schluss zu, dass es sich um ein unspezifisches
Adsorptionsverhalten handelt. Dass keine anderen Proteine identifiziert werden
konnten, liegt eventuell an der zu gering aufgegebenen Gesamtproteinmenge, die aus
drei vereinigten Desorptionsfraktionen gewonnen worden sind.
Umfangreiche Untersuchungen zum Adsorptionsverhalten komplexer Proteingemische
an ABA-Sepharose haben Brena et al. durchgeführt [95, Seite 112]. Sie verwendeten
humanes Blutplasma. Unter ähnlichen Trennbedingungen (Laufpuffer: 0,02 M HEPES,
0,01 M MgCl2, pH 8,5; Desorptionspuffer: 0,2 M Sorbitol in Laufpuffer) konnten u.a.
Immunoglobuline, Transferrin und Haptoglobin aber auch humanes Serumalbumin
identifiziert werden. Entscheidenden Anteil an der Bindung bestimmter Glycoproteine
scheint der Zusatz von Mg2+-Ionen im Laufpuffer zu haben. Ohne Mg2+-Ionen konnten
Brena et al. zwar kein humanes Serumalbumin identifizieren, aber auch nicht die
Glycoproteine Transferrin und Haptoglobin.
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 23 -
Abb. 10: 2D-Gele des Seehundplasmas (A) und der Desorptionsfraktion (B). Der Protein-marker ist bei (A) auf der rechten, bei (B) auf der linken Seite aufgetragen worden. Für die 2D-Gelelektrophorese werden 7 cm IPG-Streifen (pH 3-10) und entsprechende Fertiggele (Tris-HCl, 8-16 %) für die Mini-Protean-Zelle (Bio-Rad) verwendet.
3.2.3 Synthetische Proteinmischungen Da die Abtrennung von Glycoproteinen aus dem komplexen Fluid Blutplasma nicht
zufriedenstellend ist, soll in diesem Abschnitt die Anwendbarkeit von ABA auf
Proteinmischungen demonstriert werden, die nur aus wenigen Komponenten bestehen.
Die Glycoproteine GOD und Fetuin sowie das nicht-glycosylierte BSA werden auf die
kommerziell erhältliche ABA-Sepharose (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
zunächst einzeln und anschließend als Gemisch aufgetragen. Das Adsorbens wird in
eine 10 x 0,5 mm Glassäule eingeschlämmt und anschließend mit Laufpuffer (20 mM
HEPES, 20 mM MgCl2, 0,2 M NaCl, pH 8,5) equilibriert. Die Proteine werden im
Laufpuffer gelöst, wobei die Konzentrationen bei Einzel- oder Gemischaufgabe in etwa
equimolar sind (GOD 2,0 mg/mL, Fetuin 0,6 mg/mL, BSA 0,8 mg/mL). Die Desorption
findet mit einem sorbitolhaltigen HEPES-Puffer statt (20 mM HEPES, 100 mM Sorbitol,
pH 8,5), gefolgt von einem Regenerationsschritt mit einem Acetatpuffer (0,2 M
Natriumacetat, pH 5,0) [62, Seite 123-125]. Der Fluss während der Durchführung
beträgt 1,6 mL/min. Durchlauf- und Desorptionsfraktion werden gesammelt, mittels
Ultrafiltration in Reinstwasser überführt und anschließend gefriergetrocknet. Für die
1D-Gelelektrophorese werden TGX-Minigele verwendet. Von den Proteinstandards
und den gefriergetrockneten Proben werden wässrige Lösungen (0,02 mg/mL)
hergestellt. Die Gemischlösung wird direkt verwendet. Alle Lösungen werden mit
Laemmli-Puffer (62,5 mM Tris-HCl, 2 % (w/v) SDS (Natriumdodecylsulfat), 25 % (v/v)
Glycerol, 0,01 % (w/v) Bromphenolblau, pH 6,8) und -Mercaptoethanol gemischt um
anschließend für 5 min auf 95 °C erhitzt zu werden. Das Verhältnis zwischen
Probenlösung, Laemmli-Puffer und -Mercaptoethanol beträgt 20:19:1 (v/v/v). Nach
dem Abkühlen werden je 5 µL in die Taschen der Gele überführt. Die
Gelelektrophorese findet anschließend bei 100 V in SDS-Laufpuffer (25 mM Tris,
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 24 -
192 mM Glycin, 0,1 % SDS w/v) statt. Die Färbung der Gele erfolgt mittels Coomassie-
Brillant-Blau.
In Abb. 11 sind die Affinitätschromatogramme der einzelnen Proteine und die Aufgabe
als Gemisch zu sehen. Zu erkennen ist, dass bei allen drei Einzelaufgaben ein
Desorptionspeak erscheint, der bei der Einzelaufgabe von GOD (Abb. 11A) sowie der
Gemischaufgabe (Abb. 11C) am deutlichsten ausgeprägt ist. Bei Fetuin (Abb. 11B) und
dem nicht glycosylierten BSA (Abb. 11C) ist der Desorptionspeak ähnlich intensiv.
Abb. 11: Affinitätschromatogramme der Einzelaufgaben von GOD (A), Fetuin (B) und BSA (C) und als Gemischaufgabe der drei Proteine (D).
Das von der Durchlauf- und der Desorptionsfraktion angefertigte 1D-Gel ist in Abb. 12
zu sehen. Da GOD aus zwei gleichschweren Untereinheiten besteht, zeigt sich dessen
Bande bei 80 kDa, die von BSA bei 67 kDa und von Fetuin bei 48 kDa.
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 25 -
Abb. 12: 1D-Gel der Standards und Proben. Belegung der Gel-Taschen: 1. Marker, 2. BSA, 3. GOD, 4. Fetuin, 5. Durchlauffraktion, 6. Desorptionsfraktion, 7. leer, 8. Ausgangs-proteingemisch, 9. Laemmli-Puffer, 10. Marker.
Von den applizierten Standards (Abb. 12, Bahn 2-4) ist nur die GOD-Bande deutlich zu
erkennen. BSA zeigt sich als schwache Bande bei ca. 67 kDa, der Fetuin-Standard ist
ebenfalls nur schwach zu erkennen. Hinsichtlich der Konzentration der Standards
wurde auf eine Optimierung zur besseren Visualisierbarkeit verzichtet. Bahn 8 zeigt
das Ausgangsproteingemisch, welches auf die ABA-Säule aufgegeben wurde. Hier
können GOD, BSA und Fetuin identifiziert werden. Bahn 5 zeigt die Durchlauffraktion,
wobei das gleiche Auftrennungsmuster wie beim Ausgangsgemisch zu erkennen ist.
Die Desorptionsfraktion ist in Bahn 6 zu sehen. Hier können GOD und BSA identifiziert
werden, die Fetuin-Bande fehlt.
Das Vorhandensein von BSA in der Desorptionsfraktion zeigt die Neigung von ABA zu
unspezifischen Wechselwirkungen (vgl. Abschnitt 3.4), selbst bei Anwendung auf
einfache Proteinmischungen. Das Fehlen von Fetuin in der Desorptionsfraktion ist
vermutlich auf die Sialinsäurereste zurückzuführen, die sich endständig an den
Glycanen befinden [22, Seite 18265]. Unter den basischen Trennbedingungen ist
Sialinsäure deprotoniert und negativ geladen. Dadurch kann es zu Abstoßungskräften
zum ebenfalls negativ geladenen ABA-Liganden kommen. Sterisch betrachtet, können
die Sialinsäurereste die weiteren Monosaccharideinheiten durch ihre Endständigkeit
eventuell abschirmen, so dass für ABA keine Bindungsstelle zugänglich ist.
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 26 -
3.2.4 Rückschlüsse ABA ist als Ligand für die selektive Anreicherung von Glycoproteinen aus
synthetischen Gemischen als auch komplexen Fluiden nicht geeignet. Dies wurde
dadurch gezeigt, dass nicht-glycosylierte Albumine mit abgetrennt wurden. Ein
ähnliches Bindungsverhalten wurde auch durch Liu et al. beobachtet. Sie
beschichteten elektrochemisch Glaskohlenstoffelektroden mit einem Polymer, auf dem
ABA immobilisiert ist. Cyclovoltametrische Interaktionsstudien mit GOD und BSA
zeigten, dass beide Proteine an ABA binden können. GOD konnte mit Sorbitol
desorbiert werden, BSA dagegen nur unzureichend [96, Seite 215].
Etliche Publikationen, die ABA zur Glycoproteinanreicherung beschreiben, setzen nur
synthetische Mischungen ein [80, Seite 1676; 82, Seite 117]. Wird die Aufreinigung von
Realproben beschrieben, sind anschließend immer zusätzliche Schritte notwendig, um
zum aufgereinigtem Wertstoff zu gelangen. Bei dem bereits aufgeführten Beispiel zur
Aufreinigung von Erythropoetin aus Zellaufschlüssen waren nach der Affinitäts-
separation mit ABA-Sepharose die Durchführung einer Anionenaustausch- und Gel-
permeationschromatographie erforderlich, um das Produkt in der benötigten Reinheit
zu isolieren [79, Seite 281].
3.3 Entwicklung eines Aufreinigungsverfahrens für Benzoylformiatdecarboxylase
Der Nachteil der unspezifischen Adsorption aus Vielstoffgemischen kann umgangen
werden, wenn vorher alle ABA-Moleküle auf dem Adsorbens mit einem einzigen Stoff
abgesättigt werden und so keine Angriffsplätze für die unspezifische Adsorption
bestehen. In diesem Abschnitt wird deshalb ein Verfahren beschrieben, bei dem ein
Coenzym in einem vorgelagerten Schritt an das ABA-Adsorbens gebunden wird. Mit
diesem Adsorbens soll ein entsprechendes Zielenzym aufgereinigt werden. Die
Desorption des Enzym-Cofaktor-Komplexes erfolgt durch einen einfachen pH-
Gradienten.
3.3.1 Benzoylformiatdecarboxylase Benzoylformiatdecarboxylase (BFD) ist ein thiaminpyrophosphatabhängiges Enzym
des Mandelatstoffwechselweges in Pseudomonas putida, einer gram-negativen
Bakterienart. Es katalysiert die nichtoxidative Decarboxylierung von Benzoylformiat zu
Benzaldehyd und Kohlenstoffdioxid. Das Enzym ist aufgebaut aus vier identischen
Untereinheiten, die jeweils ca. 55 kDa schwer sind (Abb. 13) [97, Seite 955; 98, Seite
9921]. Als Cofaktor benötigt jede Untereinheit neben Thiaminpyrophosphat (TPP) auch
Ca2+- und Mn2+-Ionen.
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 27 -
Abb. 13: Darstellung einer Untereinheit der BFD als Stick-Modell (links) und als Ribbon-Modell (rechts); TPP (1), Mn2+ (2), Ca2+ (3). PDB-Datei 1bfd aus [98].
Neben der Decarboxylaseaktivität besitzt das Enzym auch eine Carboligaseaktivität.
Hierbei katalysiert BFD die Reaktion zwischen einer -Ketocarbonsäure und einem
Aldehyd. In Abb. 14 ist das allgemeine Reaktionsschema dargestellt.
Abb. 14: Allgemeines Reaktionsschema der durch BFD katalysierten C-C-Kupplungs-reaktion zwischen einem Aldehyd und einer -Ketocarbonsäure [99, Seite 312].
Die dabei gebildeten chiralen 2-Hydroxyketone, die wichtige Bausteine in der
chemischen und pharmazeutischen Industrie sind, entstehen mit hoher
Enantiomerenreinheit [100, Seite 520]. Das Vorhandensein eines chiralen Zentrums
und einer prochiralen Carbonylgruppe machen 2-Hydroxyketone zugänglich für weitere
Umsetzungen [101, Seite 536]. Ob die Carboligaseaktivität von BFD von
physiologischer Bedeutung für Pseudomonas putida ist, ist bisher nicht geklärt [102,
Seite 345]. Durch Wilcocks et al. wurde die Carboligaseaktivität zum ersten Mal
beschrieben. Sie beobachteten die Bildung von (S)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon in
Gegenwart von Benzoylformiat und Acetaldehyd [103, Seite 1701; 104, Seite 1060].
Hinsichtlich der Substratspezifität von BFD besteht eine bevorzugte Umsetzung von
aromatischen Substraten gegenüber aliphatischen Substraten [105, Seite 2201]. Das
Vorhandensein einer Carboxygruppe, wie im Benzoylformiat enthalten, ist für die
Carboligaseaktivität nicht von Bedeutung. Der korrespondierende Aldehyd der
-Ketocarbonsäure wird ebenfalls umgesetzt. Benzaldehyd, als korrespondierender
Aldehyd zu Benzoylformiat wurde für die Synthese chiraler 2-Hydroxyketone eingesetzt.
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 28 -
Des Weiteren können meta-substituierte Benzaldehydderivate als Substrate dienen
[106, Seite 1487].
Die BFD, die in dieser Arbeit aufgereinigt werden soll, wird rekombinant in E. coli
exprimiert. Im Vorfeld wurden auf DNA-Ebene der BFD sechs Codons für Histidin am
3’-Ende eingeführt. Auf Proteinebene sind am C-terminalen Ende dementsprechend
sechs Histidinreste vorhanden [106, Seite 1485]. Das macht die rekombinante BFD
zugänglich für die Metallchelat-Affinitätssepartion an Ni2+-Ionen, die an träger-
gebundene Nitriloessigsäure immobilisiert sind. Ni2+ besitzt vier Koordinationsstellen,
wobei zwei besetzt sind durch die Nitriloessigsäure. Die verbleibenden Stellen werden
durch den Histidin-Tag komplexiert, wobei BFD gebunden wird. Desorbiert wird mit
Hilfe eines Puffers, der einen Komplexbildner enthält, z.B. Imidazol, und somit BFD
kompetitiv vom Ni2+ verdrängt [107, Seite 541].
Nachteilig können sich jedoch Kreuzreaktivitäten mit anderen histidinreichen Proteinen
auswirken. Weiterhin muss der Histidin-Tag nach der Aufreinigung entfernt werden,
was einen weiteren Aufreinigungsschritt erfordert. Wird die BFD direkt aus
Pseudomonas putida isoliert, müssen zwangsläufig mehrstufige konventionelle Protein-
aufreinigungsmethoden verwendet werden. Typische Protokolle beinhalten eine
Fällung mit Ammoniumsulfat sowie Aufreinigungsschritte mittels Anionenaustausch-
chromatographie und Farbstoff-Affinitätsseparation [106, Seite 1485].
Grundsätzlich ist ein Verfahren wünschenswert, das BFD in einem Schritt aufreinigt,
um Ausbeuteverluste zu reduzieren. Dies ist durch die Metallchelat-Affinitätsseparation
aufgrund der nachfolgenden Prozedur zur Entfernung des Histidin-Tags nicht gegeben.
3.3.2 Beschreibung der ligandvermittelten Affinitätsseparation Maestas et al. führten eine Aufreinigungsmethode ein, die es ermöglichen sollte
Enzyme mittels ABA-Affinitätsseparation aufzureinigen, welche eigentlich keine Affinität
zu ABA aufweisen. Viele dieser Enzyme benötigen für ihre Funktion Cofaktoren. Diese
enthalten häufig diolhaltige Gruppen und können mit ABA wechselwirken. ABA wird
demnach mit dem entsprechenden Cofaktor für das aufzureinigende Enzym
abgesättigt. Das Enzym bindet spezifisch an den Cofaktor, unerwünschte Bestandteile
werden entfernt (Abb. 15). Die Desorption erfolgt durch Spaltung der Bindung zwischen
ABA und dem Cofaktor [108, Seite 227]. In der Literatur wird das Verfahren auch als
ligandvermittelte Affinitätsseparation bezeichnet [63, Seite 78]. Neben diolhaltigen
Cofaktoren können auch alle jenen Cofaktoren verwendet werden, die in
ausreichendem Maße an ABA binden [108, Seite 228].
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 29 -
Abb. 15: Schematischer Trennzyklus der ligandvermittelten Aufreinigung von BFD. 1: Absättigung mit TPP. 2: Aufgabe des BFD-haltigen Gemisches. 3: Adsorption von BFD an TPP und Ausspülen der unerwünschten Stoffe. 4: Desorption von TPP und damit auch der daran gebundenen BFD. 5: Regeneration.
Auf dieser Grundlage soll ein Affinitätsseparationsverfahren entwickelt werden, bei
dem BFD aus einem E. coli-Zellaufschluss aufgereinigt wird. Hierzu wird der Cofaktor
Thiaminpyrophosphat (TPP) an ABA-Trägermaterialen gebunden. Das geschieht
vermutlich über die Diphosphatgruppe von TPP. Wie in Abschnitt 3.1.2 erwähnt, sind
bereits Boronsäure-Phosphat-Komplexe beschrieben worden [85, Seite 11180]. Die
Strukturformel von TPP ist in Abb. 16 dargestellt.
Abb. 16: Strukturformel von Thiaminpyrophosphat.
Der Vorteil dieser, im Folgenden als TPP-vermittelte Affinitätsseparation bezeichneten,
Methode ist, dass eine simple pH-Verschiebung durch Verwendung eines schwach
sauren Puffers zur Desorption des Enzym/Cofaktor-Komplexes ausreicht. Gleichzeitig
nutzt man die hohe Selektivität und Affinität der Enzym/Cofaktor-Wechselwirkung aus.
3.3.3 Verwendete Trägermaterialien und Immobilisierung von TPP Für die Versuche werden zwei Adsorbentien verwendet. Die TPP-vermittelte
Affinitätsseparation erfolgt unter Anwendung des in Abschnitts 3.2.1 beschriebenen
ABA-Polymer-Adsorbens.
Neben dem ABA-Adsorbens wird ein zweites Adsorbens für vergleichende
Untersuchungen hergestellt, bei dem TPP direkt an Toyopearl AF-Tresyl-650M
immobilisiert ist. Die direkte Immobilisierung von TPP an verschiedene
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 30 -
Trägermaterialien wird bereits in der Literatur beschrieben. Ein Verfahren zeigt die
Anbindung von TPP, vermutlich über die Diphosphatgruppe, an Aminoethyl-Sepharose
nach Aktivierung mit 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) [109, Seite
242; 110, Seite 888]. An Diazobenzoylaminohexyl-Sepharose kann TPP über den
Thiazolring ebenfalls erfolgreich immobilisiert werden [111, Seite 15].
Eine direkte Immobilisierung von TPP an Toyopearl AF-Tresyl-650M sollte aufgrund
der vorhandenen primären Aminogruppe möglich sein. Hierbei wird eine 0,1 M TPP-
Lösung in Phosphatpuffer hergestellt, von der 4 mL auf 0,5 g Trägermaterial gegeben
werden. Die nicht umgesetzten Tresylgruppen werden nach 4 h mit Tris-Puffer geblockt.
Das erhaltene Adsorbens weist eine leicht orange Färbung auf.
3.3.4 Bindungsstudien mit TPP am ABA-Adsorbens Der Gehalt an TPP, der am ABA-Adsorbens gebunden werden kann, wird in
verschiedenen Bindungsstudien untersucht. Variiert werden die Einflussparameter
Temperatur und Reaktionsdauer. Für die Untersuchung werden 0,5 g trockenes ABA-
Adsorbens in eine 10 mL Glassäule gefüllt. Anschließend werden 10 mL verschieden
konzentrierter TPP-Lösungen in Laufpuffer (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 2 mM MgCl2,
pH 8,5) auf die Säule gegeben. Der Konzentrationsbereich erstreckt sich von 0,02 bis
0,3 M. Zu beachten ist, dass bei höheren TPP-Konzentrationen der pH-Wert mit
Natronlauge erneut eingestellt werden muss. Das Adsorbens wird zusammen mit der
TPP-Lösung inkubiert. Die Bedingungen hinsichtlich Temperatur und Einwirkzeit finden
sich in Tabelle 3.
Tabelle 3: Zusammenstellung der Parameter und Ergebnisse der Bindungsstudien von TPP an ABA-Toyopearl
Nr. TPP-Konzentration
[mM] Volumen
[mL] Reaktionsdauer
[h] Temperatur
[°C]
TPP immobilisiert, bezogen auf ABA
[%]
1 20 5 Durchfluss RT n. d.
2 20 10 Durchfluss RT n. d.
3 20 10 1 RT n. d.
4 20 10 1 40 ca. 0,01
5 330 10 16 40 0,95
6 170 10 16 40 0,21
7 200 10 16 80 0,12
Anschließend erfolgt die Entfernung des TPP-Überschusses durch Spülen mit Lauf-
puffer. Die Desorption des gebundenen TPPs wird durch die Erniedrigung des
pH-Wertes realisiert (Desorptionspuffer: 0,01 M KH2PO4, 0,15 M NaCl, 2 mM MgCl2,
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 31 -
pH 6). Diese Fraktionen werden in geeigneten Messkolben aufgefangen und auf das
jeweilige Volumen mit Laufpuffer eingestellt. Ein exemplarisches Chromatogramm ist in
Abb. 17 dargestellt.
Abb. 17: Chromatogramm eines typischen Versuches mit TPP. 1: Entfernen des Über-schusses von TPP durch Waschen mit Laufpuffer. 2: Desorption von TPP
Die Bestimmung von TPP erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von 296 nm in
Quarzküvetten. Eine lineare Kalibrierung erfolgt im Bereich von 4,3 µM bis 56,7 µM
TPP in Laufpuffer [112, Seite 717]. Von den Desorptionsfraktionen werden zur
Bestimmung geeignete Verdünnungen hergestellt.
Zur Überprüfung der Vermutung, dass die Bindung von TPP über die Diphosphat-
gruppe erfolgt, wird der Versuch in beschriebener Weise mit Thiamin durchgeführt.
Diesem Molekül fehlt die Diphosphatgruppe. Die Strukturformel von Thiamin ist in
Abb. 18 gegeben.
Abb. 18: Strukturformel von Thiamin.
In der letzten Spalte von Tabelle 3 sind die Ergebnisse zusammengefasst. Berechnet
wurde das prozentuale Verhältnis der gebundenen Stoffmenge von TPP zu der
Gesamtstoffmenge an ABA pro Gramm Trägermaterial.
Es zeigt sich, dass sich möglichst hohe TPP-Konzentrationen, lange Einwirkzeiten und
erhöhte Temperaturen günstig auf die Beladung des ABA-Adsorbens mit TPP aus-
wirken. Als Optimum kristallisiert sich eine TPP-Konzentration von 0,33 M bei 40 °C
und 16 h Einwirkzeit heraus (Zeile 5, Tabelle 3). Unter diesen Bedingungen kann an
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 32 -
ca. 1 % aller ABA-Moleküle TPP gebunden werden. Das entspricht einer Dichte an
TPP von 0,9 µmol/g bzw. 0,021 µmol/m2, bei einer spezifischen Oberfläche des Träger-
materials von 42 m2/g und einer ABA-Dichte von 90 µmol/g.
Versuche die TPP-Beladung an ABA durch weitere Temperaturerhöhung zu steigern,
scheitern an der begrenzten Hitzestabilität des Adsorbens. Weiterhin kann die
gebundene TPP-Menge nicht durch höhere TPP-Konzentrationen vergrößert werden,
da mit 0,33 M die Sättigungskonzentration in der Laufpuffer-Lösung erreicht ist.
Zudem zeigt auch TPP unter basischen Bedingungen sowie unter erhöhten
Temperaturen nur eine begrenzte Stabilität [113, Seite 55]. Dies schließt auch eine
Erhöhung des pH-Wertes zur Beladungssteigerung aus und ist vermutlich ursächlich
für die geringe Oberflächenbelegung von TPP am ABA-Adsorbens. Jedoch können der
Literatur in diesem Zusammenhang keine Daten unter experimentell vergleichbaren
Bedingungen entnommen werden, um die Stabilität von TPP abschätzen zu können.
Viele ältere Studien befassen sich mit dem Abbau von TPP und Thiamin bei
Temperaturen, die bei der Zubereitung von Lebensmitteln zu finden sind. Bei einer
Temperatur von 100 °C ist nach einer Stunde der Großteil des Thiamins in wässrigen
Puffersystemen abgebaut [114, Seite 129]. Vermutlich wird dadurch die Abnahme der
TPP-Konzentration bei 80 °C bewirkt (Zeile 7, Tabelle 3). Einer anderen Studie kann
entnommen werden, dass bei Temperaturen um 40 °C und nach 16 h Inkubationszeit
bei pH 8,2 kein vollständiger Abbau von Thiamin stattfindet. Hier sind noch ca. 6 % des
Thiamins nachweisbar [115, Seite 186].
Nachfolgend soll abgeschätzt werden, ob unter den optimierten TPP-Bindungs-
bedingungen eine ausreichende TPP-Menge auf der Oberfläche zur Adsorption von
BFD zur Verfügung steht. Für die Bestimmung des Platzbedarfes eines BFD-Moleküls
ist daher die größtmögliche, zweidimensionale Projektion des Enzyms aus der ent-
sprechenden PDB-Datei 1bfd mit der Swiss-PDB-Viewer 4.0-Software ermittelt worden
[98, Seite 9918]. Die Projektion entspricht einem Quadrat mit einer Kantenlänge von
7 nm. Geht man davon aus, dass die angenommen Quadrate ohne Lücken aneinan-
dergereiht werden, berechnet sich die theoretische Oberflächenbelegung AO in
µmol/m2 wie folgt.
ABFD
24
o NA
10A (4)
ABFD Flächenbedarf BFD [nm2]
NA Avogadrokonstante [mol-1]
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 33 -
Es ergibt sich eine theoretische maximale Oberflächenbelegung von BFD zu
0,034 µmol/m2. Da die TPP-Belegung nur bei 0,021 µmol/m2 liegt, kann die
tatsächliche, maximal mögliche Oberflächenbelegung mit BFD auch nur 0,021 µmol/m2
betragen. Der Gesamtplatzbedarf der BFD pro Gramm Träger berechnet sich dann zu
26 m2/g, was 62 % der Gesamtfläche des Trägermaterials entspricht. Somit ist eine
1 %ige Belegung für das weitere Verfahren ausreichend, wenn die Bindung des
Enzyms an den Cofaktor ungehindert abläuft.
Ähnliche Ligandendichten von immobilisierten TPP für Affinitätsseparationsverfahren
können auch der Literatur entnommen werden. O’Brien et al. beschreiben für die
Immobilisierung von TPP an Sepharose 4B eine Ligandendichte von 6 µmol/mL [116,
Seite 19]. Das entspricht etwa 1,5 µmol/g trockener Sepharose mit der Annahme, dass
1 g Sepharose auf 4 mL bei Benetzung anschwillt. Auch niedrigere Ligandendichten
wurden beschrieben. Matsura et al. stellten einen TPP-Sepharose-4B-Träger mit
0,04 µmol/mL TPP (0,01 µmol/g) her [109, Seite 242].
Im Vergleich zu anderen in der Literatur beschriebenen ligandvermittelten Affinitäts-
separationsverfahren ist die Immobilisierungsausbeute von TPP an ABA klein.
Maestas et al. beschreiben, dass für NAD+ 39 % aller ABA-Moleküle mit diesem
Cofaktor versehen werden konnten. NAD+ besitzt durch die Ribose-Einheit eine Diol-
gruppe, womit die höheren Ausbeuten erklärt werden können. In der gleichen Studie
wurden auch Untersuchungen mit Pyridoxal, einem Cofaktor der nicht über eine
Diolgruppe verfügt, vorgenommen. Hier konnte nur an 2 % aller ABA-Moleküle
Pyridoxal gebunden werden [108, Seite 228].
Weiterführende Informationen zur TPP-ABA-Bindung wurden durch einen Referenz-
versuch mit Thiamin gewonnen. Die in analoger Weise durchgeführten Versuche
zeigen jedoch ähnliche Chromatogramme wie mit TPP. Daraus kann geschlossen
werden, dass Thiamin ebenfalls an ABA bindet und dass die Bindung nicht, entgegen
des in Abschnitt 3.1.2 aus der Literatur zitierten kovalenten Bindungsmechanismus,
über die Diphosphatgruppe erfolgt. Eine mögliche Erklärung ist, dass ionogene
Wechselwirkungen zwischen dem positiv geladenen quaternären Stickstoffatom des
TPP bzw. Thiamins und dem negativ geladenen Boratom verantwortlich sind, was im
Folgenden untersucht wird. Dennoch sollte die TPP-vermittelte Affinitätsseparation mit
BFD möglich sein, da eine ausreichende Menge TPP auf dem ABA-Adsorbens
vorhanden ist. In Abschnitt 3.3.6 wird darauf eingegangen.
3.3.5 Bindungsstudien mittels 31P-NMR-Spektroskopie Die Vermutung, dass ionogene Wechselwirkungen für die Adsorption von TPP am
ABA-Adsorbens und nicht kovalente Bindungen verantwortlich sind, soll mittels 31P-
NMR-Spektroskopie überprüft werden. Das 31P-Isotop mit dem Kernspin 1/2 ist das
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 34 -
einzige natürliche Phosphorisotop und einer der empfindlicheren Kerne in der NMR-
Spektroskopie [117, Seite 228]. In zwei Experimenten wird zum einen TPP alleine und
ein Gemisch von TPP und ABA in Lösung unter basischen Bedingungen vermessen.
Erfolgt eine Bindung über die Diphosphatgruppe, sollten die gemessenen chemischen
Verschiebungen P und das Kopplungsmuster bei beiden Experimenten unterschiedlich
sein.
Zur Probenvorbereitung werden je zwei 20 µM Lösungen von TPP und ABA in D2O
hergestellt, die anschließend zu gleichen Teilen gemischt werden. Der pH-Wert wird
auf 9-10 mit 2 M NaOH-Lösung eingestellt und ein Aliquot in ein 10 mm NMR-
Röhrchen überführt. Als externer Standard dient 85 % H3PO4. Für die Aufnahme des
TPP-Spektrums erfolgt die Vermessung der 20 µM TPP-Lösung. Gemessen wird bei
einer Frequenz von 121,5 MHz mit einem 10 mm Mehrkern-Probenkopf. Für die 1H-
Breitbandentkopplung wird die Waltz16-Pulssequenz verwendet. Die Wiederholzeiten
betragen 5 s. In Abb. 19 sind beide Spektren dargestellt.
Abb. 19: 31P-NMR-Spektren von TPP (A) und TPP und ABA (B).
Befindet sich TPP alleine in basischer Lösung treten drei Signale mit den Signal-
schwerpunkten bei -5,40 ppm (t), -9,42 ppm (d) und -10,32 ppm (d) ppm auf (Abb. 19A).
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 35 -
Das Singulett bei -12,21 ppm ist eine Verunreinigung, da es auch bei der Vermessung
von reinem D2O auftrat. Werden TPP und ABA zusammen vermessen, ändert sich das
Spektrum stark. Das Dublett bei -10,3 ppm verschwindet und aus dem Triplett bei -
5,40 ppm wird ein Dublett. Zudem sind die Signale in Abb. 19B, bis auf das Signal der
Verunreinigung, schwach tieffeldverschoben.
Aufgrund der Protonierung der Diphosphatgruppe bei niedrigen und ihrer
Deprotonierung bei hohen pH-Werten ist die chemische Verschiebung der 31P-Signale
stark vom pH-Wert abhängig. Insbesondere bei dem terminalen Phosphoratom der
Diphosphatgruppe steigt die chemische Verschiebung von ca. -11 ppm auf -6 ppm,
wenn der pH-Wert von 3 auf 8 erhöht wird. Darüber hinaus bleibt sie konstant. Die
chemische Verschiebung des integralen Phosphoratoms steigt dagegen um ca. 1 ppm
von -11,5 auf -10,5 ppm [118, Seite 104; 119, Seite 313].
Das 11B-Isotop mit einer natürlichen Häufigkeit von 80 % besitzt einen Kernspin von 3/2
[120, Seite 134]. Bildet TPP mit ABA einen binären Komplex wie in Abb. 20
vorgeschlagen, sollte es zusätzlich zur Spin-Spin-Kopplung des Boratoms mit einem
Phosphoratom kommen. Dabei sollte das als Dublett auftretende Signal des Phosphor-
atoms in ein Dublett von Quartett aufgespaltet werden [120, Seite 134].
Abb. 20: Mögliche binäre Komplexe von ABA mit TPP.
Da das 31P-NMR-Spektrum in Abb. 19B dieses Muster nicht aufweist, ist davon
auszugehen, dass die vermutete Wechselwirkung über die Diphosphatgruppe nicht
stattfindet. Warum für TPP in Abb. 19A ein abweichendes Spektrum erhalten wurde,
kann abschließend nicht eindeutig geklärt werden. Vergleicht man die Kopplungs-
konstanten mit Literaturwerten von TPP und anderen biochemisch relevanten Di- bzw.
Triphosphaten (z.B. Adenosindiphosphat bzw. Adenosintriphosphat) stellt man eine
hohe Übereinstimmung fest [118, Seite 104; 119, Seite 312; 121, Seite 3251]. Die
gemessenen Kopplungskonstanten betragen, wie die der Literatur entnommenen, ca.
20 ppm. Daraus kann geschlossen werden, dass es sich um geminale Phosphor-
kopplungen handelt. Da innerhalb der Messreihe die TPP-Lösung zuletzt vermessen
wurde, kann aufgrund der recht starken basischen Bedingungen ein beginnender
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 36 -
Abbau von TPP nicht ausgeschlossen werden, wodurch sich chemische
Verschiebungen und die Kopplungsmuster ändern können.
Anhand der 31P-NMR-Messdaten kann die Vermutung untermauert werden, dass
ionogene Wechselwirkungen für die Adsorption von TPP am ABA-Adsorbens
verantwortlich sind.
3.3.6 Affinitätsseparation Die Protein-Cofaktor-Wechselwirkung zwischen TPP und TPP-abhängigen Enzymen
ist aufgrund der physiologischen Relevanz stark genug, um Affinitätstrennungen
durchzuführen. Dissoziationskonstanten kleiner als 10-5 M ermöglichen den benötigten
on/off-Mechanismus und erlauben einen Waschschritt, ohne dass nennenswert Protein
verloren geht [40, Seite 87]. Aus verschiedenen Organismen wurden bereits Proteine
bzw. Enzyme aufgereinigt, die Thiamin binden können oder es als Cofaktor benötigen
[122, Seite 327-329]. Die in der Literatur beschriebenen Dissoziationskonstanten liegen
im Bereich von 1,1·10-6 M bis 2,8·10-8 M [123, Seite 662; 124, Seite 334; 125, Seite
683; 126, Seite 578; 127, Seite 5].
3.3.6.1 Aufschluss der rekombinanten E. coli-Bakterien Die E. coli-Bakterien, in denen die BFD exprimiert wurde, stammen aus der
Arbeitsgruppe von Prof. Liese (Institut für Technische Biokatalyse, Technische
Universität Hamburg-Harburg). Der Aufschluss der Bakterien erfolgt mittels Ultraschall
(Sonifier 450 von Branson, Dietzenbach, Deutschland). Hierzu werden ca. 10 g Zellen
im gefrorenen Zustand eingewogen und mit 15 mL Aufschlusspuffer (2 M K2HPO4,
2 mM MgCl2, pH 7,5) vermengt. Anschließend werden ca. 5 mL Aliquote unter Kühlung
mittels Ultraschall zweimal für 1 min bei maximaler Leistung (400 W) behandelt. Die
Aliquote werden vereinigt, anschließend die Zelltrümmer bei 5000 g und 4 °C
abzentrifugiert und der Überstand abgenommen. Dieser wird bis zur weiteren
Verwendung bei -80 °C gelagert.
3.3.6.2 BFD-Aktivitätstest und Proteinkonzentrationsbestimmung Die Aktivitätsbestimmung der BFD wird nach der durch Iding et al. beschriebenen
Methode durchgeführt [106, Seite 1492]. Der Test basiert auf der Decarboxylierung von
Benzoylformiat zu Benzaldehyd, wobei die Änderung der Extinktion durch Benz-
aldehydproduktion verfolgt wird. Qualitativ kann die Aktivität der Lösung auch durch
das Auftreten eines marzipanartigen Geruchs, der durch Benzaldhyd verursacht wird,
festgestellt werden.
Für den Test sind 50 µL der BFD-haltigen Lösung mit 950 µL Substratpuffer (0,15 M
KH2PO4, 2,5 mM MgSO4, 0,5 mM TPP, 10 mM Benzoylformiat, pH 7,4) zu mischen und
in eine Quarzküvette zu überführen. Direkt nach der Vermischung erfolgt die Messung
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 37 -
der Extinktion bei =340 nm für 100 s. Der Substratpuffer und die Küvette werden im
Vorfeld auf 30 °C temperiert. Die BFD-Aktivität berechnet sich nach folgender Formel.
BFDProbe
total
dV
VEA (5)
A Enzymaktivität [U/mL]
E Extinktionsänderung [min-1]
V Proben- und Gesamtvolumen [mL]
d Schichtdicke der Küvette [cm]
BFD molarer Extinktionskoeffizient von BFD [0,032 L·mmol-1·cm-1]
Ist die Proteinkonzentration bekannt, berechnet sich die volumenunabhängige BFD-
Aktivität wie folgt.
ProteinV C
UA (6)
AV volumenunabhängige Enzymaktivität [U/mg]
CProtein Proteinkonzentration [mg/mL]
Die volumenunabhängige BFD-Aktivität wird zur Beurteilung des Aufreinigungs-
prozesses benötigt.
Der Proteingehalt im Überstand wird photometrisch zum einen bei einer Wellenlänge
von 280 nm und zum anderen nach der Bradford-Methode bestimmt [128, Seite 248-
254]. Die Kalibrierung erfolgt bei beiden Methoden mit BSA im entsprechenden Puffer.
3.3.6.3 2D-Gelelektrophorese, Tryptischer Verdau und MALDI-MS Zur Beurteilung und Visualisierung der durchgeführten Affinitätsseparationen werden
2D-Gele angefertigt. Mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation Massen-
spektrometrie (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI-MS) nach einem
tryptischen Verdau kann BFD in den Gelen identifiziert werden. Die Durchführung
erfolgt nach einem in der Arbeitsgruppe vorhandenen Protokoll.
Die Proben für die 2D-Gelelektrophorese werden mittels Ultrafiltration entsalzt und
aufkonzentriert. Für die isoelektrische Fokussierung (Trennung von Proteinen nach
ihrem isoelektrischen Punkt) werden IPG-Streifen (11 cm) mit einem linearen pH-
Gradienten von 3-10 verwendet. Durch passive Rehydration über Nacht erfolgt die
Aufnahme der Proteine in die Streifen. Anschließend wird die Fokussierung bei
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 38 -
steigenden elektrischen Spannungen durchgeführt: 200 V für 30 min halten, 500 V für
30 min halten, 1000 V für 30 min halten, 1000 V bis 6000 V in 30 min, 6000 V halten
bis mindestens 15 kV·h erreicht sind.
Die Trennung nach dem Molekulargewicht der Proteine erfolgt mittels SDS-PAGE
(Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese). Dazu werden die Streifen
nach der isoelektrischen Fokussierung in zwei verschiedenen Puffern equilibriert (beide
Puffer: 0,37 M Tris-HCl, 6 M Harnstoff, 2 % (w/v) SDS, 30 % (v/v) Glycerol; Puffer 1
zusätzlich 20 mg/mL DTT (Dithiothreitol); Puffer 2 zusätzlich 25 mg/mL IAA (Iodessig-
säure)). Die Streifen können anschließend in die Aussparung des Acrylamidgels gelegt
werden. Die Trennung erfolgt bei 100 V pro Gel in SDS-Laufpuffer (25 mM Tris,
192 mM Glycin, 0,1 % SDS (w/v)). Die anschließende Färbung wird mittels Coomassie
Brilliant-Blue durchgeführt.
Die interessierenden Spots werden aus dem Gel geschnitten und mit 200 µL einer
0,2 M Ammoniumbicarbonat/Acetonitril-Lösung (6:4, v/v) solange entfärbt, bis kein
Coomassie-Blue-Farbstoff mehr sichtbar ist. Nach 30 min Trocknung der Gelstücke
unter vermindertem Druck (Vakuumzentrifuge Alpha RVC, Christ, Osterode am Harz,
Deutschland) erfolgt die Zugabe von 20 µL Trypsinlösung (20 µg/mL) und 50 µL einer
40 mM Ammoniumbicarbonat/Acetonitril-Lösung (93:7, v/v). Die Proben werden bei
37 °C über Nacht inkubiert.
Zur Probenvorbereitung für die MALDI-MS werden die tryptischen Proteinverdaue
erneut mittels Vakuumzentrifuge aufkonzentriert und mit je 10 µL einer Aceto-
nitril/Wasser-Mischung (1:1, v/v), die 0,1 % Trifluoressigsäure enthält, aufgenommen.
Die Matrix für die Peptide ist eine 1 µg/µL -Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Lösung in
Ethanol/Aceton (2:1, v/v). Proben und Matrix werden im Verhältnis 1:1 gemischt und
1 µL wird auf ein 800 µm Anchorchip Target (Bruker, Bremen, Deutschland) pipettiert.
Die Kristallisierung erfolgt bei Raumtemperatur. Anschließend erfolgt die Messung
mittels MALDI-MS. Die erhaltenen „Peptide Mass Fingerprints“ werden mittels
MASCOT-Suche identifiziert.
3.3.6.4 TPP-vermittelte Affinitätsseparation Für die TPP-vermittelte Affinitätsseparation wird der Überstand des E. coli-Auf-
schlusses mittels Ultrafiltration in Laufpuffer (vgl. Abschnitt 3.3.4) umgepuffert und
aufkonzentriert. Zur Durchführung der Versuche werden ca. 3,5 g ABA-Adsorbens in
eine 20x1 cm Glassäule gefüllt und unter den optimierten Bedingungen mit TPP
gesättigt (Tabelle 3, Nr. 5). Nach dem Entfernen des Überschusses von TPP werden
2 mL des umgepufferten E. coli-Aufschlusses auf die Säule gegeben. Der Fluss wird
auf 1,8 mL/min gesetzt, detektiert wird photometrisch bei =254 nm. Ein
exemplarisches Chromatogramm ist in Abb. 21 dargestellt, wobei angemerkt werden
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 39 -
muss, dass die Aufgabe der Aufschlusslösung nicht an die Kapazität der Säule
angepasst ist.
Abb. 21: Beispielchromatogramm für die ligandvermittelte Affinitätsseparation mit TPP nach Aufgabe von 2 mL E. coli-Aufschluss. Durchlauffraktion während des Adsorptions-schrittes (1), Desorptionsfraktion (2).
Die Durchlauffraktion wird verworfen. Anschließend erfolgt die Desorption von BFD
zusammen mit TPP durch pH-Wert-Absenkung von 8,5 auf 6,0 durch den Desorptions-
puffer. Sind die Dissoziationskonstanten zwischen TPP und verschiedenen TPP-
abhängigen Enzymen klein, sollte im Idealfall BFD an TPP mit hoher Affinität und
Selektivität binden. Qualitativ wird der Aufreinigungsprozess mittels 2D-Gelelektro-
phorese beurteilt (Abb. 22).
Gel 1 in Abb. 22 zeigt den Gesamtaufschluss, Gel 2 nach der TPP-vermittelten
Affinitätsseparation. Die BFD wird als Spot bei ca. 55 kDa in beiden Gelen sichtbar, der
mit MALDI-MS nach dem tryptischen Verdau eindeutig identifiziert werden kann
(Abb. 23). Augenscheinlich hat die Komplexität des aufgegebenen E. coli-Aufschlusses
in Gel 2 abgenommen. Es kann ein Aufreinigungseffekt nachgewiesen werden. Auf
dem 2D-Gel sind nach der Aufreinigung viele Spots verschwunden. Darunter auch
diejenigen hochkonzentrierten Proteine, die sich im Gel als stark ausgeprägte Spots
um den BFD-Spot manifestieren. Trotz Abnahme der Komplexität ist auch auf diese
Weise die unspezifische Adsorption nicht vollständig unterdrückbar.
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 40 -
Abb. 22: 2D-Gele des Zellaufschlusses (1) (8-16 % Tris-HCl Gel), der ABA-TPP-De-sorptionsfraktion (2) (8-16 % Tris-HCl Gel) und der TPP-Desorptionsfraktion (3) (10 % Tris-HCl Gel).
Der in die Breite gezogene BFD-Spot spricht für eine Überladung des IPG-Streifens.
Um den Aufreinigungseffekt zu beurteilen, wird sowohl die Proteinkonzentration und
BFD-Aktivität im Aufschluss als auch in der Desorptionsfraktion bestimmt. Der
aufgegebene E. coli-Aufschluss besitzt eine BFD-Aktivität von 72,3 U/mL und der
Proteingehalt nach Bradford konnte zu 7,3 mg/mL bestimmt werden. Die
volumenunabhängige BFD-Aktivität beträgt daher ca. 10 U/mg. Nach der TPP-
vermittelten Affinitätsseparation beträgt die volumenunabhängige BFD-Aktivität in den
Desorptionsfraktionen 6,4 U/mg (Abb. 22, Gel 2). Das bedeutet, dass die Aktivität
durch den Prozess gesenkt wird.
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 41 -
Abb. 23: Beispiel zur Identifizierung von BFD in 2D-Gelen. Die Gelspots werden aus-geschnitten, tryptisch verdaut und der peptide mass fingerprint gemessen. Auf der linken Seite ist das MS-Spektrum des peptide mass fingerprints von BFD zu sehen. Rechts die nachfolgende MASCOT-Suche zeigt eine erfolgreiche Identifizierung (75 % Sequenzhomologie) von BFD an. Übereinstimmende Peptide sind in roter Farbe dargestellt.
Wird das Experiment ohne TPP-Absättigung des ABA-Adsorbens durchgeführt, ist die
volumenunabhängige BFD-Aktivität in der Desorptionsfraktion ähnlich gering. Das von
diesen Desorptionsfraktionen angefertigte Gel (Abb. 61 im Anhang) sieht Gel 2 aus
Abb. 22 sehr ähnlich.
3.3.6.5 Affinitätstrennung mit direkt immobilisiertem TPP Die Affinitätsseparation mit kovalent immobilisiertem TPP wird diskontinuierlich im
Aufschlusspuffer (Abschnitt 3.3.6.1) durchgeführt, da zur Desorption TPP eingesetzt
wird. Aufgrund der Eigenabsorption von TPP bei =254 nm ist eine Detektion mit dem
verwendeten UV/Vis-Detektor nicht möglich.
Ca. 0,5 g TPP-Adsorbens werden mit 2 mL E. coli-Aufschluss versetzt und für 30 min
leicht geschüttelt. Anschließend wird das Adsorbens dreimal mit Aufschlusspuffer
gewaschen. Mit einer 0,2 M TPP-Lösung in Aufschlusspuffer erfolgt die Desorption der
BFD. Mittels Ultrafiltration wird der Überschuss an TPP entfernt und die Protein-
konzentration sowie die BFD-Aktivität bestimmt.
Dass die dargestellte Vorgehensweise mit immobilisiertem TPP möglich ist, zeigen
Studien von Muniyappa et al. und O’Brien et al. [125, Seite 681; 129, Seite 21]. In
diesen Studien wurden Affinitätsseparationen mit TPP-funktionalisierten Trägern durch-
geführt. Nach der Adsorption TPP-abhängiger Proteine konnten diese mit TPP
kompetitiv desorbiert werden.
Das 2D-Gel der Desorptionsfraktion ist auf der rechten Seite in Abb. 23 (Gel 3)
dargestellt. Es zeigt sich, dass deutlich weniger Spots zu sehen sind als in der
Desorptionsfraktion, die durch die TPP-vermittelte Affinitätsseparation gewonnen
worden ist. Weiterhin ist die volumenunabhängige BFD-Aktivität der Desorptions-
fraktion auf 41 U/mg von ausgehend 10 U/mg deutlich gestiegen. Das entspricht einem
Aufreinigungsfaktor von 4 [130, Seite 33].
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 42 -
3.4 Rückschlüsse Ein durch TPP vermitteltes Affinitätsseparationsverfahren scheitert vermutlich an der
zu geringen Menge TPP, die an ABA immobilisiert werden kann. An nur 1 % aller ABA-
Gruppen kann unter den optimierten Bedingungen TPP gebunden werden. Im
Umkehrschluss sind damit zu viele ABA-Liganden frei auf der Oberfläche des Trägers
zugänglich und können zur Ausbildung unspezifischer Wechselwirkungen mit dem
Zielmolekül führen. Insbesondere der Phenylring und die negative Ladung des
Boratoms der ABA-Liganden verursachen hydrophobe und ionogene Wechsel-
wirkungen [63, Seite 74]. In Abb. 24 sind die polaren und hydrophoben Bereiche der
ABA-Liganden dargestellt.
Abb. 24: Darstellung von polaren Regionen (rot) und unpolaren Regionen (grau) im ABA-Molekül
Experimentell lässt sich die Natur der unspezifischen Wechselwirkungen durch
Separationsversuche ohne TPP-Absättigung unter schwach sauren Bedingungen
abschätzen. Dazu wird der in Abschnitt 3.3.4 beschriebene Laufpuffer verwendet,
jedoch bei einem pH-Wert von 6,9. Unter diesen Bedingungen sollte die Mehrzahl der
ABA-Liganden im trigonalen Zustand vorliegen, so dass die Boratome keine negativen
Ladungen tragen. Von den ABA-Liganden können daher keine ionogenen Wechsel-
wirkungen ausgehen und hydrophobe Effekte sollten zum Tragen kommen. Ein 2D-Gel
einer Desorptionsfraktion dieser Versuche ist in Abb. 62 im Anhang zu finden. In dem
Gel der Desorptionsfraktion befinden sich nur wenige Proteine, die als Spots
detektierbar sind. Hieraus lässt sich folgern, dass die hohen unspezifischen Wechsel-
wirkungen in erster Linie ionogener Natur sind. Ionogene Wechselwirkungen können
durch eine hohe Ionenstärke unterdrückt werden [131, Seite 74]. Eine NaCl-
Boronsäureliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 43 -
Konzentration von 0,15 mM im Laufpuffer ist hierfür ausreichend. Jedoch werden durch
zu hohe Salzkonzentrationen wiederum hydrophobe Effekte verstärkt [63, Seite 74].
Allerdings sind auch hydrophobe Effekte vom pH-Wert abhängig. Beispielsweise
beobachteten Xia et al. eine höhere Kapazität von Phenyl-Sepharose zu Lysozym aus
Hühnereiern, wenn der pH-Wert von 6 auf 7,5 erhöht wird [132, Seite 231].
Singhal et al. erwähnen jedoch, dass die hydrophobe Natur von Phenylboronsäuren
wahrscheinlich das Haupthindernis für ihre Anwendung bei der Trennung von
Biomakromolekülen sei [69, Seite 307].
Dagegen ist die Affinitätsseparation mit direkt immobilisiertem TPP eine Alternative. Mit
diesem Verfahren konnte BFD aus einem E. coli-Zellaufschluss aufgereinigt werden,
wobei sich ein Aufreinigungsfaktor von 4 ergab.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 44 -
4 Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung
4.1 Synthetische Liganden für Glycoproteine - Stand der Wissenschaft
Im Folgenden soll ein kurzer Überblick über aktuelle Entwicklungen synthetischer
Liganden für Kohlenhydrate gegeben werden. Neben dem Einsatz in der
Affinitätsseparation ist das Ziel vieler Arbeitsgruppen, synthetische Kohlenhydrat-
liganden als Therapeutika und Diagnosewerkzeuge für die Erkennung und Behandlung
von Krankheiten einzusetzen, deren Ursache die kohlenhydratvermittelte Zell-Zell-
Erkennung ist (vgl. Abschnitt 2.1) [133, Seite 3178].
Synthetische Liganden für Kohlenhydrate fallen in das Fachgebiet der supra-
molekularen Chemie. Die Mechanismen der Wechselwirkung und die auftretenden
Bindungskräfte entsprechen denen, die in Abschnitt 2.4 dargelegt sind.
Voraussetzung für die biomimetische Kohlenhydraterkennung und -bindung durch
synthetische Liganden ist erstens eine hinreichende Größe der Liganden, die es
ermöglicht Kohlenhydrate vollständig zu umschließen. Zweitens müssen polare und
unpolare funktionelle Gruppen synthetischer Liganden so positioniert sein, dass sie
kongruent zu polaren und unpolaren Molekülregionen von Kohlenhydraten sind.
Drittens müssen die Liganden eine hinreichende Rigidität aufweisen. Das hat einerseits
entropische Gründe (vgl. Abschnitt 2.4.2), verhindert aber auch mögliche
intramolekulare Wechselwirkungen eines Liganden oder Selbstorganisation mehrerer
Liganden [133, Seite 3178-3180].
Aufgrund der komplexen Stereochemie von Kohlenhydraten müssen synthetische
Liganden hinsichtlich der Selektivität hohen Anforderungen genügen [134, Seite 3629].
Bei vielen in jüngerer Zeit beschriebenen Liganden werden zur Bindung meist
Wasserstoffbrücken ausgenutzt. Hierbei handelt es sich einerseits um Wasserstoff-
brücken zwischen Protonendonatoren und -akzeptoren, andererseits um CH- -
Wasserstoffbrücken aromatischer Molekülteile der Liganden und den CH-Protonen der
Kohlenhydrate [135, Seite 1750-1751]. Vielfach werden die Untersuchungen zur
Wechselwirkung zwischen synthetischen Liganden und Kohlenhydraten in nicht
kompetitiven Lösungsmitteln, etwa Chloroform, DMSO oder Dimethylformamid (DMF),
durchgeführt. Hierbei bilden sich oft starke Ligand-Kohlenhydrat-Komplexe aus.
Arbeitet man in wässrigen Systemen, ist ein erheblicher Abfall der Bindungsstärke zu
beobachten [133, Seite 3178]. Mazik et al. beispielsweise synthetisierten einen
acyclischen Liganden, der in Chloroform zu Glucose eine Dissoziationskonstante (1:1-
Bindung) von 8,3·10-6 M besitzt. In Wasser steigt die Konstante auf 5,0·10-1 M. Für das
Disaccharid D-Cellobiose in Wasser liegt der Wert bei 2,9·10-3 M [136, Seite 2961]. Es
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 45 -
gibt daher nur wenige Beispiele synthetischer Liganden, die auch in Wasser
Kohlenhydrate mit adäquaten Affinitäten binden können und zudem selektiv sind [133,
Seite 3180].
Macrocyclische Kohlenhydratliganden besitzen eine größere Rigidität. Dadurch ist der
Entropieverlust infolge der Kohlenhydratbindung niedriger und die Stärke der Bindung
größer [59, Seite 22-23]. Beispielsweise synthetisierten Ferrand et al. einen macro-
cyclischen Liganden, der D-Cellobiose mit einer Dissoziationskonstante von 1,6·10-3 M
in Wasser binden konnte. D-Lactose, ein Epimer der Cellobiose, besitzt dagegen eine
um zwei Zehnerpotenzen geringere Assoziationskonstante [137, Seite 621]. Der
Ligand hat einen „tempelartigen“ Aufbau und bietet eine Kavität für D-Cellobiose
begrenzt von polaren und unpolaren meist aromatischen Molekülregionen (Abb. 25A).
In Abb. 25B ist die komplexe Struktur des Liganden dargestellt.
Abb. 25: Schematischer Aufbau (A) und Struktur (B) des durch Ferrand et al. synthe-tisierten macrocyclischen Liganden. Beide Abbildungen sind aus [133, Seite 3185] entnommen.
Ein weiterer macrocyclischer Ligand aus der Davis-Arbeitsgruppe bindet an ein
Decapeptid, das einen Ausschnitt aus Casein Kinase II darstellt. N-Acetylglucosamin
ist o-glycosidisch an einen Serinrest des Peptids gebunden. Das Peptid konnte in
Wasser mit einer Dissoziationskonstante von 9,6·10-4 M gebunden werden. War das
Peptid nicht glycosyliert, fand keine Bindung statt [138, Seite 1778]. Für weitere
Beispiele biomimetischer Kohlenhydraterkennung durch synthetische Liganden in
Wasser sei auf aktuelle Reviews verwiesen [133, Seite 3180-3188; 139, Seite 951-955].
Jedoch sind die Dissoziationskonstanten zu groß, als dass dadurch der benötigte
on/off-Mechanismus erreicht wird. Von Lektinen ist allerdings auch bekannt, dass sie
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 46 -
zu Monosacchariden ebenfalls nur eine geringe Affinität mit Dissoziationskonstanten im
millimolaren Bereich besitzen [11, Seite 1594].
Bei vielen synthetischen Liganden für Kohlenhydrate wirkt sich die aufwendige
Synthese, die damit geringen Syntheseausbeuten und hohen Kosten nachteilig auf
ihren Einsatz in der Affinitätsseparation aus. Beispielsweise sind für den Liganden in
Abb. 25B acht Syntheseschritte notwendig.
4.2 Vorstellung der verwendeten Triazinliganden Die Arbeitsgruppe um Lowe entwickelte und synthetisierte acyclische Liganden auf
Triazinbasis, die ebenfalls in der Lage sind, in wässrigen Systemen mit
Kohlenhydratstrukturen zu interagieren [140, Seite 223; 141, Seite 59; 142, Seite 270;
143, Seite 96]. Diese Liganden wurden bereits in der Affinitätsseparation zur
Aufreinigung von Glycoproteinen aus synthetischen Mischungen eingesetzt. Die hier
verwendeten Liganden sind in Abb. 26 dargestellt und werden nachfolgend als TBL1
und TBL2 bezeichnet. Als NH2-TBL1 und NH2-TBL2 bezeichnete Liganden sind im
unteren Teil der Abbildung dargestellt. Die aminofunktionalisierten Derivate der
Liganden wurden synthetisiert, um sie Surface Plasmon Resonance Messungen
zugänglich zu machen. TBL1 und TBL2 werden dagegen auf Silica immobilisiert.
Abb. 26: Darstellung der in dieser Arbeit verwendeten Triazinliganden. Im unteren Teil der Abbildung ist der Triazinkern orange hinterlegt. Die Substituenten des Triazinkerns sind in roter Farbe hervorgehoben. Im Fall von NH2-TBL1 ist der Substituent Benzylamin und für NH2-TBL2 ist es 5-Aminoindan (vgl. Abschnitt 4.4). Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Immobilisierung an das Trägermaterial erfolgt.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 47 -
In den Publikationen wurden Triazinliganden bisher nur zur Affinitätsseparation
definierter Glycoproteingemische eingesetzt. Assoziationskonstanten zu GOD wurden
ebenfalls bestimmt. Immobilisiert an Sepharose ergibt sich für TBL1 ein Wert von
2,1·10-5 M. Die Dissoziationskonstante für TBL2 beträgt 2,3·10-6 M. Damit wären die
Bedingungen für den benötigten on/off-Mechanismus erfüllt [40, Seite 87]. Jedoch ist
angesichts der Strukturformeln fraglich, durch welche enthalpischen oder entropischen
Effekte diese niedrigen Bindungskonstanten zustande kommen sollen. Hinsichtlich der
Selektivität zu verschiedenen Monosacchariden konnte eine Präferenz für Mannose
festgestellt werden [140, Seite 233; 142, Seite 280].
Gegenüber anderen synthetischen Liganden für Kohlenhydrate, wie beispielsweise der
in Abb. 25B dargestellte Ligand, zeichnen sich die Triazinliganden durch eine einfache,
maximal dreistufige Synthese und kostengünstige Edukte aus. Die Liganden können
daher in größerer Menge bereitgestellt werden. Daraus resultierend kann die
Herstellung von Adsorbentien mit synthetischen Liganden kostengünstiger erfolgen.
4.3 Triazinliganden in der Affinitätsseparation Der Vorteil von Affinitätsliganden auf Triazinbasis gegenüber natürlichen Liganden, die
zum ausgewählten Wertstoff ähnliche Selektivitäten und Affinitäten haben, ist ihre hohe
chemische und mikrobiologische Stabilität. Das bedeutet, es können Desorptions-
bedingungen bzw. Cleaning-in-place- sowie Sterilisation-in-place-Methoden ange-
wendet werden, bei denen biologische Liganden ihre Funktion verlieren würden.
Zudem sind sie günstiger herzustellen, wodurch ein Upscaling effizienter wird. [144,
Seite 254; 145, Seite 307; 146, Seite 573]. Über Vor- und Nachteile von Triazin-
liganden gegenüber natürlichen Liganden kann sich im Review von Vijayalakshmi
informiert werden [41, Seite 72]. Im nachfolgenden Abschnitt wird ein kurzer Überblick
über Triazinliganden, die in der Affinitätsseparation verwendet werden, gegeben.
Reaktive Triazinfarbstoffe sind in der Lage, selektiv mit Proteinen und Enzymen zu
interagieren [147, Seite 302]. Diese Farbstoffe sind ursprünglich verwendet worden,
um Textilien zu färben [148, Seite 95]. Den Prototypen dieser Klasse von
gruppenselektiven Affinitätsliganden stellt Cibacron Blue F3GA (Abb. 27A) dar. In
frühen Studien sind mit immobilisiertem Cibacron Blue F3GA Enzyme wie
Phosphofructokinase, Glutathionreduktase und Pyruvatkinase aufgereinigt worden [149,
Seite 393]. Cibacron Blue F3GA imitiert anionische, heterocyclische Substrate wie
Nucleinsäuren, Nucleotide und Coenzyme und passt in die Bindungstasche
entsprechender Enzyme [146, Seite 563].
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 48 -
Abb. 27: Strukturformel von Cibacron Blue F3GA (A); optimierte Struktur von Cibacron Blue F3GA als Ligand für alkalische Phosphatase (B) und Pferdeleber-Alkohol-dehydrogenase (C). Rot hinterlegt sind bei (B) und (C) die strukturellen Änderungen gegenüber Cibacron Blue F3GA. Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Immobilisierung erfolgt.
Neben Cibacron Blue F3GA finden weitere Triazinfarbstoffe wie Procion Blue MX-R
oder Procion Red HE3B Verwendung für Proteinabtrennungen [150, Seite 151; 151,
Seite 195]. Cibacron Blue F3GA stellt also nur einen Vertreter der Triazinfarbstoffe dar,
von denen die meisten mit bestimmten Enzymen interagieren können [152, Seite 51].
Die Fähigkeit von Triazinfarbstoffen, bestimmte Substrate oder Cofaktoren von
Enzymen zu imitieren, ist eine zufällig gefundene Eigenschaft [153, Seite 118]. Um
höhere Affinitäten zu erzielen, wurden einige Triazinfarbstoffe strukturell optimiert. Das
Ziel ist, die Moleküle hinsichtlich ihrer sterischen und polaren Eigenschaften für die
Bindungstasche der Enzyme besser zugänglich zu machen. Hierfür wurden
wissensbasierte Ansätze durchgeführt, bei denen Strukturdaten, insbesondere NMR-
und röntgenkristallographische Daten, von Enzym-Cofaktor-Komplexen ausgewertet
wurden. Man spricht von der ersten Generation biomimetischer Farbstoffe [154, Seite
34]. Cibacron Blue F3GA ist zum Beispiel durch Austausch eines Sulfonat-Restes
durch einen Methylenphosphonat-Rest verändert worden (Abb. 27B). Durch diesen
Liganden wurde alkalische Phosphatase aus der Darmschleimhaut von Kälbern
aufgereinigt. Dabei konnte ein Aufreinigungsfaktor von 330 erzielt werden [155, Seite
237]. Demgegenüber erreicht unverändertes Cibacron Blue F3GA einen
Aufreinigungsfaktor von 20 [156, Seite 108]. In Abb. 27C ist ein veränderter Cibacron
Blue F3GA-Ligand dargestellt, der immobilisiert an Agarose, effektiv Pferdeleber-
Alkoholdehydrogenase aus Rohextrakten binden kann [153, Seite 118]. Hier wurde ein
kurzer Spacer eingebaut und die Sulfonat- durch eine Carboxygruppe ersetzt.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 49 -
Zur Entwicklung der zweiten Generation biomimetischer Triazinliganden werden
Methoden aus der kombinatorischen Chemie und Molecular Modeling eingesetzt [144,
Seite 248-253; 154, Seite 37]. Dabei werden Liganden entwickelt, deren Einsatz-
spektrum über die Aufreinigung von Enzymen hinausgeht. Beispielsweise sind die in
Abschnitt 4.1 vorgestellten glycoselektiven Triazinliganden solche Neuentwicklungen.
Andere Beispiele stammen insbesondere aus den Arbeitsgruppen von Lowe und
Clonis/Labrou. Als Ersatz für die Liganden Protein A und Protein L wurden
synthetische Triazinliganden entwickelt, die jedoch großtechnisch noch nicht zum
Einsatz kommen. In der Biotechnologie werden weiterhin Protein A und Protein L zur
Aufreinigung von Immunglobulinen verwendet. Der synthetische Ligand für humanes
Immunglobulin G (IgG) hat eine Assoziationskonstante von 1,4·105 M-1 zu humanem
IgG. Angewendet auf humanes Blutplasma reinigt er IgG mit Reinheiten von 98-99 %
in einem Schritt auf [157, Seite 73; 158, Seite 12]. Jedoch werden gleiche Reinheiten
auch mit Protein A erzielt, dessen Assoziationskonstanten zu humanem IgG im Bereich
von 4,0·107-2,0·108 M-1 liegen [159, Seite 75]. Ein weiteres Beispiel ist ein Ligand für
den monoklonalen anti-HIV Antikörper 4E10. Die Assoziationskonstante des
Antikörper-Ligand-Komplexes beträgt 2,4·106 M. Angewendet auf polyphenolfreie
Rohextrakte aus Blättern von transgenen Tabakpflanzen, in denen der Ligand
exprimiert wurde, konnte der Antikörper mit 95 % Reinheit gewonnen werden [160,
Seite 423]. Beide Beispiele sind in Abb. 28 dargestellt.
Abb. 28: Strukturformeln der triazinbasierten Liganden für humanes IgG (A) und für den monoklonalen anti-HIV Antikörper 4E10 (B). Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Anbindung an das Trägermaterial erfolgt.
Weitere Beispiele und eine detaillierte Beschreibung der Vorgehensweise bei der
Generierung synthetischer Liganden mit Fokus auf triazinbasierte Liganden können
dem Review von Clonis entnommen werden [161, Seite 9-17].
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 50 -
4.4 Synthese der Triazinliganden Triazine sind sechsgliedrige aromatische Heterocyclen. Man spricht von 1,3,5-
Triazinen oder s-Triazinen (s = symetrisch), wenn das Molekül aus drei alternierend
angeordneten Stickstoff- und drei Kohlenstoffatomen besteht [162, Seite 9507].
Ein Derivat des 1,3,5-Triazins ist das 2,4,6-Trichloro-1,3,5-triazin. Die Chloratome
lassen sich durch nucleophile Verbindungen im Rahmen einer nucleophilen
aromatischen Substitutionsreaktion austauschen [163, Seite 1090-1091]. Auffallend ist,
dass die Substitution der Chloratome stufenweise durch Temperatursteuerung erfolgen
kann [162, Seite 9508; 164, Seite 252]. In Abb. 29 ist das allgemeine Reaktionsschema
dargestellt.
Abb. 29: Temperaturgesteuerte, nucleophile Substitution der Chloratome durch Amino-gruppen.
Die stufenweise Substituierbarkeit der Chloratome im 2,4,6-Trichloro-1,3,5-triazin
beruht auf zwei Effekten. Erstens: Bei einer nucleophilen aromatischen Substitution
läuft die Reaktion über so genannte Meisenheimer-Komplex-analoge Zwischenstufen
ab [164, Seite 250-251]. Werden nun die Chloratome schrittweise substituiert, nimmt
die Stabilität der Zwischenstufe ab. Das heißt, die stabilste Zwischenstufe liegt bei der
Substitution des ersten Chloratoms vor, aufgrund der -I-Effekte der zwei verbleibenden
Cl-Atome. Zweitens: Der nach der Reaktion vorliegende NH-R-Substituent ist nicht wie
die Cl-Atome in der Lage, die Meisenheimer-Komplex-analoge Zwischenstufe zu
stabilisieren [164, Seite 252; 165, Seite 517].
4.4.1 Synthese von TBL1 und TBL2 Die Synthese der Affinitätsliganden TBL1 und TBL2 (Abb. 26 oben) erfolgt in An-
lehnung an das von Gupta et al. und Palanisamy et al. entwickelte Protokoll [140, Seite
220; 142, Seite 267].
Von 1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin (TBL1: 0,68 g, 3,6 mmol; TBL2: 0,50 g, 2,7 mmol) wird
eine Lösung in Aceton (TBL1: 14 mL; TBL2: 5 mL) hergestellt und mittels Eisbad auf
0 °C heruntergekühlt. Anschließend wird der Substituent tropfenweise zur Triazin-
lösung gegeben (Benzylamin für TBL1: 0,80 mL, 7,3 mmol und 5-Aminindan für TBL2:
0,73 g, 5,5 mmol in je 10 mL Aceton/Wasser (1:1, v/v) sowie ein equimolarer Gehalt an
Natriumhydrogencarbonat). Nach 10 min wird das Eisbad entfernt und die Lösung über
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 51 -
Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt. Mittels Dünnschichtchromatographie (DC)
wird überprüft, ob das gesamte 1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin abreagiert ist (Kieselgel 60
F254 DC-Platten (Merck, Darmstadt, Deutschland), Laufmittel Hexan:Ethylacetat (6:1,
v/v), =254 nm). Zu den Lösungen wird je 50 mL deionisiertes Wasser gegeben und
die Präzipitate über eine Glasfritte (Porengröße 2) unter reduziertem Druck abgesaugt,
mit reichlich Wasser gewaschen und bei 60 °C und 50 mbar im Vakuumtrockenschrank
für 6 h getrocknet. Die Reinheit und Authentizität der bisubstituierten Triazinliganden
N,N'-Dibenzyl-6-chloro-1,3,5-triazin-2,4-diamin (TBL1) und 6-Chloro-N,N’-(di-2,3-di-
hydroinden-5-yl)-1,3,5-triazin-2,4-diamin (TBL2) wird mittels DC (Laufmittel
Hexan:Ethylacetat (6:1, v/v), =254 nm), NMR (Nuclear Magnetic Resonance) und
ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) bestimmt.
Die Ausbeute beträgt für beide Verbindungen, bezogen auf die eingesetzte Menge an
1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin, ca. 90 %. Der Rf-Wert von TBL1 ist mit 0,70 und von TBL2
0,38 bestimmt worden. Die chemischen Verschiebungen des 1H-NMR-Spektrums in
DMSO-D6 von TBL1 können wie folgt zugeordnet werden. 4,59 ppm (s, 4H CH2
Benzylamin), 7,28 ppm (breites s, 10H, CH aromatisch). Das ESI-MS-Spektrum für
TBL1 zeigt einen Hauptpeak bei 326,1 amu [M+H]+ (berechnet 326,1 amu). Für TBL2
zeigt sich folgendes Bild. 1H-NMR in CDCl3: 2,09 ppm (quint, 4H, CH2 aliphatisch),
2,89 ppm (t, 8H, CH2 aliphatisch), 7,16 ppm (d, 2H, CH aromatisch), 7,24 ppm (d, 2H,
CH aromatisch) und 7,40 ppm (s, 2H, CH aromatisch). Das ESI-MS-Spektrum zeigt
den zu erwartenden Molekülpeak bei 378,2 [M+H]+ (berechnet 378,1). Zusätzlich zu
den 1H-NMR- und ESI-MS-Spektren befinden sich 13C-NMR-Spektren im Anhang
(Abb. 63: ESI-MS TBL1, Abb. 67: 1H-NMR TBL1, Abb. 71 13C-NMR TBL1; Abb. 64:
ESI-MS TBL2, Abb. 68: 1H-NMR TBL2, Abb. 72: 13C-NMR TBL2).
4.4.2 Synthese von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 Um die Liganden für SPR-Messungen zugänglich zu machen und sie auf Adsorbens-
bzw. Sensoroberflächen zu immobilisieren, ist die Einführung einer primären Amino-
gruppe notwendig. Eine direkte Substitution des verbliebenen Chloratoms mit
Ammoniak ist schwierig und erfordert harsche Reaktionsbedingungen [166, Seite 2005].
Die Alternative ist die Substitution mit Ethylendiamin, wobei Ethylendiamin auch als
kurzer Spacer fungiert. Dieser Umstand sollte sich insbesondere auf den
Immobilisierungsprozess positiv auswirken, da die primäre Aminogruppe nicht direkt
am Liganden sitzt und sterisch besser zugänglich ist. Durch den Einsatz eines großen
Überschusses an Ethylendiamin im Reaktionsansatz wird die Substitution beider
Aminogruppen von Ethylendiamin durch die Liganden verhindert.
Die Durchführung der Synthese erfolgt in Anlehnung an Li et al. [167, Seite 194]. Dazu
werden TBL1 (0,70 g, 2,1 mmol) oder TBL2 (0,6 g, 1,6 mmol) in je 75 mL Toluol
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 52 -
suspendiert. Zu den Suspensionen, die auf 100 °C temperiert werden, wird ein
Überschuss an Ethylendiamin unter starkem Rühren pipettiert (NH2-TBL1: 2,2 mL,
33 mmol; NH2-TBL2: 1,6 mL, 24 mmol). Die Reaktionsansätze werden über Nacht
weiter bei 100 °C gerührt und anschließend mittels DC (Laufmittel Hexan:Ethylacetat
(6:1, v/v), =254 nm) auf das Vorhandensein von TBL1 und TBL2 überprüft. Das Toluol
wird unter Vakuum am Rotationsverdampfer bei 40 °C entfernt und die Rückstände in
Methanol:5 M HCl (95:5, v/v) aufgenommen. Diese Suspensionen werden erneut bis
zur Trockene eingeengt und anschließend wird aus demselben Lösungsmittelgemisch
umkristallisiert. Die Reaktionsprodukte, N2-(2-Aminoethyl)-N4,N6-dibenzyl-1,3,5-triazin-
2,4,6-triamin (NH2-TBL1) und N2-(2-Aminoethyl)-N4,N6-(di-2,3-dihydroinden-5-yl)-1,3,5-
triazin-2,4,6-triamin (NH2-TBL2) werden bei 60 °C und 50 mbar getrocknet (Abb. 26
oben). Durch die Umkristallisation aus einem Methanol-Salzsäuregemisch werden die
Liganden als Hydrochloride isoliert. Die Reinheit und Authentizität wird mittels DC (2-
fache Entwicklung der DC-Platte, Laufmittel: 1. Hexan:Ethylacetat (6:1, v/v), =254 nm;
2. Methanol:Chloroform:Essigsäure (8:4:0,5 v/v/v), 254 nm und Ninhydrin als Sprüh-
reagenz) sowie NMR und ESI-MS überprüft.
Die Ausbeute für NH2-TBL1 liegt bei ca. 55 %, die für NH2-TBL2 bei ca. 67 % bezogen
auf TBL1 und TBL2. Der Rf-Wert von NH2-TBL1 ist 0,38, der für NH2-TBL2 beträgt 0,40.
Im Dünnschichtchromatogramm konnte kein Ethylendiamin mehr nachgewiesen
werden. Die chemischen Verschiebungen des 1H-NMR-Spektrums in DMSO-D6 von
NH2-TBL1 können wie folgt zugeordnet werden. 2,98 ppm (d, 2H, CH2 Ethylendiamin),
3,60 ppm (breites s, 2H, CH2 Ethylendiamin), 4,53 ppm (s, 4H CH2 Benzylamin) und
7,19-7,45 ppm (m, 10H, CH aromatisch). Im ESI-MS-Spektrum für NH2-TBL1 zeigt sich
ein Hauptpeak bei 350,3 amu [M+H]+ (berechnet 350,2 amu). Im Gegensatz dazu
werden die chemischen Verschiebungen des 1H-NMR-Spektrums in DMSO-D6 von
NH2-TBL2 wie folgt zugeordnet. 2,02 ppm (quint, 4H, CH2), 2,84 ppm (breites s, 8H,
CH2), 3,11 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin), 3,67 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin),
7,20 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch), 7,38 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch) und
7,49 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch). ESI-MS für NH2-TBL2 zeigt einen Hauptpeak
bei 402,4 amu [M+H]+ (berechnet 402,2 amu). Neben den 1H-NMR- und ESI-MS-
Spektren befinden sich 13C-NMR-Spektren im Anhang (Abb. 65: ESI-MS NH2-TBL1,
Abb. 69: 1H-NMR NH2-TBL1, Abb. 73: 13C-NMR NH2-TBL1; Abb. 66: ESI-MS NH2-
TBL2, Abb. 70: 1H-NMR NH2-TBL2, Abb. 74: 13C-NMR NH2-TBL2).
4.5 Grundlagen der Surface Plasmon Resonance und Funktionsweise des Biacore 3000
Um die Interaktionen der synthetischen Liganden mit verschiedenen Glycoproteinen zu
untersuchen und optimierte Trennbedingungen zu finden, werden Surface Plasmon
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 53 -
Resonance Messungen (SPR, dt. Oberflächenplasmonresonanz) durchgeführt. Diese
Methode erlaubt es, biomolekulare Wechselwirkungen zwischen einem auf einer
Sensoroberfläche immobilisierten und einem frei in Lösung befindlichen Bindungs-
partner in Echtzeit zu untersuchen. Es handelt sich bei der SPR um eine Biosensor-
technologie, die kein Labeling des immobilisierten Bindungspartners benötigt. Obwohl
das Auftreten von Oberflächenplasmonen von Wood 1912 bereits beschrieben werden
konnte und später zur Charakterisierung dünner Schichten diente, konstruierten erst
1983 Nylander und Liedberg Biosensoren auf Grundlage dieses Effektes [168, Seite
35].
Im Folgenden soll das Messprinzip näher beleuchtet werden. In einem Metall können
sich Leitungselektronen wie die Teilchen in einem Gas oder einer Flüssigkeit frei
bewegen, wobei die Elektronen in ihrer Gesamtheit als Plasma bezeichnet werden. Als
Plasmaschwingung wird die kollektive, longitudinale Anregung des Leitungselektronen-
gases gegen die Atomrümpfe bezeichnet, wobei ein Plasmon ein Quant dieser
Plasmaschwingung ist. Plasmone lassen sich in Volumen- und Oberflächenplasmone
unterscheiden. Bei Volumenplasmonen handelt es sich ausschließlich um longitudinale
Plasmaschwingungen, während Oberflächenplasmone auch einen transversalen
Schwingungsanteil besitzen [169, Seite 299-301; 170, Seite 826]. Die Anregung von
Plasmonen in einer dünnen Metallschicht kann durch Elektronen, die durch die Metall-
schicht transmittieren, erfolgen. Weiterhin kann die Anregung auch durch Photonen
oder Elektronen eintreten, die von der Metallschicht reflektiert werden [169, Seite 299-
301].
Die Anregung der Oberflächenplasmonwellen durch Photonen ist nur an Grenzflächen
zwischen einer dünnen Metallschicht und einem Dielektrikum (die zu vermessende
Lösung) möglich, bei der es zu einer Resonanzkopplung von Leitungselektronen und
Licht kommen muss. Jedoch kann zur Anregung der Oberflächenplasmonwellen die
Metalloberfläche nicht einfach mit Licht bestrahlt werden [168, Seite 36; 171, Seite 214].
Die Anregung kann durch einen von Kretschmann entwickelten Prismenkoppler
erreicht werden, wobei das Prisma direkt auf der dünnen Metallschicht aufliegt [172,
Seite 2135-2136]. Nach diesem Prinzip arbeitet auch das verwendete Biacore 3000
(GE Healthcare, Uppsala, Schweden). Hierbei wird der Effekt der abgeschwächten
Totalreflektion (attenuated total reflection, ATR) ausgenutzt. An der Grenzfläche
zwischen Prisma und Metallschicht wird das Licht totalreflektiert. Dabei bildet sich an
der Grenzfläche eine evaneszente, elektromagnetische Welle aus, welche in die
Metallschicht penetriert. Unter Resonanzbedingungen entstehen an der Grenzfläche
zum Dielektrikum Oberflächenplasmone. Die Resonanzbedingung ist bei einem
bestimmten Resonanzwinkel des eingestrahlten Lichtes erfüllt. Dies ist dann der Fall,
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 54 -
wenn Energie und Richtung der Komponente des Lichtvektors, die parallel zur Metall-
schicht verläuft, mit der Anregungsenergie und Richtung des Verlaufs der Oberflächen-
plasmonenwelle übereinstimmt. In diesem Fall wird Energie übertragen und ein
Minimum an Lichtenergie reflektiert und detektiert. Grafisch dargestellt ist die
Resonanzbedingung in Abb. 30B.
Abb. 30: Vereinfachte Darstellung der Resonanzbedingung. Keine Resonanz findet statt, wenn die Komponente des Lichtvektors, die parallel zur Metallschicht verläuft, hin-sichtlich Energie und Richtung mit der Anregungsenergie und Richtung des Verlaufs der Oberflächenplasmonenwelle übereinstimmt (A). Dagegen ist in (B) die Resonanz-bedingung erfüllt. Die Oberflächenplasmonenwelle erzeugt ein elektromagnetisches Feld, das einige
100 nm in das umgebende Medium hineinreicht. Die Resonanzbedingungen und damit
der Wert des Resonanzwinkels hängen direkt vom Brechungsindex des Dielektrikums
ab [171, Seite 219]. Adsorptions- und Desorptionsprozesse an der Sensoroberfläche
führen zur lokalen Änderung des Brechungsindexes und somit zur Verschiebung des
Resonanzwinkels [168, Seite 38]. Dabei entspricht eine Resonanzwinkeländerung von
0,1° einer Änderung der Oberflächenbeladung von ca. 1 ng/mm2 [173, Seite 26-27]
Diese Korrelation ist bis zu einer Oberflächenbeladung von 50 ng/mm2 linear [174,
Seite 523]. Beim verwendeten Biacore 3000 (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) wird
die Winkeländerung in Resonanzeinheiten (Resonance Units, RU) ausgedrückt, wobei
eine Winkeländerung von 0,1° 1000 RU entspricht.
Der Aufbau eines SPR-Gerätes mit Prismenkoppler ist in Abb. 31A erläutert. Nach
diesem Aufbau arbeitet auch das Biacore 3000. Hierbei wird nahinfrarotes Licht einer
LED keilförmig auf die Sensoroberfläche geleitet. Das Licht trifft dadurch in einem breit
gefächerten Winkelbereich auf die Oberfläche. Das reflektierte Licht wird durch ein
Anordnung lichtsensitiver Dioden erfasst, die Winkeländerungen von 10-5° auflösen
können [175, Seite 22]. Als Metallschicht wird Gold verwendet, welches auf einem
Glasträger dünn aufgebracht und dem Biacore 3000 in Form austauschbarer
Sensorchips zugeführt wird. Auf der Goldoberfläche, die in Kontakt mit der zu
untersuchenden Lösung steht, werden die Liganden immobilisiert. Ändert sich der
Brechungsindex der Lösung, ändert sich der Resonanzwinkel (Abb. 31B). Als
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 55 -
Resonanzsignal gegen die Zeit aufgetragen, ergibt sich dann das sogenannte
Sensorgramm (Abb. 31C).
Abb. 31: Schematischer Aufbau eines SPR-Biosensors mit Prismenkoppler (A). Ändert sich der Brechungsindex der Lösung im Fließkanal, ändert sich der Resonanzwinkel (B), Wird die Änderung des Resonanzwinkels, ausgedrückt in Resonanzeinheiten, in Abhän-gigkeit von der Zeit graphisch dargestellt, erhält man das Sensorgramm (C). Sche-matische Darstellung des optischen Systems des Biacore 3000 (D, C) [175, Seite 19-22].
In Abb. 31D ist der schematische Aufbau des optischen Systems im Biacore 3000
aufgezeigt. In der optischen Einheit befinden sich die Lichtquelle, das Prisma und der
Detektor. Dem schließt sich das optische Interface an. Es besteht aus Silicon und
bewirkt eine gute optische Kopplung zwischen Prisma und dem Glasträger des
Sensorchips [175, Seite 2-11]. Zwischen der Goldschicht des Sensorchips und der IFC
(Integrated -Fluidic Cartridge) befinden sich bei eingesetztem Chip vier separate
Flusszellen (Abb. 31E).
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 56 -
In dieser Arbeit wurden CM5- und C1-Sensorchips verwendet. Beim CM5-Chip ist die
Oberfläche mit einer Schicht aus unverzweigtem carboxymethylierten Dextran bedeckt,
die ca. 100 nm dick ist. Bei Dextran handelt es sich um ein aus carboxymethylierten
Glucose-Monomeren aufgebautes Polysaccharid. Die Dextranschicht bietet eine
hydrophile Oberfläche. Im Gegensatz dazu ist die Goldoberfläche beim C1-Chip direkt
carboxyliert [176, Seite 19.13.4].
Abb. 32: Zusammenhang zwischen der SPR und der Affinitätsseparation. Im oberen Teil der Abbildung sind die Schritte der Affinitätsseparation dargestellt. Im Sensorgramm sind die Schritte grau hinterlegt. Adsorption (1), Waschen (2), Desorption (3) und Regeneration (4).
Vorteilhaft bei der Verwendung der SPR-Technik zur Entwicklung von Affinitätstrenn-
verfahren ist die geringe Ligandenmenge, die zur Immobilisierung benötigt wird.
Ebenfalls ist weniger Probenmaterial notwendig und der Verbrauch an Laufpuffern,
Wasch- und Desorptionslösungen fällt geringer aus. Den Zusammenhang zwischen
der SPR-Technik und der Affinitätsseparation verdeutlicht Abb. 32.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 57 -
4.6 Immobilisierungen
4.6.1 Immobilisierung von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 auf Sensorchips Die Immobilisierung von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 erfolgt auf CM5- und C1-Chips.
Hiefür wird das Amin-Coupling-Kit von GE Healthcare verwendet, das für die
Immobilisierung die notwendigen Chemikalien 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbo-
diimidhydrochlorid (EDC), N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Ethanolaminhydrochlorid
(1,0 M, pH 8,5) enthält. Von EDC und NHS werden Lösungen in Reinstwasser von je
0,4 M bzw. 0,1 M angesetzt. Je ca. 1,5 mg werden von NH2-TBL1 bzw. NH2-TBL2
eingewogen, in 100 µL DMSO gelöst und anschließend mit 900 µL Acetatpuffer
(10 mM, pH 5,0) verdünnt. Diese Lösungen können direkt in das Biacore 3000 injiziert
werden. Für einige Versuche erfolgt auch eine Verdünnung mit DMSO/Acetatpuffer
(1:9, v/v).
Während der Immobilisierung ist ein Fluss von 5 µL/min verwendet worden. Zur
Aktivierung der Carboxygruppen werden die Lösungen von EDC und NHS im
Verhältnis von 1 zu 1 gemischt und danach injiziert. Über das Injektionsvolumen kann
der Aktivierungsgrad der Oberfläche und somit auch die Immobilisierungsausbeute
gesteuert werden. Anschließend erfolgt die Aufgabe der Ligand-Lösungen in 3-10 µL-
Impulsen. Die Chipoberfläche wird danach mit 5 µL einer Ethanol/Wasser-Mischung
(7:3, v/v) und 70 %igem Ethanol gewaschen, um ungebundene Liganden zu entfernen.
Zur Deaktivierung verbliebener aktivierter Carboxygruppen auf der Oberfläche werden
50 µL einer 1 M Ethanolamin-Lösung injiziert. Mit HBS-N-Puffer (0,01 M 2-[4-(2-
hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (HEPES), 0,15 M NaCl, pH 7,4;
GE Healthcare) ist anschließend die Chipoberfläche für einige Stunden gespült worden
[177, Seite 1527].
Die Anzahl der Publikationen von SPR-Anwendungen, die sich mit der Immobilisierung
kleiner Moleküle als Liganden befasst, ist niedrig. In der Regel werden
Biomakromoleküle immobilisiert. Einen Überblick über aktuelle Anwendungen bietet
der Review von Homola [178, Seite 475-489].
Damit kleine Moleküle mittels der Amin-Coupling-Methode direkt auf CM5- oder C1-
Chips immobilisiert werden können, benötigen sie eine Amino- oder Thiolfunktion. Sind
diese Funktionen bereits nativ im Molekül enthalten, dürfen sie sich nicht in der
Bindungsregion befinden, mit der die Interaktion zum Zielmolekül stattfindet. Ist keine
Amino- oder Thiolfunktion enthalten, müssen diese chemisch am Molekül eingeführt
werden, wie es bei den verwendeten Liganden NH2-TBL1 und NH2-TBL2 durch
Ethylendiamin geschehen ist. In der Literatur finden sich ähnliche Vorgehensweisen.
Cannon et al. beispielsweise modifizierten Cobalamin (Vitamin B12) mit Diaminopentan,
um es anschließend auf CM5-Chips zu immobilisieren [179, Seite 4]. Weitere Beispiele
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 58 -
zur Darstellung aminofunktionalisierter Liganden, die speziell für die Immobilisierung
mittels Amin-Coupling auf CM5-Chips synthetisiert wurden, finden sich bei
Samsonova et al. und Svedham et al. [180, Seite 978; 181, Seite 191].
Der Reaktionsmechanismus der Immobilisierung von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 ist in
Abb. 33 dargestellt.
Abb. 33: Reaktionsmechanismus der Aktivierung gefolgt von der Immobilisierung der Triazinliganden auf einer CM5-Chipoberfläche (R = Dextranmatrix). Nach der Reaktion mit EDC und NHS bildet sich ein aktivierter NHS-Ester aus, der in der Lage ist, mit den synthetischen Liganden unter Ausbildung einer Carbonsäureamid-Gruppe zu reagieren.
Aufgrund der geringen Wasserlöslichkeit der Triazinliganden, die nach der Synthese
als Hydrochloride isoliert werden, müssen diese zunächst in einem geeigneten
organischen Solvens gelöst werden. Es wird DMSO verwendet, da es sich als
Lösungsmittel für organische Salze besonders gut eignet [182, Seite 155].
Anschließend muss der DMSO-Gehalt mit Acetatpuffer auf 10 % eingestellt werden,
höhere Gehalte können das Flusssystem des Biacore 3000 beschädigen.
In einem Vorversuch ist bestimmt worden, ob DMSO die Immobilisierung stört. Dazu
wird über die aktivierte Chipoberfläche ein DMSO-Acetatpuffer-Gemisch ohne
Liganden injiziert. Es konnte keine Änderung des Resonanzsignals festgestellt werden.
Auch die Immobilisierung der Liganden war anschließend noch möglich (vgl. Abb. 76
im Anhang).
In einem zweiten Vorversuch ist das Verhalten beider Liganden gegenüber der
nichtaktivierten CM5-Chipoberfläche untersucht worden. Da die Liganden als Hydro-
chloride vorliegen, sollte eine effektive Vorkonzentrierung auf der Chipoberfläche statt-
finden. Die protonierten und damit positiv geladenen Aminogruppen der Liganden
lagern sich hierbei an die negativ geladenen Carboxygruppen der Dextranmatrix an
und erhöhen so die Effektivität und Ausbeute der Amin-Coupling-Methode [176, Seite
19.13.5]. Abb. 77 im Anhang zeigt, dass die gewünschte Vorkonzentrierung auf der
Chipoberfläche erfolgt. Nach einem kurzen Impuls steigt das Resonanzsignal bei NH2-
TBL1 um ca. 400 RU an, während es bei NH2-TBL2 ca. 50 RU sind.
Ein exemplarisches Sensorgramm für die Immobilisierung von NH2-TBL1 und
NH2-TBL2 ist in Abb. 34 dargestellt. Nach der Aktivierung sollte das Resonanzsignal
um ca. 200 bis 300 RU gestiegen sein, wobei etwa 40 % aller Carboxygruppen aktiviert
werden [173, Seite 40; 183, Seite 272]. In Abhängigkeit der Konzentration der
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 59 -
injizierten Ligand-Lösungen und des Injektionsvolumens kann die Belegung der
Chipoberfläche gesteuert werden.
Abb. 34: Immobilisierung von NH2-TBL1 (A) und NH2-TBL2 (B) auf CM5-Sensorchips. Der obere Teil der Abbildung von A und B zeigt bezüglich der Ordinatenachse das gesamte Sensorgramm, während der untere Teil der Abbildung den Bereich zwischen 21000 und 27000 RU vergrößert darstellt. Experimentelle Bedingungen zu A: (1) Aktivierung, (2) NH2-TBL1-Injektion (7 µL, 2,2 mg/mL), (3) Ethanolamin-Injektion (50 µL), (4) Ethanol-Injektion (70 %, 2x5 µL), (5) Ethanolamin-Injektion (25 µL). Experimentelle Bedingungen zu B: (1) Aktivierung, (2) NH2-TBL2-Injektion (3 µL, 0,2 mg/mL), (3) Ethanolamin-Injektion (50 µL), (4) Ethanol-Injektion (70 %, 5 µL). Der Doppelpfeil in (B) zeigt graphisch die Immobi-lisierungsausbeute an.
Aus Abb. 34 geht hervor, dass die Immobilisierung beider Liganden auf der Dextran-
matrix der CM5-Sensorchips erfolgreich verläuft, da das Resonanzsignal am Ende des
Immobilisierungsprozesses höher ist als zu Beginn. In der Abb. 34B ist dies durch den
Doppelpfeil kenntlich gemacht worden. Nach Abschluss der Ethanolamin-Injektion ist
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 60 -
das Resonanzsignal größer als zu Beginn der Immobilisierung, infolge der
Massenzunahme auf der Chipoberfläche durch die immobilisierten Liganden. Einen
Überblick zu den in dieser Arbeit durchgeführten Immobilisierungen liefert Tabelle 4.
Tabelle 4: Immobilisierungsexperimente von NH2-TBL1 und NH2-TBL2. Die Differenz der Resonanzsignale wird nach 10 min bestimmt, nachdem die Injektion von Ethanol oder Ethanolamin abgeschlossen ist.
Nr. Ligand Aktivierungs-
ausbeute [RU]
Konzentration Ligand
[mg/mL]
Kontakt-zeit
[min]
Immobilisierungs-ausbeute
[RU]
Oberflächen-belegung [µmol/m2]
1 NH2-TBL2 190 1,9 6 3599 9,00
2 NH2-TBL2 220 0,19 1 2239 5,57
3 NH2-TBL2 104 0,19 0,6 1629 4,05
4 NH2-TBL2 170 0,38 0,6 1634 4,06
5 NH2-TBL2 42 0,011 2,2 26 0,06
6 NH2-TBL2 116 0,015 3,5 88 0,21
7 NH2-TBL2 233 0,015 5 185 0,46
8 NH2-TBL2 (C1-Chip)
346 0,025 2 214 0,53
9 NH2-TBL1 177 0,062 1,4 100 0,28
10 NH2-TBL1 296 2,2 1 57 0,16
Aus der Immobilisierungsausbeute wird die Oberflächenbelegung auf der Chip-
oberfläche berechnet. Zur Berechnung wird davon ausgegangen, dass ein Anstieg des
Resonanzsignals um 1 RU einer Massenzunahme auf der Oberfläche von 1 pg/mm2
entspricht. Daraus berechnet sich die Oberflächenbelegung AO in µmol/m2 nach
folgender Formel [173, Seite 27].
LigandO M
alanstiegsonanzsignReA (7)
MLigand Molare Masse der Liganden [g/mol]
Unter den gewählten experimentellen Bedingungen zeigt NH2-TBL2 gegenüber NH2-
TBL1 ein besseres Immobilisierungsverhalten. Grundsätzlich lässt sich festhalten, dass
durch Verwendung konzentrierter Ligand-Lösungen und langen Kontaktzeiten eine
höhere Oberflächenbelegung von NH2-TBL2 erreicht werden kann. Beispielsweise in
Experiment-Nr. 4 (Tabelle 4) konnten 1634 RU immobilisiert werden, was einer
Oberflächenbelegung von 4,1 µmol/m2 entspricht. Eine signifikant geringere Belegung
wird erreicht, wenn die Ligandenkonzentration um eine Zehnerpotenz niedriger ist. In
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 61 -
Experiment-Nr. 6 (Tabelle 4) konnte eine Signaldifferenz von 88 RU ermittelt werden.
Das entspricht einer Oberflächenbelegung von ca. 0,2 µmol/m2.
Ein anderes Bild zeichnet sich ab, wenn NH2-TBL1 auf einem CM5-Chip immobilisiert
werden soll. Nach der Immobilisierung von NH2-TBL1 lässt sich der Großteil des
Liganden wieder von der Oberfläche waschen und nur ein kleiner Teil verbleibt auf
dieser. Es konnte zwar eine Vorkonzentrierung von NH2-TBL1 auf der nicht-aktivierten
Dextranoberfläche beobachtet werden, diese kann jedoch nicht auf die
Wechselwirkung zwischen der geladenen Amino- und Carboxygruppe zurückgeführt
werden. Möglicherweise beruht die Vorkonzentrierung auf der Oberfläche auf einer
glycospezifischen Interaktion zwischen den carboxymethylierten Glucosemolekülen
des Dextrans und von NH2-TBL1. Gupta et al. berichten auch von einer Affinität zu
Glucose [140, Seite 218].
Des Weiteren ist die Oberflächenbelegung im Gegensatz zu NH2-TBL2 unabhängig
von der Konzentration der injizierten Ligand-Lösung. Wird eine niedrig konzentrierte
Lösung injiziert, kann ein Wert für die Oberflächenbelegung von 0,28 µmol/m2
bestimmt werden (Nr. 9, Tabelle 4). Durch Verwendung einer 35mal höher
konzentrierten Lösung war es nicht möglich, diesen Wert deutlich zu steigern. Hier
wurde ein Wert von 0,16 µmol/m2 bestimmt (Nr. 10, Tabelle 4).
Um die Plausibilität der experimentellen Ergebnisse der Oberflächenbelegung zu
überprüfen, werden diese mit einem berechneten Wert verglichen. Am Beispiel von
NH2-TBL2 ist das Vorgehen verdeutlicht.
Zunächst muss der Platzbedarf eines einzelnen immobilisierten NH2-TBL2-Liganden
theoretisch bestimmt werden. Dazu wird von folgenden Modellvorstellungen
ausgegangen, die in Abb. 35 visuell dargestellt sind. Zunächst wird die Konformation
von NH2-TBL2 gewählt, bei der die 5-Aminoindan-Substituenten den größtmöglichen
Abstand voneinander haben. Der Abstand wird zwischen den weitesten voneinander
entfernt liegenden Kohlenstoffatomen der Substituenten bestimmt. Dieser wird mit dem
Swiss-PDB-Viewer 4.0 bestimmt und beträgt ca. 17 Å (Abb. 35A). NH2-TBL2 ist über
Ethylendiamin an die Dextranmatrix immobilisiert. Das verleiht dem Liganden ein
gewisses Maß an Flexibilität, und es kann angenommen werden, dass der Ligand
durch die „Ethylendiaminbrücke“ kreisförmig rotieren kann (skizziert in Abb. 35B).
Dieser Kreis beschreibt den Platzbedarf eines einzelnen Liganden. Des Weiteren wird
davon ausgegangen, dass die beschriebenen Kreise möglichst dicht gepackt sind
(Abb. 35C), sich dabei aber nicht überlappen (Abb. 35D). Damit kommt man zu einer
hexagonal dichtesten Packung. Unter Berücksichtigung der Ausschlussfläche, die bei
einer hexagonal dichtesten Packung frei bleibt, berechnet sich die theoretische Ober-
flächenbelegung in µmol/m2 auf der Chipoberfläche nach folgender Formel.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 62 -
3N2/d
105A
A
2
Sub
25
)htheoretisc(O (8)
NA Avogadro-Konstante [mol-1]
dSub Abstand Substituenten [Å]
Die berechnete Oberflächenbelegung für NH2-TBL2 beträgt 0,66 µmol/m2. Dieser Wert
ist eine Zehnerpotenz niedriger als der für Experiment-Nr. 4 in Tabelle 4 berechnete
Wert. Werden Lösungen niedriger Ligandenkonzentrationen injiziert, kommt der
experimentell bestimmte Wert der theoretischen Oberflächenbelegung sehr nahe (Nr. 6,
Tabelle 4).
Abb. 35: Zur Bestimmung der theoretischen Ligandendichte wird die Konformation von NH2-TBL2 gewählt, bei der der größtmögliche Abstand der 5-Aminoindan-Substituenten auftritt. Die Konformation wird einer Energieminimierung unterzogen, und der Abstand zwischen beiden am weitesten voneinander entfernten Kohlenstoffatomen von 5-Aminoindan bestimmt (A). Draufsicht mit skizzierter Kreisfläche (B). Hexagonal dichteste Kreispackung der Liganden unter der Annahme, dass sich die Kreisflächen nicht überlappen (C). Überlappung der Kreisflächen (D).
Mögliche Gründe für die höheren tatsächlichen Oberflächenbelegungen von NH2-TBL2
sind vermutlich in der Struktur der Dextranmatrix zu suchen. Bei der Berechnung wird
von der Annahme ausgegangen, dass die Oberfläche planar ist. Die Dextranmatrix auf
dem CM5-Chip ist ca. 100 nm dick und weist eine gewisse Flexibilität ebenso Ecken
und Kanten auf. Daher ist es vorstellbar, dass NH2-TBL2 in der Lage ist, etwas in die
Oberfläche einzudringen und somit dort an aktivierte Carboxymethyl-Gruppen zu
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 63 -
immobilisieren sowie über Ecken und Kanten weitere „virtuelle“ Oberflächen abzu-
decken [177, Seite 1527]. Es würde so zu einem Stapeleffekt der Liganden kommen,
wobei mehrere Liganden übereinander liegen.
Weiterhin ist der Fall wie in Abb. 35D dargestellt möglich, bei dem sich die Kreisflächen
überlappen. Hier müssten die gewählten Modellvorstellungen angepasst werden. Dies
liegt daran, dass innerhalb der beschriebenen Kreisfläche mehrere modifizierte
Glucosemonomere des Trägers liegen und so die tatsächliche Oberflächenbelegung
höher sein kann.
Zur Überprüfung der Modellvorstellung wird auf einem C1-Chip eine Immobilisierung
von NH2-TBL2 vorgenommen. Die Oberfläche dieses Sensorchips besitzt eine planare,
carboxylierte Oberfläche ohne Dextranmatrix. An dieser wird NH2-TBL2 ebenfalls
mittels Amin-Coupling gebunden [176, Seite 19.13.4]. Hier konnte eine Signaldifferenz
von 214 RU bestimmt werden, was einer Ligandendichte auf der Oberfläche von
0,53 µmol/m2 entspricht (Nr. 8, Tabelle 4). Dieser Wert liegt sehr nahe an der
berechneten Oberflächenbelegung von 0,66 µmol/m2. Es kann angenommen werden,
dass NH2-TBL2 in einer hexagonal dichtesten Kreispackung auf der Oberfläche des
C1-Chips angeordnet ist. Somit bestätigt sich auch die Vermutung, dass die Liganden
in der Lage sind, in die Oberfläche der Dextranmatrix einzudringen. Wäre die
Vermutung, wie in Abb. 35D dargestellt, korrekt, müsste auch bei der Verwendung
eines C1-Chips eine höhere Oberflächenbelegung zu beobachten sein.
Für die Berechnung der theoretischen Oberflächenbelegung von NH2-TBL1 werden die
gleichen Annahmen wie für NH2-TBL2 gemacht. In der Konformation, in der die Benzyl-
Substituenten den größten Abstand voneinander haben, beträgt dieser 14,7 Å. Es
ergibt sich eine berechnete, maximale Oberflächenbelegung von 0,9 µmol/m2, die
höher ist als die experimentell erreichte. Diese liegt bei 0,28 µmol/m2 bzw.
0,16 µmol/m2 (Nr. 9 und Nr. 10 in Tabelle 4).
Es konnte in diesem Abschnitt gezeigt werden, dass die Modifizierung von TBL1 und
TBL2 mit Ethylendiamin eine erfolgreiche Strategie zur Immobilisierung von Triazin-
liganden auf Sensorchipoberflächen sein kann. Anhand von NH2-TBL2 konnte nach-
gewiesen werden, dass die Oberflächenbelegung steuerbar ist. Jedoch lassen sich die
Immobilisierungsbedingungen nicht pauschal auf andere Liganden übertragen, wie
NH2-TBL1 zeigte. Hier müssen andere Parameter gefunden werden, welche die
diskutierte glycospezifische Interaktion mit der Dextranmatrix verhindert und so die
Oberflächenbelegung erhöht.
4.6.2 Immobilisierung von TBL1 und TBL2 auf Silica TBL1 und TBL2 werden auf Kieselgel 100 mit einer Korngrößenverteilung von 0,063-
0,200 mm (Herstellerangaben) immobilisiert. Die Funktionalisierung wurde durch
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 64 -
Mitarbeiter der Arbeitsgruppe von Prof. Niemeyer an der Helmut-Schmidt-Uni-
versität / Universität der Bundeswehr Hamburg vorgenommen. Zunächst wird das
Silica mit Aminopropyltriethoxysilan silanisiert [184]. Hierzu wird 1 g Silica eingewogen,
bei 60 °C und unter vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Das Silica wird in
20 mL Toluol suspendiert und unter Rühren wird 1 mL Aminopropyltriethoxysilan
(Aptes) zur Suspension gegeben. Der Reaktionsansatz wird 1,5 h unter Rückfluss
gekocht. Anschließend erfolgt das Abfiltrieren und Waschen des Silicas mit jeweils
20 mL Toluol und Aceton. Das Silica wird bei 60 °C für 6 h getrocknet.
Zur Immobilisierung der Liganden werden 326 mg (1 mmol) TBL1 oder 378 mg
(1 mmol) TBL2 in 15 mL DMSO gelöst. Die Lösungen sowie 140 µL (1 mmol) Tri-
ethylamin werden zu 1 g aminofunktionalisiertem Silica (APS-Silica) gegeben. Die
Suspension wird bei 80 °C über Nacht gerührt. Anschließend wird das Silica abfiltriert,
gründlich mit DMSO und Aceton gewaschen und bei 60 °C für 6 h getrocknet.
Der Erfolg der Immobilisierung ist mittels Elementaranalyse an der Helmut-Schmidt-
Universität überprüft worden. Weiterhin erfolgte die Entwicklung einer massenspektro-
metrischen Methode mittels ESI-MS für den qualitativen Nachweis der Liganden auf
der Silica-Oberfläche.
4.6.2.1 Ergebnisse der Elementaranalyse Die Immobilisierung von Triazinliganden durch eine nucleophile Substitution auf amino-
funktionalisiertem Silica ist u.a. durch Anspach et al. beschrieben worden [151, Seite
197]. Die Charakterisierung des Trägermaterials kann mittels IR-, NMR-Spektroskopie,
Thermogravimetrie sowie der Elementaranalyse erfolgen [185, Seite 3166]. Die
Ergebnisse, der in dieser Arbeit durchgeführten Elementaranalyse, sind in Tabelle 5
dargestellt.
Tabelle 5: Ergebnisse der Elementaranalyse.
Probe Kohlenstoff
(%) Stickstoff
(%) Wasserstoff
(%) C/N-Verhältnis (experimentell)
C/N-Verhältnis (theoretisch)
Oberflächenbelegung (µmol/m2)
APS-Silica
3,6 1,1 0,3 - -
TBL1-Silica
7,5 2,2 0,6 4,1 3,4 0,7
TBL2-Silica
10,3 2,8 0,9 4,6 4,2 1,0
Im Vergleich zum APS-Silica, dem Ausgangsmaterial steigt der Kohlenstoff- und
Stickstoffgehalt bei TBL1- und TBL2-Silica deutlich an. Daraus kann geschlossen
werden, dass die Immobilisierung erfolgreich verlaufen ist. Weiterhin kann durch die
vorhandenen Daten sowohl das Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis als auch die Ober-
flächenbelegung berechnet werden. Das aus den experimentellen Werten berechnete
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 65 -
Verhältnis sollte mit dem Verhältnis, das sich aus der Summenformel ergibt, über-
einstimmen.
Dabei wird davon ausgegangen, dass eine bestimmte Masse APS-Silica neben
Kohlenstoff und Stickstoff weitestgehend aus den Elementen Silicium und Sauerstoff
besteht. Die Masse der Elemente Silicium und Sauerstoff mSi,O berechnet sich wie folgt.
100
wm
100
wm
100
wmmm APSH%
APSAPSN%
APSAPSC%
APSAPSO,Si (8)
mSi,O Masse der übrigen Elemente, insbesondere Silicium und Sauerstoff [g]
mAPS Masse APS-Silica [g]
w%C-APS prozentualer Kohlenstoffgehalt in APS-Silica
w%N-APS prozentualer Stickstoffgehalt in APS-Silica
w%H-APS prozentualer Wasserstoffgehalt in APS-Silica
Die Masse an Silicium und Sauerstoff mSi,O im Silica muss nach der Immobilisierung
von TBL1 und TBL2 konstant bleiben. Der prozentuale Anteil w%Si,O sinkt jedoch infolge
des steigenden Kohlenstoff-, Stickstoff- und Wasserstoffgehaltes und ergibt sich zu
TBLH%TBLN%TBLC%O,Si% www%100w , (9)
w%Si,O prozentualer Gehalt der übrigen Elemente in TBL1 oder TBL2
w%C-TBL prozentualer Kohlenstoffgehalt in TBL1 oder TBL2
w%N-TBL prozentualer Stickstoffgehalt in TBL1 oder TBL2
w%H-TBL prozentualer Wasserstoffgehalt in TBL1 oder TBL2
woraus sich die Gesamtmasse nach der Immobilisierung berechnet.
O,Si%
O,SiTBL w
%100mm (10)
mTBL berechnete Masse TBL1 oder TBL2 [g]
Die Massenanteile von Kohlenstoff, Stickstoff und Wasserstoff, die nach der
Immobilisierung auf das APS-Silica gelangt sind, ergeben sich dann wie nachfolgend
beispielhaft für Kohlenstoff dargestellt.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 66 -
100
wm
100
wmm APSC%
TBLTBLC%
TBLTBLC (11)
mC-TBL Masse für Kohlenstoff in TBL1 oder TBL2 [g]
Aus den Massenanteilen von Kohlenstoff und Stickstoff wird die Stoffmenge berechnet
und das Kohlenstoff-Stickstoffverhältnis gebildet. Aus der Summenformel der Liganden
berechnet sich das theoretische Verhältnis. In Tabelle 5 sind die Ergebnisse hierfür
aufgeführt.
Das experimentelle Kohlenstoff-Stickstoffverhältnis ist bei beiden Liganden größer als
das aus der Summenformel berechnete Verhältnis. Dies deutet darauf hin, dass der
Trocknungsschritt nach der Immobilisierung nicht ausreichend war. Auf der Oberfläche
verbleibende kohlenstoffhaltige Lösungsmittelreste erhöhen vermutlich den Kohlen-
stoffgehalt, was wiederum zur Erhöhung des Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnisses führt.
Zur Berechnung der Oberflächenbelegung bezogen auf ein Gramm Trägermaterial wird
daher der Stickstoffgehalt herangezogen. Für TBL1-Silica ergibt sich eine Oberflächen-
belegung von 0,16 mmol/g. Diese beträgt bei TBL2-Silica 0,24 mmol/g.
Anspach et al. haben für die Immobilisierung ihrer Triazinliganden auf APS-Silica
mittels Photometrie Werte in gleicher Größenordnung bestimmt. Für Procion Red
MX5B berechneten sie einen Wert von 0,35 µmol/m2, für Procion Red HE3B einen
Wert von 0,12 µmol/m2. Mit einer molaren Masse von 615 g/mol und 1228 g/mol waren
die verwendeten Liganden allerdings deutlich größer und haben einen höheren
Platzbedarf, was die niedrigere Oberflächenbelegung begründet [151, Seite 196].
Andere Immobilisierungsstrategien für Triazine, z.B. über Silanisierung mittels
Glycidoxypropyltrimethoxysilan und Anbindung der Liganden über Epoxy-Gruppen,
liefern deutlich geringere Oberflächenbelegungen, wie Anspach et al. und Lowe et al.
zeigten [151, Seite 199; 186, Seite 307].
Zum Vergleich wird erneut ein theoretischer Wert für die Oberflächenbelegung
berechnet. Dazu wurde die spezifische Oberfläche mittels der BET-Methode1 durch
Mitarbeiter der Arbeitsgruppe von Prof. Niemeyer an der Helmut-Schmidt-Universität
Hamburg bestimmt. Für das verwendete Kieselgel 100 liegt diese bei 292 m2/g. Jedoch
ist nicht die gesamte spezifische Oberfläche des Silicas für die Liganden zugänglich.
Um die Zugänglichkeit abzuschätzen wird die BJH-Methode2 angewandt, bei der die
1 Die BET-Methode zur Bestimmung der spezifischen Oberfläche ist nach ihren Entdeckern S. Brunauer, P. H. Emmet
und E. Teller benannt. 2 Die BJH-Methode zur Berechnung der Porengrößenverteilung ist nach ihren Entdeckern E. P. Barret, L. G. Joyner und
P. P. Halenda benannt.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 67 -
Verteilung der Porenweite bestimmt wird. Bei Kenntnis der Größe der Liganden kann
die Oberfläche abgeschätzt werden, die für die Liganden zugänglich ist.
Die maximale Ausdehnung beider Liganden beträgt 15 Å für TBL1 und 17 Å für TBL2
(vgl. Abschnitt 4.6.1). Für die Berechnung muss ein größerer Wert angenommen
werden, da die Liganden bei ihrer maximalen Ausdehnung Kontakt mit den Wänden
des Adsorbens hätten. Zur groben Abschätzung wird daher ein Wert von 30 Å
verwendet. Damit ergibt sich aus dem BJH-Plot, dass 229 m2 pro Gramm der Ober-
fläche für die Liganden zugänglich sind. Somit ergibt sich für die TBL1 eine
Oberflächenbelegung von 0,7 µmol/m2 und für TBL2 von 1,0 µmol/m2. Angemerkt sei,
dass sogenannte Flaschenhälse nicht bei der BJH-Methode berücksichtigt werden.
Hierbei handelt es sich um lokale Engstellen im Porengefüge, durch die die Liganden
aufgrund ihrer Größe nicht hindurchpassen.
Die theoretisch mögliche Oberflächenbelegung wird wie folgt abgeschätzt. Unabhängig
von der Struktur des Kieselgels beträgt die Silanoldichte auf der Oberfläche ca.
7,7 µmol/m2 (Kiselev-Zhuravlev-Konstante) [187, Seite 20]. Infolge sterischer Gründe
kann Aptes bei der Funktionalisierung nur mit einer oder zwei Silanolgruppen zum
APS-Silica reagieren. Im vorliegenden Fall wird eine 1:2-Stöchiometrie zugrunde gelegt,
da das dem Aptes chemisch ähnliche 1-Aminoethyl-3-aminopropyltrimethoxysilan
(Aeats) in dieser Weise reagiert [188, Seite 94]. Das bedeutet, dass pro Quadratmeter
Trägermaterial 3,9 µmol Aptes-Moleküle angebunden werden können. Bei
vollständiger Umsetzung aller Aminogruppen sind dann ebenfalls 3,9 µmol/m2 TBL1
bzw. TBL2 immobilisiert.
Dieser größere theoretische Wert lässt sich durch folgende Überlegungen erklären.
Erstens beträgt das stöchiometrische Verhältnis 1:1 bei der Immobilisierung, d.h. auf
1 mol Ligand kommt etwa 1 mol der Aminogruppen des APS-Silicas. Um die
Immobilisierungsausbeute zu steigern kann eine Erhöhung der Ligandenkonzentration
im Reaktionsansatz angestrebt werden. Zweitens können auch sterische Gründe, die
durch die reine Größe der Liganden verursacht werden, eine Rolle spielen.
Die Ergebnisse der Elementaranalyse belegen die erfolgreiche Immobilisierung von
TBL1 und TBL2 auf APS-Silica. Zur Absicherung dieses Ergebnisses wird ein
qualitativer massenspektrometrischer Nachweis angewendet, der im nachfolgenden
Abschnitt vorgestellt wird.
4.6.2.2 Ergebnisse der massenspektrometrischen Charakterisierung Für die qualitative Überprüfung des Erfolges der Immobilisierung mittels ESI-MS wird
wie folgt vorgegangen. Es werden 20 mg des modifizierten Silicas mit 400 µL einer 2 M
Kaliumhydroxydlösung hydrolysiert. Nach 2 h werden 25 µL des Hydrolysates
entnommen und mit 75 µL Trimethylsilylimidazol versetzt. Die Mischung wird für 15 min
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 68 -
bei Raumtemperatur gerührt und anschließend stehengelassen, wobei sich eine
organische und eine wässrige Phase ausbildet [189, Seite 332]. 10 µL der organischen
Phase werden entnommen und mit 1 mL Methanol/Ameisensäure (99:1, v/v) verdünnt.
Die Lösung wird dann mittels einer Spritzenpumpe direkt in die ESI-Quelle des
Massenspektrometers injiziert. Die Messung erfolgt im positiven Modus mit folgenden
Einstellungen der ESI-Quelle: Ionspray voltage 4500 V, Nebulizing gas (gas 1) 35 psi,
Turbo gas 50 psi, Turbo gas temperature 350 °C mit eingeschaltetem Interface heater,
Curtain gas 10 psi. Analytabhängige Parameter sind während den Messungen
verändert worden. Zur genaueren Charakterisierung sind die Molekülionenpeaks
fragmentiert worden.
Die Hydrolyse des Silicas unter basischen Bedingungen und die anschließende
Derivatisierung der Hydrolyseprodukte mit Trimethylsilylimidazol ist in Abb. 36
dargestellt.
Abb. 36: Hydrolyse und Derivatisierung der TBL-Liganden.
Unter diesen Bedingungen sollten, wie aus Abb. 36 hervorgeht, die TBL-Liganden
weiterhin kovalent an (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan gebunden sein. Die
gemessenen Massenspektren der derivatisierten Hydrolyseprodukte von TBL1-, TBL2-
und APS-Silica sind in Abb. 37 dargestellt. Die Molekülionen [M+H]+ sind markiert
abgebildet. Für das derivatisierte Hydrolyseprodukt von TBL1-Silica (Abb. 37A) findet
sich der monoisotopische Peak bei 643,5 Da, der berechnete Wert liegt bei 643,3 Da.
Der Wert für die monoisotpische Masse des derivatisierten Hydrolyseproduktes TBL2-
Silica (Abb. 37B) beträgt 695,6 Da. Dagegen liegt der berechnete Wert bei 695,3 Da.
Abb. 37C zeigt das Massenspektrum von APS-Silica nach Hydrolyse und Deri-
vatisierung. Der Wert für die monoisotopische Masse wird bei 354,2 Da erwartet,
welcher experimentell bei 354,1 Da bestätigt wurde. Die anderen Peaks, die in den
Massenspektren zu sehen sind, stellen weitere derivatisierte Hydrolyseprodukte von
Silica dar. Aus den Spektren geht eindeutig hervor, dass die Immobilisierung
erfolgreich verlaufen ist, da die zu erwartenden Peaks von TBL1- und TBL2-Silica auch
tatsächlich nachgewiesen werden können. Daneben findet sich das Hydrolyseprodukt
von APS-Silica (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan ebenfalls in den
Massenspektren von TBL1 und TBL2. Hieraus kann geschlossen werden, dass nicht
alle Aminogruppen nach der Immobilisierung mit den Liganden belegt sind.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 69 -
Abb. 37: Massenspektren der derivatisierten Hydrolyseprodukte von TBL1- (A), TBL2- (B) und APS-Silica (C) nach Hydrolyse und Derivatisierung. Die Molekülpeaks der Liganden und von APS-Silica sind schwarz eingerahmt.
Zur endgültigen Absicherung wurden von den Hydrolyseprodukten Fragmentspektren
angefertigt, die in Abb. 38 dargestellt sind. Einige der auftretenden Peaks sind mit
möglichen Fragmentionen annotiert. Das Fragmentspektrum des Hydrolyseproduktes
von APS-Silica befindet sich in Abb. 75 im Anhang.
Die Fragmentionen bei 553,2 Da und 606,5 Da von TBL1- bzw. TBL2-Silica
entstammen der Abspaltung einer Trimethylsilyloxy-Gruppe in Form von Trimethyl-
silanol. Dabei verbleibt die positive Ladung am Siliciumatom, die über die Sauerstoff-
atome stabilisiert wird. Bei 264,2 Da findet sich auch das entsprechende Fragment für
APS-Silica. Charakteristisch für das Hydrolyseprodukt von TBL1-Silica ist das Auftreten
des Benzylkations bei 91,2 Da, welches sich zum stabilen Tropyliumion umlagert [117,
Seite 255]. Das entsprechende Fragmention nach Verlust eines Benzylrestes und einer
Trimethylsilyloxy-Gruppe ist bei 463,2 Da zu sehen. Wiederum in allen Spektren von
Abb. 38 und Abb. 75 findet sich ein Peak bei ca. 73 Da, der für die Abspaltung eines
Trimethylsilylkations spricht [190, Seite 8].
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 70 -
Abb. 38: Fragmentspektren der Hydrolyseprodukte nach Derivatisierung von TBL1- (A) und TBL2-Silica (B).
Weiterhin ist in beiden Spektren sowie im Spektrum des Hydrolyseproduktes von APS-
Silica ein ausgeprägter Peak bei 207,1 Da zu erkennen. Da die Peaks in allen
Fragmentspektren auftreten ist davon auszugehen, dass zunächst der Triazinrest des
Moleküls abgespalten wird. Anschließend muss es zu einer intramolekularen Um-
lagerung des (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan-Restes kommen. Mit einer
einfachen Abspaltung weiterer Molekülteile sind die auftretenden Fragmentionen in den
Massenspektren nicht zu erklären. Dass intramolekulare Umlagerungen, zumindest
zweier benachbarter Trimethylsilyloxy-Gruppen, möglich sind, zeigt die Literatur [191,
Seite 10]. Um welches Fragmention es sich in den Massenspektren handelt, konnte
abschließend nicht ermittelt werden.
Durch die vorgestellte massenspektrometrische Methode konnten die Ergebnisse aus
der Elementaranalyse bestätigt werden. Grundsächlich ist es möglich, diese Methode
als quantitative Methode auszulegen. Dazu genügt die Quantifizierung von (3-Amino-
propyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan, dem Hydrolyseprodukt von APS-Silica, zum einen
auf APS-Silica selbst und zum anderen auf dem Silica nach der Immobilisierung der
Liganden. Die Differenz beider Messungen liefert die Menge an immobilisierten Ligand.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 71 -
4.7 Interaktionsstudien In Abschnitt 4.6 ist die Immobilisierung der triazinbasierten Liganden auf Silica und auf
Sensorchips ausführlich beschrieben worden. Im folgenden Abschnitt soll die Eignung
der Liganden auf ihr Affinitätstrennverhalten hinsichtlich verschiedener Glycoproteine
und Saccharide untersucht werden. Dabei wird zunächst auf Interaktionsstudien mittels
SPR eingegangen.
4.7.1 SPR-Interaktionsstudien mit NH2-TBL1 und NH2-TBL2 Eine schematische Darstellung einer SPR-Messung ist in Abb. 39 dargestellt. Das in
rot dargestellte Sensorgramm zeigt das Resonanzsignal der Referenzzelle, wo nur
eine Änderung des Brechungsindex durch die Probeninjektion detektiert wird. Das
schwarze Sensorgramm offenbart Interaktion mit einem Liganden. Nach dem Anstieg
durch den Brechungsindex, der für alle Flusszellen gleich ist, kann ein weiterer Anstieg
durch die Interaktion eines Analyten mit einem Liganden beobachtet werden. Die
Differenz beider Sensorgramme ergibt die Netto-Anbindung.
Abb. 39: Schematische Darstellung einer SPR-Interaktionsmessung. Die Interaktionsstudien erfolgen mit den Glycoproteinen GOD und TG. Als Negativ-
kontrolle wird das nicht glycosylierte BSA verwendet. Die Standardpuffer von
GE Healthcare HBS-N (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, pH 7,4) und HBS-EP (HBS-N-
Puffer mit 3 mM EDTA, 0,005 % Netzmittel P20, pH 7,4) sowie ein Tris-HCl-Puffer
(0,01 M Triethylamin, 0,2 M NaCl, pH 7,0) werden zunächst auf ihre Eignung
untersucht. Der Tris-HCl-Puffer wird in den Interaktionsstudien von Palanisamy et al.
verwendet und hat sich als geeignet erwiesen [142, Seite 268]. Details zu den
injizierten Probenvolumina, Proteinkonzentrationen und den Einstellungen am
Biacore 3000 befinden sich in den Bildunterschriften.
Von den drei getesteten Standardpuffern zeigt HBS-N die beste Leistung für die
Durchführung der Interaktionsstudien. Dagegen kommt es zu keiner Interaktion, wenn
HBS-EP oder Tris-Puffer eingesetzt werden. In Abb. 40 sind die Sensorgramme für die
getesteten Puffer dargestellt.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 72 -
Abb. 40: Sensorgramme zum Einfluss von HBS-N-, HBS-EP- und Tris-Puffer auf das Adsorptionsverhalten von NH2-TBL2 zu GOD. Bedingungen: 1 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 1629 RU.
Jedoch kommt es in der Referenzflusszelle mit HBS-N-Puffer ebenfalls zur Adsorption
von GOD. Der HBS-EP-Puffer wird für SPR-Messungen häufig verwendet. Das darin
enthaltene Netzmittel P20, auch unter seinem Handelsnamen TWEEN 20 bekannt,
dient der Unterdrückung hydrophober Wechselwirkungen. Dabei soll insbesondere
verhindert werden, dass sich Proteine in Lösung über ihre hydrophoben Oberflächen-
bereiche zu Koagulaten zusammenlagern. Weiterhin sollen auch unspezifische
hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Liganden und Proteinen verhindert werden.
Wie im einleitenden Abschnitt und in Abschnitt 4.1 dargelegt, spielen auch hydrophobe
Wechselwirkungen bei der Bindung von Kohlenhydratstrukturen sowohl bei Lektinen
als auch bei synthetischen Liganden eine wichtige Rolle. Palanisamy et al. vermuten
einen hydrophoben Bindungsanteil auch bei NH2-TBL2. Im vorliegenden Fall ist es
möglich, dass das Netzmittel P20 diesen hydrophoben Bindungsanteil unterdrückt und
so die Adsorption von GOD an NH2-TBL2 verhindert [142, Seite 280]. Für weitere
Experimente wird daher HBS-N-Puffer verwendet.
Zur Abschätzung unspezifischer Wechselwirkungen von NH2-TBL2 wird BSA
verwendet. Serumalbumine sind Transportproteine für kleine, hydrophobe Moleküle
[192, Seite 583]. Für zwei unterschiedliche Oberflächenbelegungen von NH2-TBL2 auf
dem CM5-Chip und Fließgeschwindigkeiten sind BSA-Injektionen in Abb. 41 dargestellt.
Bei geringen Fließgeschwindigkeiten in Kombination mit einer hohen immobilisierten
Ligandenmenge kommt es zur Entstehung von hohen unspezifischen Wechsel-
wirkungen (Abb. 41A). Der Effekt kann zwar durch einen größeren Fluss bei moderater
Ligandendichte deutlich reduziert werden, dennoch ist der Anteil erheblich (Abb. 41B).
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 73 -
Abb. 41: Sensorgramme der Interaktion von NH2-TBL2 mit BSA. Bedingungen für (A): 1 mg/mL BSA, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 3599 RU. Bedingungen für (B): 1 mg/mL BSA, Fluss: 30 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 1634 RU.
Palanisamy et al. beschreiben die Desorption für NH2-TBL1 und NH2-TBL2 von GOD
mittels Methyl- -D-mannopyranose. In Abb. 42A sind die Desorptionsversuche mit
Methyl- -D-mannopyranose für GOD zu sehen. Nach der zweimaligen Injektion von
0,5 M Methyl- -D-mannopyranose in HBS-N-Puffer erfolgt nicht die gewünschte
Desorption der GOD. Auch eine weitere Erhöhung der Methyl- -D-mannopyranose -
Konzentration brachte nicht den gewünschten Effekt. Nur nach Injektion einer
70 %igen Ethanollösung konnte GOD desorbiert werden (Abb. 42A, Position 2).
Abb. 42: Sensorgramme zu den Desorptionsversuchen von NH2-TBL2 mit GOD (A) und TG (B). Zur besseren Übersicht ist nur die Ligandenflusszelle dargestellt. Bedingungen und Bemerkungen: (A): 1 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte Ligandenmenge: 3599 RU. (B): 1 mg/mL TG, Fluss: 10 µL/min, immobilisierte Ligandenmenge: 3599 RU. Verwendete Desorptionsreagenzien: 1. Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in HBS-N-Puffer), 2. Ethanol/Wasser (7:3, v/v), 3. Natriumdodecylsulfat (0,5 % in Wasser w/v).
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 74 -
Auch für das Glycoprotein TG konnte mit Methyl- -D-mannopyranose keine
spezifische Desorption erzielt werden. Für TG ist das nur mit dem unspezifisch
wirkenden Detergenz Natriumdodecylsulfat gelungen (Abb. 42B).
Die beschriebenen Experimente mit NH2-TBL2 sind mit hohen Ligandendichten
durchgeführt worden, die von 4 bis 8 µmol/m2 reichen. Die Ligandendichte ist ein
Faktor, der unspezifische Wechselwirkungen verursachen kann [39, Seite 161]. Daher
ist durch die Generierung von weniger dicht belegten Sensorchipoberflächen versucht
worden, unspezifische Wechselwirkungen von NH2-TBL2 zu reduzieren. Hierfür sind
Sensorchips mit Ligandendichten von ca. 0,06 bis 0,5 µmol/m2 hergestellt worden (vgl.
Tabelle 4 in Abschnitt 4.6.1). In beschriebener Weise sind die gleichen Protein-
lösungen injiziert worden. Im Gegensatz zur starken, unspezifischen Adsorption an
Sensorchips mit hohen Ligandendichten erfolgt bei den niedrigen Ligandendichten
keine Adsorption der Glycoproteine TG und GOD. Ein beispielhaftes Sensorgramm ist
hierzu im Anhang unter Abb. 78 zu finden. Die Ligandendichte beträgt hier 0,2 µmol/m2.
Ähnliche Beobachtungen haben Palanisamy et al. gemacht, wenn sie GOD auf eine
TBL2-Sepharose applizieren. Das GOD befindet sich dann in der Durchlauffraktion,
wenn die Ligandendichte der Sepharose im gequollenen Zustand niedriger als
11 µmol/g ist. Sie begründen diese Beobachtung damit, dass mehrere immobilisierte
TBL2-Moleküle mit einem GOD-Molekül einen Komplex eingehen. Ist die
Ligandendichte zu gering, sind die TBL2-Moleküle zu weit voneinander entfernt, um
einen effektiven Ligand-Makromolekül-Komplex zu bilden [142, Seite 273].
Ein ähnliches Bild ergibt sich, wenn man die beschriebenen Versuche mit NH2-TBL1
durchführt. Unter den gewählten Immobilisierungsbedingungen ist es nicht möglich,
NH2-TBL1 mit ähnlich hohen Ausbeuten an die Chipoberfläche zu binden, wie es für
NH2-TBL2 der Fall ist (vgl. Abschnitt 4.6.1). Beispielhafte Sensorgramme für GOD und
TG sind im Anhang in Abb. 79 zu finden. Zu erkennen ist, dass bei GOD das
Resonanzsignal nach Ende der Injektion wieder auf die Basislinie zurückfällt. Fast
gleich sehen die Sensorgramme für TG und BSA aus. Hier findet zwar augenscheinlich
eine Interaktion statt, die aber unspezifischer Natur sein könnte, da diese auch bei BSA
auftritt.
Die Neigung von Triazinliganden zur unspezifischen Adsorption wurde beispielsweise
auch durch Mohammad et al. beobachtet. Sie untersuchten die unspezifische
Adsorption von drei Triazinfarbstoffen zu humanem Serumalbumin und Transferrin.
Insbesondere Serumalbumin wurde von allen drei Farbstoffen adsorbiert und konnte
nur unspezifisch durch hohe Salzkonzentrationen bzw. durch Ethylenglycol desorbiert
werden [193, Seite 82-83]. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass unter den
gewählten Bedingungen keine glycospezifische Interaktion zwischen den Triazin-
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 75 -
liganden und GOD sowie TG auftritt. Zum einen können mittels Methyl- -D-
mannopyranose die Glycoproteine nicht kompetitiv desorbiert werden, zum anderen
findet auch die Adsorption des nicht-glycosylierten BSA statt, was sich auf jeden Fall
für die Anwendung auf hochkomplexe Gemische störend auswirkt.
4.7.2 Adsorptionsexperimente mit TBL1-Silica und TBL2-Silica Mit den Adsorbentien TBL1- und TBL2-Silica werden Interaktionsstudien im
Batchverfahren durchgeführt. Dabei wird erneut GOD als Modellglycoprotein
verwendet. Des Weiteren werden Studien mit verschiedenen Zuckern in Wasser und
Dimethylformamid (DMF) durchgeführt.
4.7.2.1 Glucose Oxidase Aus einer Stammlösung von GOD (1 mg/mL) in 0,1 M KH2PO4-Puffer (pH 7) werden
Verdünnungen im Bereich von 0,025 bis 1 mg/mL hergestellt. Zu 10 mg von TBL1-,
TBL2- und APS-Silica gibt man 1 mL der verschiedenen GOD-Lösungen.
Anschließend wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Konzentrations-
bestimmung von GOD erfolgt im Überstand bei =280 nm. Kalibriert wird ebenfalls mit
GOD. Die Gleichgewichtsbeladung berechnet sich nach folgender Formel.
Silica
GOD*
m
VCC*q 0 (12)
q* Gleichgewichtsbeladung Silica [mg/g]
C0 Ausgangskonzentration GOD [mg/mL]
C* Gleichgewichtskonzentration [mg/mL]
VGOD Zugabe GOD-Lösung [mL]
mSilica Einwaage Silica [mg]
Mit BSA wird der Versuch in oben beschriebener Weise durchgeführt, jedoch nur bei
einer festen Konzentration von 1 mg/mL.
Die Adsorptionsisothermen von GOD mit TBL1- und TBL2-Silica sind in Abb. 43A
dargestellt. TBL2-Silica zeigt das beste Adsorptionsverhalten gegenüber GOD gefolgt
von APS- und TBL1-Silica. In den SPR-Studien konnte bei hoher Oberflächenbelegung
ebenfalls eine Anbindung von GOD beobachtet werden. Jedoch erfolgt auch die
Adsorption von BSA an TBL1- und TBL2-Silica. Säulenversuche mit TBL2-Silica zeigen,
dass nach der Adsorption von GOD die Desorption mit Methyl- -D-mannopyranose
nicht möglicht ist (Abb. 43B).
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 76 -
Abb. 43: Adsorptionsisothermen von GOD mit TBL1-Silica, TBL2-Silica und APS-Silica (A). Darstellung eines Desorptionsversuches (B). Bei (1) erfolgt die Injektion von 0,5 mL einer GOD-Lösung in Tris-Puffer (10 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7). Die Injektion von Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in Tris-Puffer) bei (2) zeigt zwar einen Anstieg der Intensität durch die Eigenabsorption von Methyl- -D-mannopyranose, jedoch keinen Desorptionspeak. Bei (3) wird der Tris-Puffer über das Adsorbens gefördert und die Intensität sinkt wieder. Erst nach Waschen mit Ethanol/Wasser (2:8, v/v) konnte GOD desorbiert werden (4).
Diese Adsorptionsexperimente offenbaren wie die Ergebnisse der SPR-Studien, dass
eine glycospezifische Interaktion unter den gewählten Bedingungen nicht mit den
Liganden TBL1 und TBL2 möglich ist.
4.7.2.2 Zucker Nachfolgend werden die Liganden hinsichtlich ihres Adsorptionsverhaltens gegenüber
verschiedenen Zuckern charakterisiert. Dabei werden Saccharide verwendet, die
typischerweise auch in Glycoproteinen vorkommen [9, Seite 216]. Neben Wasser wird
DMF verwendet. Es ist ein aprotisches organisches Lösungsmittel und ist weniger
kompetitiv als Wasser, d.h. es konkurriert mit den Zuckern weniger um die
Bindungsstellen am Liganden [194, Seite 82].
Von TBL1-, TBL2- und APS-Silica werden je 20 mg in 2 mL Vials eingewogen. Die
Zucker Methyl- -D-mannopyranose, Methyl- -D-glucopyranose, N-Acetyl-D-glucos-
amin und 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose werden in Reinstwasser und
DMF gelöst. Die Konzentration aller Zucker beträgt in Wasser und DMF je 5 mM. Des
Weiteren werden Mischungen der Zucker mit Konzentrationen von je 5 mM in DMF und
Wasser angesetzt. Die Mischungen bestehen aus Methyl- -D-mannopyranose und
N-Acetylglucosamin. Von den Zuckerlösungen werden je 1 mL zu den verschiedenen
Adsorbentien pipettiert und die Vials für 24 h bei Raumtemperatur unter leichtem
Schütteln inkubiert. Unter den gleichen Bedingungen erfolgt als Vergleichsversuch die
Inkubation der Zucker, jedoch ohne Adsorbens.
Die Quantifizierung des Zuckergehaltes erfolgt mittels LC/MS nach einer Methode von
Rogatsky et al. [195, Seite 1806-1807]. Die Zucker werden chromatographisch
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 77 -
getrennt und massenspektrometrisch detektiert. Bei dieser Methode wird ausgenutzt,
dass Cäsium-Kationen mit ungeladenen Zuckern im positiven Modus der ESI-MS
einfach positiv geladene Adukte bzw. Komplexe [Zucker+Cs]+ bilden [196, Seite 3503].
Das API 4000 ist ein MS/MS-Gerät und arbeitet im Multiple Reaction Monitoring-Modus
(MRM). Die Übergänge [Zucker+133]+ 133+ mit einer dwell time (Verweilzeit auf
einem Übergang) von 300 ms werden für jeden Zucker detektiert [195, Seite 1807].
Dabei wird im ersten Quadrupol (Q1) des Massenspektrometers jeweils für 300 ms ein
bestimmtes Zucker-Adukt [Zucker+133]+ in die Kollisionszelle (Q2) überführt. Dort wird
das Zucker-Adukt gespalten und die Masse für das Cs+-Kation (133 g/mol) im dritten
Quadrupol (Q3) detektiert. Die Einstellungen am Massenspektrometer sind in Tabelle 6
dargestellt.
Tabelle 6: Massenspektrometereinstellungen
Parameter Wert
Ionspray voltage 5500 V
Nebulizing gas 40 psi
Turbo gas 35 psi
Interface Heater ein
Declustering potential 27 V
Entrance potential 10 V
Collision energy 15 V
Collision cell exit potential 11 V
Q1 resolution niedrig
Q3 resolution hoch
Deflector voltage 220 V
CEM 2200 V
Das verwendete HPLC-System ist im Anhang aufgeführt. Zur Trennung der
Zuckergemische wird eine 5 µm Amino-HPLC-Säule (2x100) mm eingesetzt. Als
mobile Phase wird Acetonitril/Wasser (72:28 v/v), dotiert mit 40 µM Cäsiumacetat,
verwendet. Der Fluss beträgt 0,2 mL/min. Die Auswertung erfolgt über die Peakflächen
der Chromatogramme. Zur Kalibration werden 10 mM Standardlösungen der Zucker
hergestellt. Daraus werden Volumina von 1,0 µL bis 7,2 µL entnommen und in
entsprechende HPLC-Vials überführt, mit 1000 µL mobiler Phase verdünnt und
anschließend mit 1 µL einer 20 mM Saccharose-Lösung dotiert. Von den
Verdünnungen werden anschließend 5 µL injiziert.
Ein typisches Chromatogramm für ein Zuckergemisch bestehend aus den Zuckern
Methyl- -D-mannopyranose, N-Acetyl-D-glucosamin und Saccharose ist in Abb. 44
dargestellt.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 78 -
Abb. 44: Beispielchromatogramm eines Zuckergemisches bestehend aus Methyl- -D-mannopyranose, N-Acetyl-D-glucosamin und Saccharose
Zuckermischungen bestehend aus Methyl- -D-mannopyranose und Methyl- -D-
glucopyranose können nicht verwendet werden, da keine vollständige Auftrennung
durch die verwendete Säule erreicht worden ist. Diese wäre jedoch im vorliegenden
Fall zwingend notwendig, da sich durch die Messung im MRM-Modus die Eingangs-
masse oder die Masse des Übergangs unterscheiden muss. Die Eingangsmasse
[Zucker+Cs]+ und die Masse des detektierten Übergangs [Zucker+133] 133 ist
jedoch für Methyl- -D-mannopyranose und Methyl- -D-glucopyranose gleich.
Da die Bildung des Zucker-Cs+-Komplexes eine Reaktion 2. Ordnung darstellt und
somit von der Saccharid- und Cs+-Konzentration abhängt, wird ein linearer Zusammen-
hang zwischen Analytkonzentration und Peakfläche der Chromatogramme nur in
einem engen Konzentrationsbereich der Analyten erwartet. Rogatsky et al. verwenden
zur Verbesserung der Linearität entsprechende isotopenmarkierte Zucker als internen
Standard [195, Seite 1808]. Da es sich im vorliegenden Fall nur um einfache
Mischungen handelt, wird auf isotopenmarkierte Standards verzichtet. Stattdessen
sollte zu Testzwecken Saccharose als interner Standard verwendet werden. Dieser
eluiert nach den beiden Monosacchariden (Abb. 44). In Abb. 45 ist beispielhaft die
Kalibrierung für Methyl- -D-mannopyranose ohne und unter Verwendung von
Saccharose als interner Standard dargestellt.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 79 -
Abb. 45: (A) Methyl- -D-mannopyranose-Kalibrierung ohne internen Standard. (B) Me-thyl- -D-mannopyranose-Kalibrierung mit internem Standard (Saccharose). Jede Verdün-nungsstufe ist zweimal injiziert worden. Auf der Abszissenachse ist die absolute inji-zierte Masse von Methyl- -D-mannopyranose angegeben. Unter Verwendung eines in-ternen Standards wird die Peakfläche von Methyl- -D-mannopyranose durch die Peak-fläche des internen Standards Saccharose dividiert.
Zu erkennen ist, dass unter Verwendung von Saccharose keine Verbesserung der
Linearität erfolgt. Als Konsequenz wird auf die Verwendung eines internen Standards
verzichtet. Die Ermittlung der Kalibrierfunktion erfolgt durch quadratische Regression
und ist in Abb. 45 angegeben.
In Abb. 46 sind die Ergebnisse der Adsorption von TBL1-, TBL2- und APS-Silica mit
Methyl- -D-mannopyranose, N-Acetylglucosamin, Methyl- -D-glucopyranose, 4-O- -
D-Galactopyronosyl-D-mannopyranose dargestellt. Dazu wird die Differenz zwischen
der Zuckerkonzentration der Standards und der Zuckerkonzentration im Überstand
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 80 -
nach Inkubation mit Adsorbens gebildet. Bezogen auf den Standard ergibt sich der
prozentual adsorbierte Zuckeranteil.
Abb. 46: Adsorption verschiedener Mono- und Disaccharide gelöst in Wasser oder DMF an TBL1-, TBL2- und APS-Silica. Die Zuckermischungen bestehen aus Methyl- -D-mannopyranose und N-Acetylglucosamin. (1) Methyl- -D-mannopyranose in Wasser, (2) Methyl- -D-mannopyranose in DMF, (3) Methyl- -D-mannopyranose-Gemisch in Was-ser, (4) Methyl- -D-mannopyranose-Gemisch in DMF, (5) N-Acetylglucosamin in Wasser, (6) N-Acetylglucosamin in DMF, (7) N-Acetylglucosamin-Gemisch in Wasser, (8) N-Acetyl-glucosamin-Gemisch in DMF, (9) 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose in Wasser, (10) 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose in DMF, (11) Methyl- -D-glucopyranose in Wasser, (12) Methyl- -D-glucopyranose in DMF.
Es ist zu erkennen, dass nur in wenigen Fällen eine signifikante Adsorption der Zucker
sowohl in Wasser als auch in dem nicht kompetitiven Lösungsmittel DMF stattgefunden
hat. Dagegen findet die Adsorption des Disaccharids 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-
mannopyranose in DMF an TBL1- und TBL2-Silica statt. Hier konnten 25 % des in der
Ausgangskonzentration enthaltenen Disaccharids an TBL1-Silica adsorbiert werden.
Im Fall von TBL2-Silica sind es noch 6 %. Unter diesen Bedingungen zeigt APS-Silica
kein Adsorptionsvermögen für 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Aus
Wasser konnte das Disaccharid dagegen nicht adsorbiert werden.
Von Methyl- -D-mannopyranose können nur marginale Mengen sowohl in DMF als
auch in Wasser adsorbiert werden. Ein ähnliches Verhalten zeigt N-Acetylglucosamin,
jedoch mit der Ausnahme, dass APS-Silica 23 % von N-Acetylglucosamin gelöst in
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 81 -
DMF adsorbiert. Methyl- -D-glucopyranose zeigt in beiden Lösungsmitteln an TBL1-
und TBL2-Silica keine Adsorption. Ein Batch-Versuch von Methyl- -D-glucopyranose
mit APS-Silica wurde nicht durchgeführt. Die Zuckermischungen, bestehend aus
Methyl- -D-mannopyranose und N-Acetylglucosamin, in DMF und Wasser bestätigen
die Ergebnisse der Einzelstoffversuche.
Das niedrige Adsorptionsverhalten für Monosaccharide in Wasser und DMF liegt
eventuell in der Multivalenz begründet. Lektine besitzen zu Monosacchariden eine
geringere Affinität als zu Oligosacchariden. Bindungstaschen von Lektinen sind in der
Lage, mit mehr als einer Monosaccharid-Einheit eines Oligosaccharids zu interagieren,
welches sich in einer höheren Affinität äußert [197, Seite 1015]. Oligosaccharide sind
größer als Monosaccharide, dadurch ergibt sich eine größere Kontaktfläche für die
Ausbildung hydrophober Effekte und es kann ein größeres Wasserstoffbrückennetz
ausgebildet werden.
Eine ähnliche Präferenz synthetischer, acyclischer Liganden gegenüber Disacchariden
in organischen Lösungsmitteln wurde durch Mazik et al. gefunden. Sie synthetisierten
mehrere Liganden und führten NMR- und Fluoreszenz-Titrationen in Chloroform durch.
Beispielsweise zu -Maltose, einem Disaccharid bestehend aus zwei Glucose-
monomere, konnte für einen der synthetisierten Liganden unter Annahme eines
1:1-Komplexes eine Dissoziationskonstante von 2,7·10-6 M bestimmt werden. Dagegen
war die Affinität des gleichen Liganden zu -D-Glucopyranose mit KD = 1,3·10-3 M
deutlich niedriger. Als Grund vermuten sie ein ähnliches multivalentes Bindungs-
verhalten, wie sie auch bei Protein-Kohlenhydrat-Komplexen auftreten. Aufgrund der
Größe des Disaccharids können sich mehr Wasserstoffbrücken bzw. CH- -Kontakte zu
dem Liganden ausbilden. Des Weiteren zeigten die Experimente und Molecular
Modeling Studien auch die Formation eines 2:1-Komplexes. Hier ist das Disaccharid
ähnlich wie in Abb. 25 zwischen zwei Liganden „eingeklemmt“, so dass sich von zwei
Seiten effektiv Wasserstoffbrücken bzw. CH- -Kontakte zum Kohlenhydrat ausbilden
[198, Seite 2068; 199, Seite 1564].
Das kann damit eine mögliche Erklärung für das Verhalten sein, das Disaccharid
bevorzugt zu adsorbieren. Zwei benachbarte TBL1- bzw. TBL2-Moleküle auf dem
Silica bilden mit einem 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose-Molekül einen
2:1-Komplex, der mit den Monosaccharidstrukturen nicht gebildet wird. Durch die
größere Anzahl von Bindungen wird die Affinität zum Disaccharid gesteigert.
2:1-Komplexe bei der Kohlenhydraterkennung in Wasser durch synthetische Liganden
werden ebenfalls von Mazik et al. beschrieben [200, Seite 2963].
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 82 -
4.7.3 Vergleichende SPR-Interaktionsstudien mit natürlichen Liganden
In den beiden vorangegangenen Abschnitten ist experimentell die Eignung von
Triazinliganden für Affinitätstrennverfahren untersucht worden. An dieser Stelle soll ein
Vergleich mit natürlichen Liganden stattfinden. Für die Experimente werden das Lektin
AAL und ein polyklonaler Antikörper gegen humanes Haptoglobin verwendet.
Beide Liganden werden mittels Amin-Coupling auf die Oberfläche des CM5-Chips
immobilisiert (Abschnitt 4.6.1). Hierfür wird von AAL eine 0,5 mg/mL und von dem
polyklonalen Antikörper eine 0,01 mg/mL Lösung in Acetatpuffer hergestellt und auf die
aktivierte Chipoberfläche injiziert. Nach der Immobilisierung beträgt die Oberflächen-
belegung für AAL 0,09 µmol/m2 und für den Antikörper 0,03 µmol/m2.
Abb. 47: Spezifische Desorption von TG durch Fucose. Nach dem Ende der Injektion einer 0,15 µM TG-Lösung bei einem Fluss von 10 µL/min (1) genügt zur vollständigen Desorption ein kurzer Impuls einer 100 mM Fucose-Lösung (2).
Abb. 47 zeigt, dass durch einen kurzen Fucose-Impuls (100 mM) das Glycoprotein TG
von der Chipoberfläche vollständig und spezifisch desorbiert werden kann. Für die
Haptoglobin-Desorption wird eine 10 mM Glycin-Lösung (pH 1,5) verwendet. Unter
diesen Bedingungen denaturieren die Bindungspartner, in Folge dessen sich die starke
Antigen-Antikörper-Bindung löst. Im Regenerationsschritt erfolgt die Renaturierung des
Antikörpers.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 83 -
Abb. 48: Bestimmung der Dissoziationskonstanten von AAL und TG (A und B) sowie zwischen dem polyklonalen Antikörper und Haptoglobin (C und D). In A und C der Abbildung sind die Sensorgramme der Konzentrationsreihen dargestellt. Die Konzentrationen von TG und Haptoglobin sind in µmol/L angegeben. Das Resonanz-signal im Gleichgewicht (grau hinterlegter Bereich in A und B) wird gegen die jeweilige Konzentration zum Erhalt der Adsorptionsisothermen aufgetragen (C und D). Experimentelle Bedingungen: Fluss 10 µL/min; Injektionsvolumen 110 µL; Kontaktzeit 660 s, Puffer HBS-EP.
Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten von AAL gegenüber TG und des
Antikörpers gegenüber Haptoglobin werden Sensorgramme bei verschiedenen
Konzentrationen aufgezeichnet und daraus die jeweiligen Adsorptionsisothermen
ermittelt (Abb. 48). Nach dem Klassifizierungssystem von Giles et al. können die
bestimmten Isothermen dem L2-Typ zugeordnet werden, wobei es sich um die
Langmuirische Adsorptionsisotherme handelt [201, Seite 3975]. Aus den SPR-Daten
berechnen sich die Dissoziationskonstanten wie folgt.
Im Gleichgewicht läuft die Adsorption und Desorption der Zielmoleküle gleich schnell
ab. Die Geschwindigkeitsgleichung für eine Interaktion zweier Bindungspartner (vgl.
Gleichung (1) in Abschnitt 2.4.2) lautet demnach.
]LA[k]L[]A[kdt
]LA[dda (13)
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 84 -
Hier ist [LA] die Konzentration des Ligand-Zielmolekül-Komplexes, [A] die
Konzentration des Analyten, [L] die Konzentration des Liganden auf der Chipoberfläche
und ka bzw. kd die Geschwindigkeitskonstante für die Hin- und Rückreaktion.
Die noch unbesetzten Liganden zu einem beliebigen Zeitpunkt berechnen sich zu
[L] = [L]0 - [LA], wobei [L]0 die Gesamtzahl der immobilisierten Liganden darstellt. Wird
dieser Ausdruck in die obere Gleichung eingesetzt, ergibt sich dann folgender
Zusammenhang.
]LA[k]LA[]L[]A[kdt
]LA[dd0a (14)
Aufgrund des großen Überschusses an Zielmolekülen, die kontinuierlich über die
Sensorchipoberfläche geführt werden, kann [A] als konstant betrachtet werden.
Zwischen dem Resonanzsignal R und [LA] besteht ein linearer Zusammenhang und
man kann für Gleichung 14 auch schreiben, wobei Rmax das Resonanzsignal bei
vollständiger Belegung der Liganden mit Analytmolekülen ist.
RkRR]A[kdt
dRdmaxa (15)
Im Gleichgewicht ist dR/dt = 0 und nach Umstellung ergibt sich daraus die
Dissoziationskonstante KD. In der Gleichung ist RGG das Resonanzsignal im
Gleichgewicht.
]A[R
R]A[
k
kK
GG
max
a
dD (16)
Nach RGG umgestellt ergibt sich folgende Gleichung.
D
maxGG K]A[
R]A[R (17)
Diese Gleichung entspricht der Langmuirischen Adsorptionsisotherme. Abb. 47B und D
zeigen die Auftragung von RGG gegen die injizierten Konzentrationen von TG und
Haptoglobin. Rmax und KD können durch nichtlineares Fitting oder durch Linearisierung,
z.B. durch Scatchard-Auftragung, von Gleichung 17 berechnet werden.
Dabei können Dissoziationskonstanten zwischen AAL und TG mit 2,9·10-7 mol/L und
zwischen dem polyklonalen Antikörper und Haptoglobin von 2,4·10-8 mol/L bestimmt
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 85 -
werden. Die ermittelten Dissoziationskonstanten liegen in einem Größenbereich, wie
man sie für Lektine und Antikörper erwartet [202, Seite 650]. Jedoch muss
einschränkend auf zwei Punkte hingewiesen werden. Die Konzentrationsreihen wurden
bei einer relativ niedrigen Flussgeschwindigkeit von 10 µL/min durchgeführt. Eine
niedrige Flussgeschwindigkeit kann dazu führen, dass der Massentransfer aus der
Lösung zu den Liganden der limitierende Schritt wird. Dadurch könnten zu niedrige
Konstanten bestimmt werden [203, Seite 169]. Zudem ist im grau hinterlegten Bereich
der Sensorgramme von Abb. 47A und C noch ein Anstieg zu verzeichnen, das
Gleichgewicht ist demnach noch nicht erreicht. Ursächlich hierfür kann der sehr hohe
Belegungsgrad der Liganden auf der Chipoberfläche sein, der dazu führt, dass in der
vorgegebenen Injektionszeit das Gleichgewicht nicht erreicht wird.
Für beide Liganden ist die Spezifität der Wechselwirkung mit einer BSA-Lösung
untersucht worden. Es konnte keine Interaktion zwischen AAL oder dem Antikörper
festgestellt werden.
In diesem Abschnitt konnte auf die hervorragende Affinität und Selektivität der Bindung
zwischen natürlichen Liganden und ihren jeweiligen Zielmolekülen hingewiesen werden.
Insbesondere die kompetitive Desorption, die zwischen TG und AAL möglich ist,
konnte zwischen den synthetischen Liganden und den verwendeten Modell-
glycoproteinen nicht realisiert werden.
4.8 Molecular Modeling und Docking Die Ergebnisse aus den Interaktionsstudien belegen die unspezifische Natur der
Wechselwirkung zwischen den Triazinliganden und den verwendeten Biomakro-
molekülen. Mit Hilfe von Molecular Modeling und Docking-Simulationen sollen Daten
zu Wechselwirkungsmechanismen erhalten werden, die experimentell so detailliert
nicht erhalten werden können. Zum einen soll die Stärke der Wechselwirkung
abgeschätzt werden, wobei in dieser Arbeit die geschätzte freie Bindungsenergie GB
berechnet wird. Zum anderen soll beurteilt werden, wie die Triazinliganden mit
Proteinen und Zuckern interagieren (Bindungsmodus). In Abschnitt 5 wird dann die
Entwicklung von Triazinliganden vorgestellt, die in der Schadstoffanalytik zur
Anwendung kommen sollen. Rechnergestützte Methoden werden hier verwendet, um
den Syntheseaufwand zu reduzieren. Nicht geeignete Strukturvorschläge werden im
Vorfeld bereits verworfen.
4.8.1 Grundzüge des Molecular Modeling und Docking Unter Molecular Modeling werden im Allgemeinen rechnergestützte Verfahren ver-
standen mit dem Ziel, das Verhalten (Struktur, Interaktionen, Wirkmechanismen) von
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 86 -
Molekülen oder Molekülsystemen zu simulieren [204, Seite 1]. Dabei wird in
Kraftfeldmethoden und quantenmechanische Verfahren unterschieden.
Kraftfeldmethoden sind empirische Verfahren, die auf der klassischen Newton-
Mechanik aufbauen. Atome eines Moleküls werden als „harte Kugeln“ aufgefasst [204,
Seite 184]. Die zwischen den Atomen eines Moleküls wirkenden kovalenten und nicht-
kovalenten Kräfte werden durch eine analytische Funktion mit anpassbaren
Parametern, dem Kraftfeld, beschrieben. Mit Hilfe von Kraftfeldrechnungen können
Energieminimierungen oder Konformationsanalysen (Berechnung von Struktur-
eigenschaften) durchgeführt werden. Sie können aber auch z.B. zur Berechnung von
Molekülspektren dienen [204, Seite 168]. Grundsätzlich ist jedoch festzuhalten, dass
kraftfeldbasierte Methoden für große Systeme, z.B. Proteine, aufgrund des geringeren
Rechenaufwandes angewendet werden.
Nachteil der kraftfeldbasierten Methoden ist der Ansatz der klassischen Mechanik.
Eigenschaften oder Vorgänge, die aufgrund der Elektronenverteilung im Molekül
zustande kommen (Bindungsbrüche, delokalisierte Bindungen), können nicht
berechnet werden. Hierzu müssen quantenmechanische Rechenverfahren
herangezogen werden. Mit diesen Verfahren wird versucht mit Hilfe der Schrödinger-
Gleichung die elektronische Struktur von Molekülen zu generieren. Die mathematisch
geschlossene Lösung ist nur für einfache Fälle, wie z.B. beim Wasserstoffatom,
möglich [205, Seite 229-231]. Daher ist man bei Molekülen zur Lösung auf Nährungen
angewiesen. Hierzu zählen semiempirische Methoden, die Dichtefunktionaltheorie und
ab initio-Methoden, wobei der Rechenaufwand und die Genauigkeit in der genannten
Reihenfolge zunehmen.
Die vorangegangenen Methoden sind auch Bestandteil des Dockings. Dabei handelt
es sich um eine Methode, bei der versucht wird, die bevorzugte Orientierung zwischen
einem Ligand und einem Zielmolekül zu berechnen. Über Scoring-Funktionen erfolgt
die Berechnung der geschätzten freien Bindungsenergie GB [205, Seite 310-313].
4.8.2 Durchführung der Simulationen Durchgeführt wurden die Berechnungen in der Arbeitsgruppe von Prof. Niemeyer an
der Helmut-Schmidt-Universität Hamburg. Die im Folgenden angegebene Durch-
führung wird nur in Ihren Grundzügen beschrieben.
Die Generierung der Ligandenmodelle erfolgt mit der Software ChemBio3D Ultra 11.0
[206, Seite 4612]. Um den experimentellen Verhältnissen möglichst nahe zu kommen,
bestehen Ligandenmodelle aus den eigentlichen Triazinliganden und einem kurzen
Ausschnitt des jeweiligen Trägermaterials. Diese Startstrukturen werden um alle
fehlenden Wasserstoffatome ergänzt [207, Seite 320]. Zur Geometrieoptimierung wird
das Kraftfeld MMFF94 (algorithm steepest descent) verwendet [208, Seite 209]. Eine
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 87 -
weitere Optimierung der Molekülstruktur erfolgt mit der semiempirischen PM3-Methode
(MOPAC). Mit Hilfe dieser quantenmechanischen Berechnungen kann die Genauigkeit
der Endergebnisse erhöht werden [209, Seite 1]. Die optimierten Startstrukturen
werden im PDB-Format gespeichert und in AutoDock 4.0 importiert. Das Docking-
Programm berechnet die GB-Werte. [210, Seite 293; 211, Seite 1639]. Stellen kleine
Moleküle die Zielmoleküle (Saccharide oder Schadstoffe vgl. Abschnitt 5) dar, werden
auch sie in entsprechender Weise für das Docking vorbereitet. Im Gegensatz dazu
werden die 3D-Strukturen von Proteinen von der Protein Data Base bezogen und
optimiert. Docking-Studien mit GOD wurden zum einen mit GOD aus A. niger (PDB-
Datei 1CF3) und zum anderen mit GOD aus P. amagasakiense (PDB-Datei 1GPE)
durchgeführt [212, Seite 971], da nur von dem Enzym aus P. amagasakiense die
dimere Struktur vorlag. Eine Einschränkung bei den PDB-Dateien muss jedoch in
Betracht gezogen werden. In beiden Fällen wurde im Vorfeld der Kristallisation und
röntgenkristallographischen Studien GOD partiell deglycosyliert. Dabei wurden etwa
95 % des Kohlenhydratanteils von GOD entfernt [213, Seite 208]. Korrekturen an den
Aminosäuren (z.B. Korrektur Bindungsordnung, Bindungswinkel) werden mit dem
SwissPDB-Viewer 4.0.1 durchgeführt. Fehlende Wasserstoffatome werden in chemisch
korrekter Weise ergänzt, um mögliche Ausbildungen von Wasserstoffbrücken-
bindungen zu modellieren. Weiterhin sind alle Torsionen frei rotierbar, was die
Genauigkeit der Berechnungen erhöht. Dadurch soll auch eine größtmögliche Anzahl
an Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Liganden und Zielmolekülen erreicht
werden. Die Parameter für die paarweise berechneten atomaren Interaktionen folgen
dem Lennard-Jones-Modell [214, Seite 301; 215, Seite 215; 216, Seite 1518] Als
Suchalgorithmus für das Docking wird der Lamarckian-genetic-Algorithmus mit
folgenden Parametern verwendet, die in Tabelle 7 aufgeführt sind [211, Seite 1639].
Tabelle 7: Lamarckian-genetic-Algorithmus Parameter
Parameter Wert
Number of docking runs (conformations) 50
Population size 150
Max. number of generation per individual 2,5·107
Number of generations for picking worst individual 10
Max. number of top individuals that automatically survive 1,0
Grid map setting points and spacing 126·126·126; 0,900 Å
Rate of gene mutation 0,02
Rate of crossover 0,8
Variance of cauchy distribution for gene mutation 1,0
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 88 -
4.8.3 Ergebnisse der Simulationen Bei der Modellerstellung wurde das jeweilige Trägermaterial berücksichtigt, welches
bei den Interaktionsstudien angewendet wurde.
Um SPR-Ergebnisse mit den Docking-Ergebnissen vergleichen zu können, wird ein
Dextranmodell konstruiert, auf dem die Liganden entsprechend den realen
Verhältnissen immobilisiert sind. Dabei wird von einer Carboxygruppe pro Glucose-
monomer ausgegangen [177, Seite 1527]. Nicht von Liganden besetzte Carboxy-
gruppen sind im Modell mit Ethanolamin geblockt worden. Es wurden Modelle mit
hoher und niedriger Ligandendichte konstruiert, da bei den SPR-Studien ebenfalls
Sensorchips mit unterschiedlicher Ligandendichte hergestellt worden sind (Abb. 49).
Für ergänzende Modeling-Studien zu den Adsorptionsexperimenten mit TBL1- und
TBL2-Silica wird ein Silicamodell verwendet, welches in der Arbeitsgruppe von
Prof. Niemeyer an der Helmut-Schmidt-Universität Hamburg entwickelt wurde. Wie bei
dem Dextranmodell werden die Liganden auf dem Silicamodell entsprechend den
experimentellen Verhältnissen immobilisiert.
Abb. 49: Strukturformeln der Ligandenmodelle am Beispiel von NH2-TBL2 mit hoher (A), mittlerer (B) und geringer Ligandendichte (C). Orange hinterlegt ist die Dextranmatrix. Um die Berechnungszeit zu verringern, ist bei hohen und mittleren Ligandendichten auf einen größeren Ausschnitt der Dextranmatrix verzichtet worden.
4.8.3.1 Stärke der Wechselwirkung - Bindungsenergien Von den 50 verschiedenen Konformationen, die AutoDock innerhalb eines Docking-
Laufs berechnet, wird jeweils die niedrigste freie Bindungsenergie GB als Maß zur
Abschätzung der Affinität gewählt. Je kleiner die GB-Werte desto größer ist die Stärke
der Interaktion.
Neben GOD aus P. amagasakiense und A. niger werden drei Saccharide für die Unter-
suchung herangezogen. Methyl- -D-mannopyranose wird von Palanisamy et al. und
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 89 -
Gupta et al. als das Monosaccharid mit der höchsten Affinität zu den Triazinliganden
beschrieben [140, Seite 233; 142, Seite 280]. Das Trimannosid -Man(1 6) -
Man(3 1) -Man ist ein wichtiges Strukturelement (Trimannosylkern) von Glyco-
proteinen [9, Seite 522] und 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose konnte in
den Batch-Experimenten gut von TBL1-Silica adsorbiert werden.
In Tabelle 8 sind die GB-Werte bei Verwendung des Dextran-Modells, in Tabelle 9 die
Werte bei Verwendung des Silica-Modells dargestellt. Nur geringe Unterschiede
zwischen den GB-Werten der Saccharide und GOD bei Verwendung der
Dextranmodelle hoher und mittlerer Ligandendichte können festgestellt werden. Kein
einheitliches Bild ergibt sich, wenn das Modell niedriger Ligandendichte angewendet
wird. Für Methyl- -D-mannopyranose steigen die Werte, insbesondere bei NH2-TBL1,
auf ca. 10 kcal/mol an, was eine schwächere Bindung impliziert, wenn die Oberfläche
nur von wenigen Liganden belegt ist. Dagegen kann für GOD aus A. niger der niedrige
GB-Wert auch bei niedriger Ligandendichte berechnet werden.
Die Bindungsenergien bei Verwendung des Silicamodells liegen höher als bei
Verwendung des Dextranmodells, mit der Ausnahme von GOD aus A. niger bei
Verwendung des TBL2-Silica-Modells. GB konnte zu -8,16 kcal/mol berechnet werden.
Dagegen beträgt der Wert bei TBL2-Silica -0,16 kcal/mol. Diese Ergebnisse korrelieren
gut mit den Batch-Versuchen von TBL1- und TBL2-Silica mit GOD (vgl. Abschnitt
4.7.2.1). Die Bindungsenergien von 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose sind
in etwa genau so groß wie die von Methyl- -D-mannopyranose. Aus den
Dockingstudien kann eine Präferenz für das Disaccharid, die sich aus den
experimentellen Untersuchungen ergibt, nicht belegt werden (vgl. Abschnitt 4.7.2.2).
Tabelle 8: Ergebnisse der Docking-Simulationen bei Verwendung des Dextranmodells.
GB (kcal/mol)
Substrat NH2-TBL1
(hoch) NH2-TBL1
(mittel) NH2-TBL1 (niedrig)
NH2-TBL2 (hoch)
NH2-TBL2 (mittel)
NH2-TBL2 (niedrig)
GOD aus P. amagasakiense -2,79 -2,60 n.d. -5,96 -3,58 n.d.
GOD aus A. niger +2,37 +0,77 -1,07 -5,69 -2,34 -4,19
-Man(1 6) -Man(3 1) -Man (Trimannosylkern)
-4,32 -4,86 n.d. -4,73 -5,32 n.d.
4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose
-5,24 -4,09 n.d. -4,34 -4,98 n.d.
Methyl- -D-mannopyranose -4,86 -4,27 +9,17 -6,24 -5,21 -1,87
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 90 -
Tabelle 9: Ergebnisse der Docking-Simulationen bei Verwendung des Silicamodells.
GB (kcal/mol) Substrat
TBL1-Silica-Modell TBL2-Silica-Modell
GOD aus A. niger -0,38 -8,16
Methyl- -D-mannopyranose -1,24 -2,42
4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose -1,37 -2,70
Die erhaltenden GB-Werte bewegen sich in den Größenordnungen zu bekannten
Literaturwerten aus Docking-Studien mittels AutoDock zwischen Lektinen und
Sacchariden. Für synthetische Liganden existieren bisher keine Werte unter
Verwendung von AutoDock. Beispielsweise berechneten Neumann et al. zwischen
WGA und N-Acetylglucosamin einen GB-Wert von -3,81 kcal/mol und für ein
Disaccharid bestehend aus zwei N-Acetylglucosamin-Molekülen einen Wert
von -4,66 kcal/mol [216, Seite 1523]. Adam et al. untersuchten die Interaktion des
fucosespezifischen Lektins PA-IIL aus P. aeruginosa mit verschiedenen
Monosacchariden. Mit -L-Fucopyranose konnte GB zu -9,33 kcal/mol und zwischen
Methyl- -L-Fucopyranose zu -10,70 kcal/mol berechnet werden [217, Seite 2240].
Weitere Beispiele finden sich bei Nurisso et al. [218, Seite 474-477].
Aus den GB-Werten kann nicht ohne weiteres auf eine Glycospezifität der Liganden
geschlossen werden. Dazu muss die Orientierung der Bindungspartner zueinander
(Bindungsmodus) genauer untersucht werden (vgl. Abschnitt 4.8.3.2 und 4.8.3.3).
4.8.3.2 Bindungsmodus der Saccharide Die Untersuchung des Bindungsmodus der Saccharide wird exemplarisch am Beispiel
von Methyl- -D-mannopyranose unter Verwendung der Dextranmodelle vorgestellt.
In Abb. 50 sind die Konformationen zu den niedrigsten freien Bindungsenergien GB
zwischen den Dextranmodellen und Methyl- -D-mannopyranose dargestellt. Durch das
Programm AutoDock werden intermolekulare Wechselwirkungen zum einen als
Wasserstoffbrückenbindungen und zum anderen als sogenannte close contacts
ausgegeben. Dabei sind in Abb. 50 close contacts als sphärisches Drahtmodell
dargestellt. Auftretende Wasserstoffbrücken dagegen erscheinen als grün gepunktete
Linie zwischen den Atomen. Unter close contacts fasst AutoDock die übrigen
intermolekularen Wechselwirkungen zusammen, die keine Wasserstoffbrücken-
bindungen sind. Da AutoDock Interaktionen zwischen einzelnen Atomen von Liganden
und Zielmolekülen paarweise berechnet, werden die für die Kohlenhydratbindung
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 91 -
wichtigen OH- - und CH- -Wasserstoffbrücken ebenfalls in close contacts eingeordnet
[219, Seite 11416].
Abb. 50: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL2 (Dextranmodell) mit Methyl- -D-mannopyranose. Die Struktur des Zuckers ist gelb hinterlegt. In (A) ist NH2-TBL2 (hoch), in (B) NH2-TBL2 (mittel) und in (C) NH2-TBL2 (niedrig) abgebildet. In (D) ist die Orientierung einer CH- -Wasserstoffbrücke zwischen NH2-TBL2 (mittel) und Methyl- -D-mannopyranose dargestellt. Farbliche Zuordnung der Atome: Kohlenstoff grau; Wasserstoff hellgrau; Sauerstoff rot; Stickstoff blau. Wasser-stoffbrücken zwischen zwei Atomen sind als grün gepunktete Linie dargestellt.
Aus Abb. 50A geht hervor, dass sich bei hoher Ligandendichte ausschließlich close
contacts zwischen Methyl- -D-mannopyranose und NH2-TBL2 ausprägen, wobei in
dieser Konformation auch Wechselwirkungen mit der Dextranmatrix ausgebildet
werden.
Dagegen zeigt Abb. 50B die Ausbildung einer Wasserstoffbrücke zwischen einer
sekundären Aminogruppe des Liganden und dem Sauerstoffatom im Ring der Methyl-
-D-mannopyranose. Ebenfalls bilden sich eine Vielzahl von close contacts aus. Aus
der Lage der 5-Aminoindansubstituenten zum Zucker können einige close contacts
möglichen CH- -Wasserstoffbrücken zugeordnet werden, was anhand von Abb. 50D
erläutert werden soll. Hier ist Methyl- -D-mannopyranose in Wechselwirkung mit NH2-
TBL2 mittlerer Ligandendichte dargestellt. Zwischen dem Zentrum des aromatischen
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 92 -
Rings und dem Wasserstoffatom beträgt die Distanz 2,69 Å. Der Winkel der hierbei
entsteht, beträgt 137°.
Aus der Literatur sind vergleichbare CH- -Bindungslängen zwischen Lektinen und
Kohlhydraten bekannt [220, Seite 200]. Takahashi et al. führten zudem
Untersuchungen zwischen sechsgliedrigen aromatischen Ringsystemen als Protonen-
akzeptoren und verschiedenen organischen Protonendonatoren durch. Dabei konnte
festgestellt werden, dass sich die Bindungswinkel zwischen 150° und 170° bewegen.
Weiterhin konnte eine Korrelation zwischen Bindungslänge und -winkel zur Stärke der
ausgebildeten Wasserstoffbrücken beobachtet werden. Je größer die Bindungsstärke,
desto kleiner die Bindungslänge und der Bindungswinkel geht gegen 180° [221, Seite
2424]. Aufgrund des geringen Bindungswinkels kann daher von einer schwachen CH-
-Wechselwirkung zwischen Methyl- -D-mannopyranose und NH2-TBL2 bei mittlerer
Ligandendichte auf dem Dextranmodell ausgegangen werden.
Abb. 50C zeigt NH2-TBL2 bei niedriger Ligandendichte. Hier wird die Ausbildung
zweier Wasserstoffbrücken deutlich, jedoch ausschließlich zwischen der Dextranmatrix
und Methyl- -D-mannopyranose. GB fällt deutlich niedriger als bei hoher bzw.
mittlerer Ligandendichte aus.
Unter Verwendung des Dextranmodells von NH2-TBL1 konnten ausschließlich close
contacts berechnet werden. Dabei steht hauptsächlich die Dextranmatrix mit Methyl- -
D-mannopyranose in Wechselwirkung, wie Abb. 51 zeigt.
Abb. 51: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten G-Werten von NH2-TBL1 mit Methyl- -D-mannopyranose, dessen Struktur gelb hinterlegt ist. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL1 niedrig (C).
Palanisamy et al. beschreiben das Auftreten von Wasserstoffbrücken zwischen TBL2
und Methyl- -D-mannopyranose. Dabei werden, im Gegensatz zu NH2-TBL2 bei
mittlerer Ligandenkonzentration, vier Wasserstoffbrücken zwischen den drei
Stickstoffatomen eines TBL2-Moleküls und den Hydroxylgruppen eines Methyl- -D-
mannose-Moleküls ausgebildet. Ein zweites TBL2-Molekül soll die Entstehung von CH-
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 93 -
-Interaktionen bewirken, die zwischen der Methylgruppe eines Methyl- -D-manno-
pyranose-Moleküls bewirken [142, Seite 280].
Ebenso beschreiben Gupta et al. für TBL1 das Auftreten von Wasserstoffbrücken
zwischen Ligand- und Zuckermolekül. In 1H-NMR-Titrationsexperimenten konnten sie
eine Veränderung der chemischen Verschiebung von Hydroxylgruppen-Protonen der
Zucker bei Zugabe von TBL1 beobachten. Daraus schlossen sie auf eine Beteiligung
der Hydroxylgruppen an Wasserstoffbrückenbindungen. Des Weiteren stützten sie die
experimentellen Befunde durch Molecular Modeling Studien. Hierbei konnte die
Ausbildung von zwei Wasserstoffbrücken zwischen TBL1 und Mannose sowie Glucose
beobachtet werden. Ferner vermuten sie eine derartige Konformation zwischen TBL1
und Mannose, bei der die Benzylreste so angeordnet sind, dass sie eine Kavität
ähnlich der „tempelartigen“ Struktur Abb. 25A bilden. Auf diese Weise soll es zu
weiteren, den Bindungskomplex stabilisierenden Interaktionen kommen [140, Seite
232].
In eigenen Dockingstudien konnte eine klare glycospezifische Interaktion zwischen den
TBL-Liganden und Methyl- -D-mannopyranose nicht bestimmt werden. Dockingstudien
mit den zwei anderen Sacchariden unter Verwendung des Dextranmodells sowie die
Verwendung des Silicamodells belegten ebenfalls keine eindeutige glycospezifische
Interaktion. Die Abbildungen hierzu befinden sich im Anhang (Abb. 80, Abb. 81,
Abb. 82 und Abb. 83).
4.8.3.3 Bindungsmodus von Glucose Oxidase Die Darstellungen zu den Orientierungen der Dextranmodelle zu GOD aus A. niger
befinden sich im Anhang unter Abb. 84 und Abb. 85. Zu erkennen ist, dass zwischen
den verwendeten Ligandmodellen keine glycospezifische Interaktion stattfindet. Close
contacts und vereinzelt auch Wasserstoffbrücken entstehen vornehmlich zu
Aminosäuren. Im Fall von NH2-TBL1 steht hierbei hauptsächlich die Dextranmatrix in
Kontakt mit den Aminosäuren Glutamin, Valin, Asparagin, Prolin, Glycin, Threonin und
Lysin. Bei NH2-TBL2 ist es Alanin, Asparagin, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Tyrosin,
Leucin und Lysin. Auch die Bindungsregion von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 an die
Untereinheit von GOD aus A. niger zwischen den einzelnen Ligandendichten ist
unterschiedlich. Das gleiche Bild ergibt sich für die Verwendung der Silica-Modelle,
wenn diese mit GOD aus A. niger gedockt werden (vgl. Abb. 86).
Erstaunlicherweise tritt bei der Verwendung von GOD aus P. amagasakiense ein
gegenteiliger Effekt auf (vgl. Abb. 87 im Anhang). Bei diesen Berechnungen steht
NH2-TBL1 und NH2-TBL2 sowohl bei hoher als auch bei mittlerer Ligandendichte über
close contacts mit dem aus fünf Monosacchariden bestehenden Glycan
[Man( 1 2)Man( 1 3)Man( 1 4)GlcNAc( 1 4)GlcNAc( 1) Asn] in Kontakt. Di-
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 94 -
rekte Wasserstoffbrücken zwischen den Liganden und dem Glycan konnten nicht
berechnet werden. Eine ähnliche Beobachtung kann auch für NH2-TBL2 gemacht
werden, wobei sich in diesem Fall auch verschiedene Aminosäuren von GOD in
Wechselwirkung mit dem Liganden befinden. Aus der Orientierung der beteiligten
Bindungspartner zueinander kann eine glycospezifische Interaktion ausgeschlossen
werden.
Die Sequenzhomologie von GOD aus P. amagasakiense zu GOD aus A. niger beträgt
81 %. Das Glycan von GOD aus P. amagasakiense, an dem die Wechselwirkung mit
NH2-TBL1 und NH2-TBL2 stattfindet, ist in beiden Enzymen chemisch identisch [222,
Seite 95]. Der Grund für die unterschiedlichen berechneten Interaktionen ist vermutlich
darin zu suchen, dass im röntgenkristallografischen Datensatz GOD aus
P. amagasakiense als Dimer und GOD aus A. niger als Monomer vorliegt. Damit sind
Interaktionen mit Aminosäuren möglich, die sonst nicht an der Oberfläche liegen
würden, sondern die Kontaktflächen zu den einzelnen Monomeren bilden.
4.9 Rückschlüsse In diesem Abschnitt wurde die Eignung zweier bekannter Triazinliganden für ihren
Einsatz in der Affinitätsseparation zur Anreicherung von Glycoproteinen untersucht. Im
Vergleich zu anderen synthetischen Kohlenhydratliganden zeichnen sich TBL1 und
TBL2 durch eine schnelle zwei- bzw. dreistufige Synthese aus. Die Einführung einer
primären Aminogruppe durch Umsetzung von TBL1 und TBL2 mit Ethylendiamin zu
NH2-TBL1 sowie NH2-TBL2 eröffnet die Möglichkeit, triazinbasierte Liganden auf
Sensorchips für SPR-Messungen zu immobilisieren. Im Gegensatz zu weiteren
Immobilisierungsmöglichkeiten kleiner Moleküle auf Sensorchips ergeben sich dadurch
zwei Vorteile. Zum einen können die Standardprotokolle und Standardreagenzien der
Hersteller verwendet werden. Zum anderen findet die Immobilisierung unter milden
Reaktionsbedingungen innerhalb des Biacore 3000 statt. Dadurch kann die
Ligandendichte auf der Sensorchipoberfläche sehr gut gesteuert werden. Die
Immobilisierung von TBL1 und TBL2 auf Silica konnte erfolgreich durchgeführt werden
und wird durch die Elementaranalyse bestätigt. Gestützt werden die Ergebnisse durch
einen neu entwickelten massenspektrometrischen Nachweis oberflächengebundener
Triazine.
Die Untersuchung des Adsorptionsverhaltens zu Mono- und Disacchariden in Wasser
und DMF zeigte, dass ausschließlich in dem organischen Lösungsmittel eine
Adsorption des Disaccharides durch TBL1 stattfindet. Dieses Ergebnis deckt sich mit
den Bindungseigenschaften synthetischer Liganden, die in der Literatur beschrieben
sind. In weniger stark kompetitiven Lösungsmitteln wie DMF, DMSO oder Chloroform
weisen sie deutlich höhere Affinitäten zu Kohlenhydraten als in Wasser auf.
Triazinliganden für die adsorptive Wertstoffabtrennung - 95 -
Mit zwei verschiedenen Methoden wurde das Adsorptionsverhalten beider Liganden zu
größeren Molekülen (den Glycoproteinen) untersucht. Die SPR-Ergebnisse zeigen,
dass keine spezifische Adsorption zu den verwendeten Glycoproteinen GOD und TG
stattfindet. Ähnliche Ergebnisse konnten durch die Batchexperimente erhalten werden.
Zwar findet eine Adsorption von GOD statt, die jedoch nicht für Trennprozesse aus
komplexen Gemischen ausgenutzt werden kann, da nicht-glycosyliertes BSA ebenso
eine Anbindung aufweist.
Durch Anwendung computergestützter Methoden konnte die nicht-glycospezifische
Interaktion bestätigt werden.
Der in diesem Abschnitt gezogene Vergleich zu Lektinen und Antikörpern zeigt die
noch vorhandene Überlegenheit natürlicher Liganden. Die Interaktion zwischen
Lektinen und Glycokonjugaten ist ein derart komplexer Vorgang, der durch strukturell
einfache triazinbasierte Liganden nicht nachgeahmt werden kann. Die Anwendung der
Liganden in organischen Lösungsmitteln ist jedoch vielversprechend, da man gerade
die Liganden wegen ihrer Stabilität gegenüber den Lösungsmitteln einsetzten möchte.
Wenn sich die Affinität zu den gewünschten Molekülen in solchen Lösungsmitteln noch
erhöht, wäre das ein zusätzlicher Nutzen. Zu untersuchen bleibt die Anwendung auf
natürliche Vielstoffgemische.
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 96 -
5 Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung und als Erkennungselemente chemischer Sensoren
Moderne instrumentell-analytische Verfahren sind hinsichtlich der Nachweisgrenze,
des Probendurchsatzes und anderer Kenndaten sehr leistungsfähig [223, Seite 4742-
4744]. War man vor ca. 50 Jahren in der Lage im parts per million-Bereich (ppm) zu
messen, liegen moderne Verfahren im parts per billion- (ppb) bzw. parts per trillion-
Bereich (ppt) oder darunter. Gas- oder Flüssigchromatographie mit nachfolgender
massenspektrometrischer Detektion werden im Allgemeinen zur Bestimmung von
Schadstoffen in Oberflächengewässern angewendet [224, Seite 31].
Nachteilig wirkt sich jedoch die Probennahme für diese laborgebundenen Verfahren
aus, insbesondere an unzugänglichen Orten. Beispielsweise können auf offener See
nur wenige Kampagnen im Jahr durchgeführt werden, wodurch die gewonnenen Daten
über Schadstoffkonzentrationen gering zeitaufgelöst sind [225, Seite 178]. Des
Weiteren müssen Proben in hinreichend großen Volumina gezogen werden, da die
Konzentration vieler Schadstoffe im Spurenbereich liegt [226, Seite 846]. Die nach-
folgende Dateninterpretation, z.B. die Modellierung der Verfrachtung von Schadstoffen,
Aussagen zu Veränderungen im Ökosystem, ist unter Umständen nicht möglich oder
gestaltet sich schwieriger [227, Seite 482]. Hier sind Verfahren wünschenswert, die
in situ automatisiert Schadstoffe in Oberflächengewässern, insbesondere im Meer-
wasser, im Spurenbereich erfassen.
Im ersten Teil dieses Abschnitts wird die Entwicklung und Charakterisierung von
Triazinliganden vorgestellt, die selektiv mit ausgewählten Schadstoffen interagieren
können. Mit Hilfe der Triazinliganden sollen zum einen Adsorbentien für
Anreicherungsverfahren von Schadstoffen hergestellt werden. Zum anderen sollen
Triazinliganden die Rezeptorfunktion chemischer Sensoren übernehmen. Dazu
müssen die Liganden auf der Oberfläche eines Sensors immobilisiert werden. Dies
kann u.a. durch Self Assembled Monolayer (SAM) geschehen. Im zweiten Teil dieses
Abschnitts wird ein Verfahren zur Herstellung von SAMs auf Goldoberflächen etabliert.
Als Sensormessprinzip wird hier die SPR eingesetzt.
5.1 Schadstoffauswahl Die Schadstoffe entstammen der Benzotriazolklasse. Aus dieser wurden 1H-Benzo-
triazol (BT), 4-Methyl-1H-benzotriazol (4-MeBT) und 5-Methyl-1H-benzotriazol (5-
MeBT) als Modellverbindungen ausgewählt (Abb. 52).
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 97 -
Abb. 52: Strukturformeln der verwendeten Benzotriazole.
1H-Benzotriazol und seine Derivate kommen bei einer Reihe von Anwendungen zum
Tragen. Sie werden als antikorrosiv wirkende Zusätze in Kühl- und Hydraulikflüssig-
keiten, in Gefrierschutzmitteln, in Enteisungsmitteln für Flugzeuge und als Silberschutz-
mittel in Spülmaschinenreinigern verwendet. Benzotriazole sind durch eine hohe
Wasserlöslichkeit gekennzeichnet und weisen einen niedrigen log KOW-Wert
(Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizient) auf. Jedoch sind sie schlecht biologisch ab-
baubar und toxisch für aquatische Organismen [228, Seite 1002; 229, Seite 559-560].
Daher lassen sich erhöhte Konzentrationen im Ablauf von Kläranlagen aber auch in
Flüssen und Seen nachweisen. Häufig findet man Konzentrationsspitzen in Gewässern,
die sich in der Nähe von Flughäfen befinden [230, Seite 7189]. Tabelle 10 gibt einen
Überblick zu den Konzentrationen ausgewählter Benzotriazole in der Umwelt.
Tabelle 10: Konzentrationen ausgewählter Benzotriazole in verschiedenen Gewässern und Abwässern.
Ort (Gewässer/ Abwasser) BT (µg/L) 4-MeBT (µg/L) 5-MeBT (µg/L) Literatur
Weil am Rhein (Rhein) 0,34 - 0,11 [230, Seite 7189]
Oberglatt, Schweiz (Glatt, Flughafennähe) 2,54 0,47 [230, Seite 7189]
Hamburg Blankenese (Elbe) 0,48 0,45 0,13 [231, Seite 600]
Berlin (Abwasser vor Abwasserbehandlung) 12 1 2 [232, Seite 7195]
Berlin (Abwasser vor Abwasserbehandlung) 8 1 2 [232, Seite 7195]
5.2 Chemische Sensoren Wolfbeis definiert chemische Sensoren als kleine Anordnungen die ein Erkennungs-
element, einen Transduktor und einen Signalprozessor enthalten und geeignet sind,
kontinuierlich und reversibel eine chemische Konzentration anzuzeigen [233, Seite
522]. Das hier genannte Erkennungselement entspricht der Rezeptorfunktion. Die
Triazinliganden sollen auf geeigneten Sensoroberflächen immobilisiert werden und
selektiv mit den ausgewählten Benzotriazolen interagieren. Tritt eine Wechselwirkung
zwischen Rezeptorfunktion und Schadstoff auf, ändern sich bestimmte physikalische
Eigenschaften an der Sensoroberfläche (z.B. Massenänderung, Leitfähigkeits-
änderung). Die Stärke dieser Änderung wird vom Transduktor interpretiert und in ein
elektrisches Signal umgewandelt, das vom Signalprozessor verarbeitet wird (Abb. 53B)
[234; Seite 9].
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 98 -
5.3 Anreicherungsverfahren Durch Anreicherungsverfahren sollen Benzotriazole aus Meerwasser mit Hilfe der
selektiv wirkenden Adsorbentien aufkonzentriert werden. Dagegen sollen Begleitstoffe
das Adsorbens passieren. Durch geeignete Bedingungen erfolgt die Desorption der
Benzotriazole vom Adsorbens. Die im Desorbat enthaltene Analytkonzentration ist
hinreichend für die Detektion. Nach Regeneration steht das Adsorbens für eine erneute
Schadstoffaufkonzentrierung zur Verfügung (Abb. 53A).
Eine Herausforderung bei der Entwicklung eines chemischen Sensors bzw. eines
Anreicherungsverfahrens für in situ-Messungen sind die Konzentrationen der
Schadstoffe in Oberflächengewässern. Diese liegen im ppb- und ppt-Bereich, bzw.
darunter (Abb. 53C und D).
Abb. 53: Schematische Darstellung der Messverfahren sowie Verdeutlichung der Heraus-forderung bei Messungen im Spurenbereich. (A) Schematische Darstellung eines Anreicherungsverfahrens. (B) Schematische Darstellung eines chemischen Sensors. (C) Bei Messungen im Spurenbereich mittels chemischer Sensoren muss KD hinreichend klein sein, damit das Gleichgewicht weit auf der Seite des Ligand-Schadstoff-Komplexes (LM) liegt. (D) Des Weiteren steigt der Messfehler, hier verdeutlicht durch die Horwitzfunktion [235, Seite 68A], je geringer die Konzentration des Analyten ist.
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 99 -
Diese niedrigen Schadstoffkonzentrationen können durch chemische Sensoren bisher
nur unter Zuhilfenahme von Antikörpern als Liganden gegen die zu messenden
Schadstoffe detektiert werden. Diese weisen die benötigte hinreichend kleine
Dissoziationskonstante auf. Wird die SPR als Sensormessprinzip gewählt, können
Schadstoffkonzentrationen im ppm- und ppb-Bereich gemessen werden.
Beispielsweise immobilisierten Hegnerová et al. auf einem SAM aus Alkylthiolen ein
Bisphenol A-BSA-Konjugat. Eine feste Konzentration eines polyklonalen anti-
Bisphenol A-Antikörpers wird mit der zu untersuchenden Wasserprobe gemischt und in
das SPR-Gerät injiziert. Nicht reagierter Antikörper bindet an das immobilisierte
Bisphenol A-BSA-Konjugat, was als Anstieg des Resonanzsignals erfasst wird.
Bisphenol A kann dabei bis zu einer Konzentration von 0,14 ng/mL (ppm-Bereich) in
Abwasserproben bestimmt werden [236, Seite 1966]. Zuvor gingen Soh et al. ähnlich
vor. Sie immobilisierten Bisphenol A jedoch direkt auf dem SAM [237, Seite 426].
Atrazin ist ebenfalls nach der genannten Methodik in Flusswasserproben bestimmt
worden. Farre et al. nutzten ein portables SPR-Gerät, wobei noch 20 pg/mL (ppb-
Bereich) detektiert werden konnten [238, Seite 212]. Weitere Beispiele zur Bestimmung
von 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure und 2,4,6-Trinitrotoluol finden sich bei
Larsson et al. und Kim et al. [239, Seite 746; 240, Seite 1132].
Der Nachteil dieser Verfahren ist, dass Antikörper kostspielig hergestellt werden
müssen. Des Weiteren besitzen sie die Nachteile natürlicher proteinogener Liganden,
die in dieser Arbeit bereits angesprochen worden sind.
5.4 Ligandenentwicklung Um ein effektives und zuverlässiges chemisches Sensorsystem oder
Anreicherungsverfahren zu entwickeln, ist es notwendig die umweltgefährdenden
Stoffe als Einzelsubstanzen oder als Summenparameter zu erfassen. Zur Entwicklung
eines geeigneten Liganden bzw. einer geeigneten Rezeptorfunktion wird eine
Ligandenbibliothek erstellt. Aus dieser Bibliothek werden die vier besten Liganden mit
Hilfe computerchemischer Methoden herausselektiert [241, Seite 375]. Anschließend
erfolgt die Synthese, Charakterisierung und Immobilisierung auf Silica. Diese Arbeiten
wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Niemeyer an der Helmut-
Schmidt-Universität Hamburg durchgeführt.
Die Liganden, die für die Untersuchungen herangezogen worden sind, sind in Abb. 54
dargestellt. Bei den Substituenten von 1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin handelt es sich
ausnahmslos um aromatische Verbindungen (2-Naphthalenthiol, 4-Aminoquinaldin, 5-
Dimethylamino-1-naphthalensulfonamid, 2-Naphthalensulfonamid, 2-Aminobenzo-
thiazol).
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 100 -
Abb. 54: Strukturen der verwendeten Liganden. TBL-LC11 (A); TBL-LC19 (B); TBL-LC02 (C); TBL-LC20 (D).
Die Synthesevorschrift für TBL-LC19 ist nachfolgend hier kurz angerissen. Von 1,3,5-
Trichloro-2,4,6-triazin werden 1,3 mmol (0,25 g) in 6 mL Aceton und 2 mL Wasser
unter Rühren im Eisbad aufgelöst. Anschließend erfolgt die tropfenweise Zugabe einer
Lösung bestehend aus 1,3 mmol (0,2 g) Aminobenzothiazol und 1,3 mmol (0,12 g)
Natriumhydrogencarbonat in 2 mL Aceton und 4 mL Wasser. Der Reaktionsansatz wird
im Eisbad für 2 h gerührt, das entstehende Präzipitat wird abfiltriert, mit Aceton und
Ethanol gewaschen und getrocknet. Von dem mit Aminobenzothiazol substituierten
1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin werden 0,8 mmol (0,24 g) in 14 mL DMF/Wasser (6:1, v/v)
gelöst. Zu dieser Lösung wird unter Rühren 0,8 mmol (0,2 g) Dansylamid in DMF und
0,8 mmol (0,08 g) Natriumhydrogencarbonat in Wasser zugegeben. Nach Erwärmen
auf 45 bis 55 °C wird für 24 h gerührt. Das entstehende Präzipitat wird abfiltriert, mit
Aceton gewaschen und getrocknet. TBL-LC19 liegt als gelbliches Pulver vor.
Die Immobilisierung der Liganden erfolgt auf mit Aminopropyltriethoxysilan
silanisiertem Kieselgel 100 nach der in Abschnitt 4.6.2. beschriebenen Methode. Von
den funktionalisierten Kieselgelen werden 20 mg im trockenen Zustand in 2 mL Vials
eingewogen. APS-Silica dient als Negativkontrolle. Von BT und 5-MeBT werden
Lösungen in Wasser hergestellt (2 mg/mL). Hiervon werden je 1 mL zu den
Adsorbentien pipettiert und über Nacht inkubiert. Die Bestimmung von BT und 5-MeBT
erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von =257 nm bzw. =263 nm. Hierzu wird
im Bereich von 0,02 µmol/mL bis 0,15 µmol/mL kalibriert. Vergleichsproben, die ohne
Adsorbens inkubiert worden sind, zeigten kaum Veränderungen der Konzentrationen.
Die Schwankung der bestimmten Werte, verglichen mit denen aus der Einwaage
berechneten Werte, liegt zwischen 5 und 10 %.
Die Ergebnisse aus den Simulationen sind in Abb. 55A dargestellt. Deutlich erkennbar
ist eine signifikante Selektivität von TBL-LC19 für BT gegenüber 5-MeBT. Die GB-
Werte betragen für BT ca. -10,2 kcal/mol, dagegen für 5-MeBT nur -1,9 kcal/mol. TBL-
LC02, TBL-LC11 und TBL-LC20 zeigen auch hohe GB-Werte (-10 bis -9 kcal/mol),
jedoch sind die Differenzen zwischen diesen für BT und 5-MeBT gering. Das als
Negativkontrolle untersuchte APS-Silica zeigt gegenüber beiden Schadstoffen
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 101 -
ebenfalls keine Präferenz. Die GB-Werte sind jedoch mit ca. -8 kcal/mol etwas
geringer. Die Orientierung von TBL-LC19 gegenüber BT ist in Abb. 55B dargestellt.
Dabei treten insbesondere - -Wechselwirkungen zwischen den Bindungspartnern auf.
Zudem bildet sich zwischen BT und der Silicaoberfläche eine Wasserstoffbrücke aus
[241, Seite 378].
Abb. 55: Simulationsergebnisse von BT und 5-MeBT gegenüber TBL-LC02, TBL-LC11, TBL-LC19, TBL-LC20 und APS-Silica (A). Orientierung von TBL-LC19 gegenüber BT bei der Konformation bei der niedrigsten Freien Bindungsenergie (B). BT ist in der Abbildung gelb hinterlegt. Die Linien zwischen TBL-LC19 und BT deuten die - -Wechselwirkung an [241, Seite 378].
Adsorptionsversuche im Batch wurden mit TBL-LC02, TBL-LC11 und TBL-LC19
durchgeführt. Als Negativkontrolle diente erneut APS-Silica. Die Ergebnisse sind in
Abb. 56 dargestellt. Hier bestätigen sich die Simulationsergebnisse hinsichtlich TBL-
LC19. Dieser Ligand zeigt eine deutlich höhere Adsorption von BT verglichen mit 5-
MeBT. Obwohl die Simulationsergebnisse auf keine Präferenz von TBL-LC02
gegenüber einem der untersuchten Schadstoffe hindeuten, zeichnet sich in den
Experimenten ein anderes Bild ab. TBL-LC02 adsorbiert im hohen Maße 5-MeBT. TBL-
LC11 und die Negativkontrolle APS-Silica präferiert keinen der Schadstoffe. Weiterhin
können die Ergebnisse, mit der Ausnahme von TBL-LC02 gegenüber 5-MeBT, gut mit
den Simulationsergebnissen qualitativ korreliert werden [241, Seite 379].
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 102 -
Abb. 56: Ergebnisse der Adsorptionsversuche. BT (1), 5-MeBT (2).
5.5 Self Assembled Monolayer als Grundlage chemisch-sensitiver Oberflächen
SAMs aus Alkylthiolen bieten eine Möglichkeit, Oberflächen für sensorische
Anwendungen maßgeschneidert zu modifizieren. Neben der hier angewendeten SPR
sind SAMs mit einer Reihe anderer Sensormesstechniken kompatibel, bei denen
Massenänderungen auf einer Oberfläche detektiert werden (z.B. Quarzkristall-
Mikrowaage, Ellipsometrie, Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie) [242, Seite
1146]. Somit können Protokolle für Oberflächenmodifizierungen durch SAMs auf
andere Sensormesstechniken übertragen werden. Des Weiteren können Sensor-
oberflächen aus SAMs reproduzierbar für mehrere Messungen eingesetzt werden.
Beispielsweise der durch Farre et al. entwickelte SPR-Sensor für Atrazin wurde
120 mal reproduzierbar auf Flusswasserproben angewendet [238, Seite 212].
Grundsätzlich können zwei Möglichkeiten unterschieden werden, hochgeordnete
Monolagen auf eine Oberfläche zu bringen. Einerseits durch die Herstellung von
Langmuir-Blodgett-Schichten, bei der eine in einer Flüssigkeit geordnete Monolage
amphiphiler Moleküle auf einen Festkörper übertragen wird. Die andere Möglichkeit ist
die Herstellung von SAMs. Letztere Möglichkeit ist in dieser Arbeit zur Anwendung
gekommen. Die schematische Darstellung eines SAMs ist in Abb. 57A gegeben [243,
Seite 1543].
Zur Herstellung von SAMs werden langkettige amphiphile Moleküle verwendet. Sie
besitzen eine polare Kopfgruppe und einen unpolaren Molekülteil, in der Regel ein
langkettiger Alkylrest. Zur Bildung eines SAMs muss die polare Kopfgruppe in der Lage
sein, mit der Oberfläche eines Festkörpers zu interagieren, was unter anderem über
kovalente Bindungen geschehen kann. Beispielsweise können SAMs auf Glas-
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 103 -
oberflächen durch Silanisierung mittels langkettigen Silanen generiert werden. Starke
polare Wechselwirkungen zwischen Alkylthiolen und Gold, welche von ihrer Bindungs-
stärke her betrachtet bereits kovalenten Charakter haben, kann man ebenfalls zur
Herstellung von SAMs ausnutzten [244, Seite 45]. Die Alkylthiole besitzen die
allgemeine Formel HS-R-RE, wobei R für die Alkylkette und RE für eine funktionelle
Gruppe steht, an der weitere Reaktionen stattfinden können. Eine funktionelle Gruppe
muss jedoch nicht zwingend am Thiol vorhanden sein. Die Entstehung eines SAMs
läuft in zwei Schritten ab. Im ersten Schritt chemisorbiert die Thiolgruppe an der
Goldoberfläche, dabei entsteht ein Thiolat. Im zweiten Schritt sorgen van-der-Waals-
Wechselwirkungen, die zwischen den Alkylketten der Thiole auftreten, für den
spontanen Selbstanordnungsprozess [244, Seite 42-48].
5.5.1 Herstellung und Charakterisierung der SAMs auf den Sensorchips
Für die Herstellung der SAMs wird das SIA Kit Au von GE Healthcare, bestehend aus
den Goldchips und Chipträgern, verwendet. Außerhalb des Biacore 3000 werden die
SAMs auf die Goldchips aufgebracht. Gegen die verwendeten Chemikalien besitzt das
Biacore 3000 nur eine begrenzte Resistenz. Anschließend können die Goldchips auf
einen Chipträger geklebt werden um den Sensorchip einsatzfähig zu machen.
5.5.1.1 Kontaktwinkelmessung Zur Charakterisierung der Goldoberflächen vor und nach Aufbringen des SAMs werden
Kontaktwinkelmessungen durchgeführt.
Das Absetzen eines Flüssigkeitstropfens, hier Wasser, auf die Oberfläche eines
Festkörpers führt entweder zum Beibehalten der Tropfenform oder zur Benetzung der
Oberfläche. Welche Form sich ausbildet und wie groß der Kontaktwinkel zwischen
dem äußersten Berührungspunkt von Tropfenflüssigkeit und Festkörper ist, hängt von
der Natur des Festkörpers und der Flüssigkeit ab. In Abb. 57B ist die Definition des
Kontaktwinkels grafisch dargestellt.
Abb. 57: Schematische Darstellung eines SAMs aus 11-Mercaptoundecansäure (A). Zur Definition des Kontaktwinkels (B).
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 104 -
Durch Aufbringen eines SAMs auf die Goldoberfläche ändern sich die Oberflächen-
eigenschaften, somit muss sich auch der Kontaktwinkel ändern, was als indirekte
Erfolgskontrolle des Self Assembly-Prozesses dient.
Die Messungen werden mit dem Kontaktwinkelmesssystem DSA 100E durchgeführt,
das sich aus einem beweglichen Probentisch, einem Videosystem (bestehend aus
Kamera, Linsensystem, Prisma, Lichtquelle und Lichtblende) und dem Tropfendosier-
system zusammensetzt.
Kontaktwinkelmessungen können auf zwei verschiedene Arten durchgeführt werden,
die auf der Methode des liegenden Tropfens basieren. Bei der statischen Methode wird
der Tropfen durch das Dosiersystem auf die Oberfläche abgesetzt, die Injektionsnadel
herausgezogen und das Tropfenbild aufgezeichnet. Wird die dynamische Methode
angewendet, verbleibt die Injektionsnadel im Tropfen. Wahlweise kann Flüssigkeit
zudotiert oder entfernt werden, wobei dann sogenannte Fortschritts- bzw.
Rückzugswinkel bestimmt werden [245, Seite 161-164]. Die Kontaktwinkel werden in
dieser Arbeit nach der statischen Methode bestimmt. Hierzu ist ein optimales
Tropfenbild mit klarer Trennung zum Spiegelbild notwendig. Die Gesamtgröße des
Tropfens soll ca. 50 bis 70 % des Tropfenbildes einnehmen. Am Kontaktbereich des
Tropfens zur Oberfläche wird die Beleuchtungsstärke so eingestellt, dass der
Hintergrund gut vom Tropfen und der Oberfläche unterscheidbar ist. Gleiches gilt für
die Bildschärfe, da die Konturen des Tropfens klar erkennbar sein müssen. Durch die
Software wird aus dem Tropfenbild anschließend der Kontaktwinkel bestimmt.
5.5.1.2 Reinigung und Aufbringen des Monolayers Vor dem Aufbringen der SAMs ist eine Reinigung der Goldchips notwendig. Hierfür
wird ein Gemisch aus 96 %iger Schwefelsäure und 30 %igem Wasserstoffperoxid (3:1,
v/v) verwendet, in das die Goldchips für 30 bis 45 min eingelegt werden. Eventuell
anhaftende organische Substanzen werden dadurch oxidiert. Nachfolgend werden die
Chips mit Wasser gründlich gespült und mit gereinigter Druckluft getrocknet.
Die Dokumentation des Reinigungserfolges durch die Kontaktwinkelmessung zeigt
eine Abnahme des Winkels um ca. 20°. Vor der Reinigung beträgt der Kontaktwinkel
90°, nach der Reinigung 70°.
Zur SAM-Herstellung werden von den Thiolen (1-Octadecanthiol und 11-Mercapto-
undecansäure) 1 mM Lösungen in Ethanol hergestellt und die Goldchips in diese für
15 bis 18 h eingelegt. Danach werden die Chips mit Ethanol und Wasser gespült, mit
gereinigter Druckluft getrocknet und die Kontaktwinkel gemessen.
In Abb. 58 sind die Tropfenbilder der SAMs aus 1-Octadecanthiol und 11-Mercapto-
undecansäure dargestellt. 1-Octadecanthiol besitzt keine funktionelle Gruppe RE,
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 105 -
daher ist die Oberfläche des SAMs unpolar. Die Kontaktfläche zu Wasser ist daher
klein und der Kontaktwinkel wird größer (Abb. 58A). Im Fall von 1-Octadecanthiol
vergrößert sich der Winkel von 70° auf 106°, was eine erfolgreiche Aufbringung des
SAMs indiziert.
Abb. 58: Tropfenbild nach Aufbringen eines SAMs aus 1-Octadecanthiol (A) und 11-Mercaptoundecansäure (B)
Dagegen trägt 11-Mercaptoundecansäure als funktionelle Gruppe eine Carboxygruppe.
Somit ist nach Aufbringen eines SAMs aus diesen Molekülen eine Abnahme des
Kontaktwinkels zu erwarten, da die Oberfläche polarer wird. Schon mit bloßem Auge ist
dies in Abb. 58B zu erkennen. Tatsächlich verkleinert sich der Winkel auf etwa
20° bis 25°, was auch in diesem Fall auf eine positive SAM-Generierung schließen
lässt.
5.5.2 Verifizierung der SAM-Herstellung mittels Lektinen Neben der Kontaktwinkelmessung erfolgt der Nachweis der SAM-Herstellung durch die
Immobilisierung der Lektine Con A und RCA auf SAMs aus 11-Mercaptoundecansäure.
Neben dem in Abschnitt 4.6.1 beschriebenen Protokoll der Immobilisierung mittels
Amin-Coupling innerhalb des Biacore 3000 wird untersucht in wie fern die
Immobilisierung der Lektine außerhalb des Gerätes erfolgen kann. Für die sich
anschließenden Interaktionsstudien dienen die Modellglycoproteine GOD und ASF.
5.5.2.1 Concanavalin A und GOD Die Carboxygruppen des SAMs aus 11-Mercaptoundecansäure werden durch EDC
und NHS in aktivierte Ester überführt. In mehreren Impulsen wird eine 1 mg/mL Con A-
Lösung bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 µL/min injiziert. Abschließend werden
mit Ethanolamin verbliebene aktivierte Carboxygruppen deaktiviert und mehrere
Stunden mit HBS-EP-Puffer gespült.
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 106 -
Abb. 88A im Anhang zeigt ein Beispielsensorgramm der Immobilisierung von Con A.
Insgesamt ist bei der dargestellten Immobilisierung ein Signalanstieg von 1470 RU zu
beobachten, was einer Beladung von 0,014 µmol/m2 entspricht. Der theoretische Wert
bei maximaler Beladung liegt bei 0,034 µmol/m2 bei einem Platzbedarf von 50 nm2 pro
Con A-Molekül.
Anschließend werden 100 µL einer 2 mg/mL GOD-Lösung in HBS-EP-Puffer bei
10 µL/min injiziert (Abb. 59A). Auf der Referenzzelle ist kein Signalanstieg zu
verzeichnen. Dagegen findet auf der Con A-Flusszelle eine deutliche Adsorption statt.
Unmittelbar nach Ende der Injektion sind 300 RU GOD auf der Chipoberfläche
verblieben. In der Abbildung ist dies durch den Pfeil ohne Beschriftung kenntlich
gemacht worden. Diese lassen sich mit einer 1 M Methyl- -D-mannopyranose-Lösung
in HBS-EP-Puffer kompetitiv von der Oberfläche desorbieren. Nach zwei Injektionen
von je 20 µL Methyl- -D-mannopyranose können ca. 60 % an GOD entfernt werden.
Versuche mit einer 1 mg/mL BSA-Lösung zeigen, dass weder auf der Con A-Zelle
noch auf einer Referenzflusszelle ohne Con A eine Anlagerung auftritt (Abb. 59B).
Abb. 59: Beispielsensorgramme von Injektionen von GOD (A) und BSA (B) auf Con A be-schichtete SAMs. Injektion von GOD oder BSA bei (1 in Abb. 59A und Abb. 59B). Desorption mit Methyl- -D-mannopyranose bei (2 in Abb. 59A und Abb. 59B).
Bei der Immobilisierung außerhalb des Gerätes werden die Goldchips vor dem
Einsetzen in den Chiphalter mit Con A funktionalisiert. Die Oberfläche des Goldchips,
ebenfalls bestehend aus 11-Mercaptoundecansäure, wird mit 20 µL eines EDC/NHS-
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 107 -
Gemisches behandelt, anschließend wird mit 20 µL HBS-EP-Puffer gespült. Auf den
Chip werden für 1 min 20 µL Con A in Acetatpuffer gegeben, mit HBS-EP-Puffer
gespült und mit 20 µL Ethanolamin verbliebene aktivierte Carboxygruppen desaktiviert.
Nach erneutem Spülen mit Puffer wird der Chip in den Chiphalter eingesetzt und ist
einsatzfähig. Jeder der vorangegangenen Schritte wird fünfmal ausgeführt.
Nach dem Einsetzen des Chips zeigt sich nach 60-minütigem Spülen mit HBS-EP-
Puffer eine deutliche Abnahme des Resonanzsignals. Das deutet auf ungebundenes
Con A auf dem SAM des Sensorchips hin. Nach Stabilisierung des Resonanzsignals
der einzelnen Flusszellen erfolgt die Injektion von 50 µL einer 1 mg/mL GOD-Lösung
bei einem Fluss von 10 µL/min. Unmittelbar danach verbleiben 142 RU auf der
Oberfläche. Die anschließende Desorption mit Methyl- -D-mannopyranose verläuft
äußerst unbefriedigend. Im Vergleich mit direkt im Biacore 3000 immobilisiertem Con A
ist es nicht möglich GOD zu desorbieren. Eine Wiederholung des Versuchs nach 24 h
zeigt, dass keine Adsorption von GOD mehr möglich ist. Dies deutet auf eine Ablösung
des Lektins vom SAM hin. Das Sensorgramm hierzu ist in Abb. 89A im Anhang
dargestellt.
5.5.2.2 Ricinus Communis Agglutinin und ASF Unter den gleichen Bedingungen wie für Con A beschrieben wird die Immobilisierung
von RCA auf dem SAM durchgeführt (Abb. 88B im Anhang). Nach der einmaligen
Injektion einer 1 mg/mL RCA-Lösung verbleiben 1400 RU auf der Chipoberfläche
(Abb. 60A). Es ergibt sich eine Oberflächenbelegung von 0,012 µmol/m2. Der
theoretische Wert bei maximaler Beladung für RCA liegt bei 0,022 µmol/m2, ausgehend
von einem Platzbedarf von 64 nm2 pro RCA-Molekül. Wird eine 1 mg/mL ASF-Lösung
injiziert, zeigt sich ein deutlicher Anstieg der Signalstärke. 70 % des adsorbierten ASF
konnten mittels 0,1 M Lactose-Lösung desorbiert werden. Wird eine ASF-Lösung auf
eine Referenzzelle injiziert, kann ebenfalls eine Wechselwirkung beobachtet werden.
Es bindet nahezu die gleiche Menge ASF an die Referenzflusszelle wie an die
Flusszelle mit RCA. Jedoch fällt das Signal deutlich schneller ab und es kann auf der
Referenzflusszelle auch nicht mit Lactose-Lösung desorbiert werden (Abb. 60A).
In Abb. 60B ist ein Beispielsensorgramm der Injektion von BSA auf einen mit RCA
beschichteten SAM dargestellt. Wechselwirkungen zwischen dem Lektin und dem
Testprotein sind nicht zu beobachten. Eine schwache unspezifische Adsorption tritt
dagegen zwischen der Referenzzelle und BSA auf.
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 108 -
Abb. 60: Beispielsensorgramme von Injektionen von ASF (A) und BSA (B) auf RCA be-schichtete SAMs. Injektion von ASF oder BSA bei (1 bei Abb. 60A und Abb. 60B). De-sorption mit Lactose bei (2 bei Abb. 60A und Abb. 60B).
Die Durchführung der Immobilisierung von RCA außerhalb des Biacore 3000 entspricht
der von Con A. Die Sensorgramme der Interaktionsstudien sind im Anhang in Abb. 89B
dargestellt. Im Gegensatz zu Con A zeigt sich eine stabile Basislinie in allen vier
Flusszellen nach der Immobilisierung, dass als Indiz für die nicht vorhandene kovalente
Bindung von RCA zum SAM gesehen werden kann. Die Injektion einer 1 mg/mL ASF-
Lösung führt zu einem deutlichen Anstieg des Resonanzsignals. Die Desorption mit
0,1 M Lactose-Lösung zeigt jedoch erneut nur eine Teildesorption. Nach diesem Schritt
sind noch ca. 45 % ASF auf der Chipoberfläche. Bei der Immobilisierung innerhalb des
Gerätes liegt der Wert bei 30 %. Bessere Desorptionsergebnisse lassen sich erzielen,
wenn geringer konzentrierte ASF-Lösungen verwendet werden. Beispielsweise können
72 % desorbiert werden, wenn eine Konzentration von 0,1 mg/mL verwendet wird. Im
Gegensatz zu Con A können die Versuche mit RCA auf bereits verwendeten Chips
auch nach 24 h reproduziert werden.
5.6 Rückschlüsse Autarke chemische Sensormesssysteme stellen hohe Anforderungen an die
verwendeten Materialen. Bedingt durch den hohen Salzgehalt fördert Meerwasser die
Korrosion metallischer Werkstoffe. Biofouling stellt ein weiteres Problem dar.
Chemisch-sensitive Schichten, die selektiv mit Schadstoffen interagieren, müssen von
Bewuchs freigehalten und ein möglicher biologischer oder chemischer Abbau
Triazinliganden für die adsorptive Schadstoffanreicherung - 109 -
verhindert werden. In dieser Umgebung müssen Schadstoffe im Spurenbereich über
einen längeren Zeitraum durch die zu entwickelnden Sensorsysteme zuverlässig
erfasst werden.
Ein Schritt in der Entwicklung eines chemischen Sensors oder selektiven
Anreicherungsverfahrens wurde im vorangegangen Abschnitt aufgezeigt. Hier konnte
ein neuer Ligand (TBL-LC19) als potentieller Rezeptor, mit dessen Hilfe ein
chemischer Sensor für 1H-Benzotriazol entwickelt werden kann, identifiziert werden.
Dabei zeigt TBL-LC19 eine klare Präferenz gegenüber BT. 5-MeBT wird im deutlich
geringeren Maßstab adsorbiert. Es konnte auch die Eignung von Molecular Modeling
zur Entwicklung potentieller Liganden gezeigt werden. Durch Anwendung
computergestützter Verfahren kann der Syntheseaufwand auf wenige Liganden
reduziert werden.
Der erste Schritt der Generierung einer chemisch-sensitiven Schicht mittels
Self Assembled Monolayer bestehend aus 1-Octadecanthiol und 11-Mercaptoundecan-
säure konnte ebenfalls gezeigt werden. Die angewendeten Methoden führen zur Aus-
bildung des gewünschten SAMs auf einer Goldoberfläche. Die anschließende Immo-
bilisierung von Lektinen sowie SPR-Interaktionsstudien mit Glucose Oxidase und
Asialofetuin konnten ebenfalls erfolgreich durchgeführt werden. Somit steht ein Träger-
system für die Liganden zur Verfügung, welches sich auf verschiedene Sensor-
messprinzipien übertragen lässt.
Klar ist auch, dass die Synthese und Charakterisierung von TBL-LC19 nur den ersten
Schritt darstellt. Von besonderem Interesse ist die Bestimmung von Adsorptions-
isothermen um das Adsorptionsverhalten im Spurenbereich zu charakterisieren. Mit
Hilfe dieser Daten kann anschließend ein mögliches Sensormessprinzip festgelegt
werden. Hierzu sind weitere nachfolgende Arbeiten nötig.
Zusammenfassung - 110 -
6 Zusammenfassung Diese Arbeit befasst sich mit der Entwicklung affinitätsbasierter Verfahren, die zur
Aufreinigung von Glycoproteinen und Kohlenhydraten eingesetzt werden sollen. Zu
den natürlichen Liganden, die eine Affinität zu Kohlenhydraten besitzen, zählen die
Lektine. Aufgrund ihrer proteinogenen Struktur und der geringen Verfügbarkeit sind
Lektine für viele affinitätsbasierte Verfahren nur eingeschränkt nutzbar. In diesen
Fällen ist es wünschenswert sie durch kleinere, stabilere und unbegrenzt vorhandene
Verbindungen zu ersetzen, ohne dabei an Affinität zu verlieren. Zu diesem Zweck
wurden die Eigenschaften von Triazin- und Boronsäureliganden evaluiert. Weiterhin
wurden aus diesen Ergebnissen maßgeschneiderte Anwendungen für diese Liganden
entwickelt, die es erlauben, gezielt die Vorteile zu nutzen und gleichzeitig die Nachteile
bestmöglich zu umgehen.
Für Boronsäureliganden ergibt sich die Anwendung einer ligandvermittelten
Affinitätstrennung, bei der die unspezifischen Wechselwirkungen minimiert werden. Bei
Triazinliganden zeigt sich eine erhöhte Affinität zu einigen Monosacchariden in
organischen Lösungsmitteln und zu ausgewählten anthropogenen Schadstoffen
(Benzotriazole). Diese Affinität kann für umweltanalytische Messungen und Monitoring-
Anwendungen genutzt werden.
Boronsäureliganden sind in der Lage mit Molekülen, bei denen in strukturell geeigneter
Weise Hydroxygruppen angeordnet sind, reversible cyclische Ester zu bilden. Ziel-
moleküle wie Glycoproteine, Kohlenhydrate oder das in der ligandvermittelten
Affinitätsseparation eingesetzte Thiaminpyrophosphat (TPP) erfüllen diese Bedingung.
Die Reversibilität beruht auf der pH-Abhängigkeit der Esterbindung. Die Desorption der
Zielmoleküle erfolgt demnach durch einen pH-Gradienten vom Basischen ins Saure.
Bei dem verwendeten Liganden m-Aminophenylboronsäure (ABA) ist der Ester unter
basischen Bedingungen stabil. Als Trägermaterial kam zum einen kommerziell
erhältliche ABA-Sepharose zum Einsatz, zum anderen wurde ABA auf einem
Polymethacrylatträger immobilisiert.
Zunächst wurde untersucht, ob ABA geeignet ist aus Blutplasma, einem der
komplexesten Vielstoffgemische überhaupt, Glycoproteine anzureichern. Diese
Versuche wurden im Säulendurchflussverfahren durchgeführt. Um die Spezifität der
Affinitätsseparation zu untersuchen, wurde die Desorptionsfraktion mittels 2D-Gel-
elektrophorese untersucht. Die Auftrennung zeigte, dass ABA unspezifische Wechsel-
wirkungen mit mehreren Molekülen eingeht und nicht ausschließlich Glycoproteine
anreichert. Eine deutliche Abnahme hochabundanter, nicht-glycosylierter
Verbindungen z.B. von Serum Albumin konnte nicht beobachtet werden. Daraufhin
erfolgte die Reduzierung der Komplexität des Vielstoffgemischs auf wenige glyco-
Zusammenfassung - 111 -
sylierte und nicht-glycosylierte Proteine. Auch hier zeigt sich die Neigung von ABA zur
unspezifischen Interaktion. Die Visualisierung der Desorptionsfraktionen mittels 1D-
Gelelektrophorese zeigt, dass selbst aus einfachen Gemischen keine vollständige
Abtrennung nicht-glycosylierter Proteine erfolgt. Die unspezifischen Wechselwirkungen
von ABA sind ionogener und hydrophober Natur, verursacht durch den Phenylring,
sowie dem unter basischen Bedingungen negativ geladenem Boratom.
Um eine mögliche Anwendung von Boronsäureliganden aufzuzeigen, wurde ein
ligandvermitteltes Affinitätsseparationsverfahren für das Enzym Benzoylformiat-
decarboxylase (BFD) entwickelt. Hierbei soll die unspezifische Adsorption auf ein
Minimum reduziert werden, indem alle ABA-Bindungsstellen vor der eigentlichen
Affinitätsseparation mit einem Reinstoff (Coenzym) abgesättigt werden. Der Cofaktor
TPP, den BFD für die biologische Funktion benötigt, interagiert mit ABA und konnte
erfolgreich temporär an einem ABA-Polymethacrylatträger immobilisiert werden. Durch
den Einsatz dieses Adsorbens können die Vorteile der starken Affinität und hohen
Selektivität der Enzym-Cofaktor-Wechselwirkung zusammen mit den einfachen und
milden Desorptionsbedingungen durch Verwendung eines schwach sauren Puffers
ausgenutzt werden. Aus einem Fermentationsaufschluss konnte so BFD aufgereinigt
werden, wie nach Anfertigung von 2D-Gelen gezeigt wurde. Zwar nahm die
Komplexität der Desorptionsfraktionen gegenüber dem Fermentationsaufschluss ab, es
zeigten sich dennoch unerwünschte Spots in den Gelen. Dies lässt auch hier den
Schluss zur Neigung der ABA zu unspezifischen Wechselwirkungen zu. Wird dagegen
TPP direkt an Polymethacrylatträger immobilisiert, kann ein noch höherer
Aufreinigungseffekt erzielt werden.
Im Gegensatz zu Boronsäureliganden interagieren Triazinliganden mit ihren Ziel-
molekülen über schwache intermolekulare Wechselwirkungen. Zwei Triazinliganden,
TBL1 und TBL2, die eine Affinität zu Kohlehydraten besitzen, wurden synthetisiert und
strukturell charakterisiert. Diese Liganden zeichnen sich durch eine einstufige
Synthese aus und können für Interaktionsstudien auf Silica-Trägermaterial
immobilisiert werden. Die Ergebnisse eines neu entwickelten massen-
spektrometrischen Charakterisierungsverfahrens nach Hydrolyse und Derivatisierung
des Silicas bestätigen die erfolgreiche Immobilisierung. Für zusätzliche
Interaktionsstudien mittels Oberflächenplasmonenresonanz-Messungen (Surface
Plasmon Resonance; SPR) wird eine Aminogruppe für die Immobilisierung in das
Molekül eingeführt.
Durchgeführte Interaktionsstudien mit glycosylierten und nicht-glycosylierten Proteinen
zeigten eine nicht ausreichende Affinität für Trennprozesse. Ferner ist die Bindung
nicht zuckerspezifisch, weil keine kompetitive Desorption mit einem geeigneten
Zusammenfassung - 112 -
Desorptionszucker möglich war. Durchgeführte Molecular Modeling Studien bestätigen
diese Ergebnisse.
Ein Vorteil der künstlichen Liganden gegenüber den voluminösen, unstabilen Lektinen
ist die mögliche Anwendung von organischen Lösungsmitteln in Trennprozessen.
Adsorptionsexperimente im Batch-Verfahren mit Mono- und Disacchariden in dem
organischen Lösungsmittel Dimethylformamid zeigte, dass das eingesetzte Disaccharid
4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose von den Liganden TBL1 und TBL2 in
großen Mengen adsorbiert wurde. Quantifiziert wurden die Zucker mittels einer LC/MS-
Methode. In weniger stark kompetitiven Lösungsmitteln wie DMF, DMSO oder
Chloroform weisen synthetische Liganden deutlich höhere Affinitäten zu
Kohlenhydraten auf, als dies in Wasser der Fall ist. Wasser bildet selbst Wasserstoff-
brücken zu Kohlenhydraten aus und konkurriert um die Bindungsstellen der
Kohlenhydrate. Daher ist die Anwendung der Liganden in organischen Lösungsmitteln
vielversprechend. Molecular Modeling und Docking-Simulationen wurden durchgeführt,
um Daten zu Wechselwirkungsmechanismen zu erhalten, die experimentell detailliert
nicht bestimmt werden können. Ein Vergleich zu natürlichen Liganden (Lektine und
Antikörper) zeigt die noch vorhandene Überlegenheit natürlicher Liganden hinsichtlich
Affinität und Selektivität.
Des Weiteren wurden Triazinliganden neu entwickelt, um sie in der adsorptiven
Schadstoffanreicherung und als mögliche Erkennungselemente für chemische
Sensoren einzusetzen. Ziel ist die Entwicklung von Verfahren, die in situ sowie
automatisiert Schadstoffe in Oberflächengewässern, insbesondere im Meerwasser, im
Spurenbereich erfassen. Als Modellschadstoffe wurden Benzotriazole ausgewählt, die
aufgrund ihrer technischen Bedeutung als antikorrosiv wirkende Zusätze verwendet
werden. In dieser Arbeit handelte es sich um 1H-Benzotriazol (BT) und 4-Methyl-1H-
benzotriazol (4-MeBT). Diese Stoffe werden in hohem Maße in die Umwelt freigesetzt.
Triazinliganden müssen dabei hohen Anforderungen genügen. Zum einen müssen sie
eine hinreichend hohe Affinität zu den Benzotriazolen besitzen, um im Spurenbereich
eine Detektion zu gewährleisten, zum anderen müssen eine sie hohe Selektivität
aufweisen, um zwischen verschiedenen Schadstoffen unterscheiden zu können.
Zur Generierung neuer Triazinliganden wurde eine Ligandenbibliothek erstellt und nach
der Durchführung von Modeling- und Dockingstudien die drei geeignetsten Liganden
synthetisiert und auf Silica immobilisiert. Aus den Simulationen geht hervor, dass
insbesondere TBL-LC19 zwischen den strukturell sehr ähnlichen Benzotriazolen BT
und 4-MeBT unterscheiden kann, bei gleichzeitig hoher Affinität zu BT. Durchgeführte
Adsorptionsexperimente bestätigen die Simulationsergebnisse. TBL-LC19 besitzt eine
klare Präferenz zu BT. 4-MeBT wurde im deutlich geringeren Maßstab adsorbiert. TBL-
Zusammenfassung - 113 -
LC19 stellt einen potentiellen Rezeptor dar, mit dessen Hilfe ein chemischer Sensor
oder Anreicherungsverfahren für 1H-Benzotriazol entwickelt werden kann.
Ein erster Schritt zur Entwicklung eines chemischen Sensors ist die gezielte
Oberflächenmodifizierung. Dies kann u.a. durch Self-Assembled-Monolayer (SAM)
geschehen. SAMs aus Alkylthiolen wurden auf Goldsensorchips für die SPR
aufgebracht und durch Kontaktwinkelmessungen sowie durch Interaktionsstudien nach
Funktionalisierung der SAMs mit Lektinen charakterisiert. Der Vorteil von SAMs ist,
dass sie mit einer Reihe anderer Sensormesstechniken kompatibel sind bei denen
Massenänderungen auf einer Oberfläche detektiert werden.
Summary - 114 -
7 Summary This thesis deals with the development of affinty-based processes to be used for the
purification of glycoproteins and carbohydrates. Lectins are natural compounds which
have an affinity to carbohydrates. Because of their proteinogenic character and their
inadequate accessibility the use of lectins in affinity-based processes is limited. In
these cases it is desirable to replace lectins with smaller, more stable and readily
available compounds without loosing affinity. For this purpose the properties of
triazine ligands and boronic acid ligands were evaluated. Furthermore tailor-made
applications for the ligands were developed from these results, which allow the use of
the benefits while the disadvantages are reduced.
Boronic acid ligands can be used for the ligand mediated affinity separation in which
unspecific interactions are reduced. Triazine ligands showed an increased affinity to
some monosaccharides in organic solvents and to an anthropogenic pollutant. This
affinity can be used for environmental measurements and monitoring purposes.
Boronic acid ligands have the ability to form reversible cyclic esters with their target. In
order to ensure that the ligand interacts with the target, the compound needs to
possess a suitable arrangement of hydroxyl groups. Target molecules like glycol-
proteins, carbohydrates or thiamine pyrophosphate (TPP), which were used for ligand
mediated affinity separation, fulfill this condition. The reversibility is based on the pH-
dependence of the ester bond, which is stable under basic conditions. The ligand m-
aminophenylboronic acid (ABA) was used. In addition to commercially available ABA-
Sepharose ABA was also successfully immobilized onto a polymethacrylate support.
Initially it was investigated whether ABA is suitable to enrich glycoproteins from blood
plasma, which is known to be one of the most complex fluids. These experiments were
carried out in the dynamic mode of affinity separation. Using 2D gelelectrophoresis it
was shown that ABA tends to unspecific interactions. A significant reduction of highly
abundant, non-glycosylated compounds e.g. serum albumin was not observed.
Because of these findings the complexity was reduced to a few glycosylated and non-
glycosylated proteins. However, also for a simple mixture ABA shows a tendency
towards unspecific adsorption. The visualization of the desorption fractions using 1D
gelelectrophoresis reveals that even in simple mixtures a complete removal of non-
glycosylated proteins was not achieved. The unspecific interactions of ABA are mainly
of ionic and hydrophobic nature, caused by the phenyl moiety and the boron atom of
ABA, which is negatively charged under basic conditions.
To demonstrate a possible application of boronic acid ligands a ligand mediated affinity
separation process for the enzyme benzoylformate decarboxylase (BFD) was
developed, in which the unspecific interaction should be reduced to a minimum through
Summary - 115 -
saturation of all ABA binding sites with a pure compound (cofactor). The cofactor TPP,
which is necessary for the biological function of BFD, interacts with ABA and was
successfully temporarily immobilized onto an ABA polymethacrylate support. Through
the use of this support the advantages of a strong affinity and high selectivity of the
enzyme cofactor interaction can be combined with the simple and mild desorption
conditions by using a slightly acidic buffer. In order to evaluate the designed application
BFD from a cell disruption was purified. The successful affinity separation was revealed
through 2D gelelectrophoresis. Although the complexity of the desorption fractions was
decreased, many undesirable protein spots appeared in the gels. This shows the
tendency of ABA towards non-specific interactions again. A higher purification effect
was achieved when TPP was immobilized directly onto a polymethacrylate support
without ABA.
In contrast to boronic acid based ligands triazine ligands interact with their target
molecules through weak intermolecular forces. Two triazine ligands (TBL1 and TBL2),
which have an affinity to carbohydrates were synthesized and structurally characterized.
The one-step synthesis of both ligands was carried out, followed by their immobilization
onto a silica support. The successful immobilization was shown by a newly developed
method, in which the mass spectrometry characterization took place after hydrolysis
and derivatization. For further interaction studies using surface plasmon resonance
(SPR) a primary amino group was introduced to TBL1 and TBL2.
Interaction studies carried out with different glycosylated and non-glycosylated proteins
displayed an insufficient affinity for separation processes. Moreover, the binding is not
sugar specific, because competitive desorption with a suitable desorption sugar was
not possible. Molecular modeling studies support the experimental findings.
One advantage of synthetic ligands over large and unstable lectins is a possible
application of organic solvents in separation processes. Batch experiments of
monosacchrides and disaccharides in dimethylformamide showed that high amounts of
the disaccharide 4-O- -D-galactopyranosyl-D-mannopyranose were adsorbed by TBL1
and TBL2. Quantification of the sugars was accomplished by using a LC/MS method.
In less competitive solvents like DMF, DMSO or chloroform synthetic ligands have
much higher affinity to carbohydrates than in water. Water itself forms hydrogen bonds
with carbohydrates and competes for the binding sites of carbohydrates. Therefore the
application of the ligands in organic solvents is promising. Molecular modeling and
docking studies were carried out to obtain data on interaction mechanisms, which can
not be determined experimentally in detail. A comparison with natural ligands (lectins
and antibodies) shows the superiority of natural ligands with regard to affinity and
selectivity.
Summary - 116 -
Furthermore, triazine ligands were developed to be used for the adsorptive
accumulation of pollutants and as possible recognition elements for chemical sensors.
The goal is the development of methods which can measure pollutants at trace levels
in situ and automatically in surface waters, especially in sea water. Benzotriazoles
were chosen as model pollutants, because of their technical relevance as anti-
corrosive additives. In this thesis 1H-Benzotriazole (BT) und 4-Methyl-1H-benzotriazole
(4-MeBT) were chosen. These substances are released into the environment to a large
extent.
Triazine ligands have to meet high requirements. On the one hand they must have an
affinity to the selected benzotriazoles to ensure detection at trace level. On the other
hand the selectivity of the ligands must be high to distinguish between different
pollutants.
In order to generate new triazine ligands a ligand library was built, from which the three
most appropriate ligands were chosen, synthesized and immobilized onto silica, due to
the promising results obtained from molecular modeling and docking studies. The
simulation results indicate that particular ligand TBL-LC19 can distinguish between the
structurally very similar benzotriazoles BT und 4-MeBT with a high affinity for BT.
Adsorption experiments confirmed the simulation results. TBL-LC19 has a clear
preference towards BT. 4-MeBT was adsorbed at a significantly smaller scale. TBL-
LC19 represents a potential receptor, which could be used for the development of a
chemical sensor or for the adsorptive accumulation of pollutants.
The first step in chemical sensor development is the selective surface modification,
which can be done for example with self assembled monolayer (SAM). SAMs
consisting of alkyl thiols were deposited onto gold sensorchips for SPR. The SAM
characterization was conducted by means of contact angle measurements and
interaction studies with glycoproteins after functionalization of the SAMs using different
lectins. The advantage of SAMs is the compatibility with a large number of other sensor
measurement techniques in which a mass change will be detected on a surface.
Anhang - 117 -
8 Anhang
8.1 Ergänzende Abbildungen und Tabellen
Abb. 61: BFD-Desorptionsfraktion ohne vorhergehende Absättigung mit TPP (zu Abschnitt 3.3.6.4)
Abb. 62: BFD-Desorptionsfraktion bei Verwendung eines HEPES-Laufpuffers mit einem pH-Wert von 6.9 (zu Abschnitt 3.4).
Anhang - 118 -
Abb. 63: ESI-MS von TBL1 (zu Abschnitt 4.4.1).
Abb. 64: ESI-MS von TBL2 (zu Abschnitt 4.4.1).
Anhang - 119 -
Abb. 65: ESI-MS von NH2-TBL1 (zu Abschnitt 4.4.2).
Abb. 66: ESI-MS von NH2-TBL2 (zu Abschnitt 4.4.2).
Anhang - 120 -
Abb. 67: 1H-NMR-Spektrum von TBL1 in DMSO-D6. H-1, H-2, H-3: 7,28 ppm (breites s, 10H, CH aromatisch); H-4: 4,59 ppm (breites s, 4H, CH2 Benzylamin). Bei dem 9,05 ppm-Signal kann es sich um die sekundären Amingruppen handeln [117, Seite 127]. Bei 2,50 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.1).
Abb. 68: 1H-NMR-Spektrum von TBL2 in CDCl3. H-1: 7,40 ppm (s, 2H, CH aromatisch); H-2: 7,24 ppm (d, 2H, CH aromatisch, 3J(H-3) = 9,1 Hz); H-3: 7,16 ppm (d, 2H, CH aromatisch, 3J(H-2) = 8,0 Hz); H-4: 2,89 ppm (t, 8H, CH2 aliphatisch, 3J(H-5) = 7,2 Hz); H-5: 2,09 ppm (quint, 4H, CH2 aliphatisch, 3J(H-4) = 7,4 Hz) (zu Abschnitt 4.4.1).
Anhang - 121 -
Abb. 69: 1H-NMR-Spektrum von NH2-TBL1 in DMSO. H-1, H-2, H-3: 7,19-7,45 ppm (m, 10H, CH aromatisch); H-4: 4,53 ppm (breites s, 4H CH2 Benzylamin); H-5: 3,60 ppm (breites s, 2H, CH2 Ethylendiamin); H-6: 2,98 ppm (d, 2H, CH2 Ethylendiamin, J = 27,8 Hz). Bei den Signalen größer 8 ppm handelt es sich vermutlich um die Protonen der Aminogruppen [117, Seite 127]. Bei 2,50 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.2).
Abb. 70: 1H-NMR-Spektrum von NH2-TBL2 in DMSO. H-1: 7,49 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-2: 7,38 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-3: 7,20 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-4: 2,84 ppm (breites s, 8H, CH2); H-5: 2,02 ppm (quint, 4H, CH2,
3J(H-4) = 7,1 Hz); H-6: 3,67 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin); H-7: 3,11 ppm (s, 2H, CH2 Ethylen-diamin). Bei den Signalen größer 8 ppm handelt es sich vermutlich um die Protonen der Aminogruppen [117, Seite 127]. Bei 2,52 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.2).
Anhang - 122 -
Abb. 71: 13C-NMR (DEPT45) von TBL1 in DMSO. C-1: 127,9 ppm; C-2: 128,8 ppm; C-3 127,5 ppm; C-4: 44,5 ppm (zu Abschnitt 4.4.1).
Abb. 72: 13C-NMR von TBL2 in CDCl3. C-1: 117,6 ppm; C-2: 119,5 ppm; C-3: 124,4 ppm; C-4: 33,0 ppm; C-5: 25,6 ppm; C-6: 32,4 ppm (zu Abschnitt 4.4.1).
Anhang - 123 -
Abb. 73: 13C-NMR (DEPT45) von NH2-TBL1 in DMSO. C-1: 128,2 ppm; C-2: 128,7 ppm; C-3 127,9 ppm; C-4: 43,6 ppm; C-5: 44,3 ppm; C-6: 38,5 ppm (zu Abschnitt 4.4.2).
Abb. 74: 13C-NMR (DEPT45) von NH2-TBL2 in DMSO. C-1: 118,5 ppm; C-2: 120,5 ppm; C-3: 124,6 ppm; C-4: 32,8 ppm; C-5: 25,6 ppm; C-6: 32,2 ppm; C-7: n.n.; C-8: 38,8 ppm (zu Abschnitt 4.4.2).
Anhang - 124 -
Abb. 75: Fragmentspektrum von (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan (Hydrolyse-produkt von APS-Silica) (zu Abschnitt 4.6.2.2).
Abb. 76: Effekt von DMSO auf die aktivierte Oberfläche eines CM5-Chips. Im oberen Teil der Abbildung ist das gesamte Sensorgramm zu sehen, im unteren Teil ist der Bereich zwischen 20500 RU und 23000 RU auf der Ordinatenachse vergrößert dargestellt. Die Oberfläche wird aktiviert (1) und anschließend mit 10 % DMSO in Acetatpuffer be-handelt (2). Kurz danach erfolgt die Deaktivierung mit Ethanolamin (3). Wie aus der vergrößerten Abbildung hervorgeht, ist nur eine minimale Änderung des Resonanz-signals zu beobachten. Die Immobilisierung wird durch DMSO demnach nicht beeinflusst (zu Abschnitt 4.6.1).
Anhang - 125 -
Abb. 77: Injektion von NH2-TBL1 (A) und NH2-TBL2 (B) auf eine nichtaktivierte CM5-Chip-oberfläche (NH2-TBL1: 5 µL, 0,31 mg/mL, 5 µL/min; 5 µL, NH2-TBL2: 0,22 mg/mL, 5 µL/min). In beiden Fällen findet eine Vorkonzentrierung auf der Dextranoberfläche des CM5-Chips statt (400 RU bei NH2-TBL1, 50 RU bei NH2-TBL2). Es wird die Differenz nach dem Injektionsende und der Basislinie gebildet. Dies ist in der Abbildung durch die Pfeile und kenntlich gemacht (zu Abschnitt 4.6.1).
Abb. 78: Sensorgramm zur Interaktion von GOD mit NH2-TBL2 bei geringer Liganden-dichte. Bedingungen: 2 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 88 RU. Die Pfeile kennzeichnen Desorptionsversuche mit Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in HBS-N-Puffer) (zu Abschnitt 4.7.1).
Anhang - 126 -
Abb. 79: Sensorgramme zur Interaktion von NH2-TBL1 mit GOD (A), TG (B) und BSA (C). Bedingungen: 0,8 mg/mL für jedes Protein, Fluss: 20 µL/min, immobilisierte NH2-TBL1-Menge: 100 RU. Die Pfeile markieren Anfang und Ende der Injektionen (zu Abschnitt 4.7.1).
Anhang - 127 -
Abb. 80: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 mit -Man(1 6) -Man(3 1) -Man (Trimannosylkern). Das Trisaccharid ist gelb hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A); NH2-TBL1 (mittel) (B); NH2-TBL2 (hoch) (C); NH2-TBL2 (mittel) (D) (zu Abschnitt 4.8.3.2).
Abb. 81: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 mit 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Das Disaccharid ist gelb hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A); NH2-TBL1 (mittel) (B); NH2-TBL2 (hoch) (C); NH2-TBL2 (mittel) (D) (zu Abschnitt 4.8.3.2).
Anhang - 128 -
Abb. 82: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL1-Silica (A) und TBL2-Silica (B) mit Methyl- -D-mannopyranose. Das Monosaccharid ist gelb hinterlegt (zu Abschnitt 4.8.3.2).
Abb. 83: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL1-Silica (A) und TBL2-Silica (B) mit 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Das Disaccharid ist gelb hinterlegt (zu Abschnitt 4.8.3.2).
Anhang - 129 -
Abb. 84: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 zu GOD aus A. Niger. Der obere Teil der Abbildung zeigt die an der Interaktion beteiligten Aminosäuren und Zucker zum Liganden an, die in der Abbildung in gelber Farbe hinterlegt sind. Der untere Teil zeigt die Lage der Liganden in Bezug auf die gesamte Untereinheit von GOD. Liganden und Kontaktregion zum Enzym sind hier in brauner Farbe hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL1 (niedrig) (C) (zu Abschnitt 4.8.3.3).
Abb. 85: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL2 zu GOD aus A. Niger. Zur weiteren Erklärung vgl. Abb. 84 (zu Abschnitt 4.8.3.3).
Anhang - 130 -
Abb. 86: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL2-Silica zu GOD aus A. Niger. Der linke Teil der Abbildung zeigt die an der Interaktion betei-ligten Aminosäuren und Zucker zum Liganden an, die in gelber Farbe hinterlegt sind. Der rechte Teil zeigt die Lage der Liganden in Bezug auf die gesamte Untereinheit von GOD (zu Abschnitt 4.8.3.3).
Abb. 87: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 zu GOD aus P. Amagasakiense. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL2 (hoch) (C), NH2-TBL2 (mittel). Zur weiteren Erklärung vgl. Abb. 84 (zu Abschnitt 4.8.3.3).
Anhang - 131 -
Abb. 88: Immobilisierung Con A (A) und RCA (B) an einen SAM bestehend aus 11-Mercaptoundecansäure. Nach der Aktivierung (1) schließt sich die Injektion der Lektin-Lösung an (2) gefolgt von der Deaktivierung verbliebener aktivierter Carboxy-gruppen (3) (zu Abschnitt 5.5.2.1 und 5.5.2.2).
Anhang - 132 -
Abb. 89: Sensorgramme von Immobilisierungen außerhalb des Biacore 3000. In (A) ist die Injektion von GOD auf einem Con A-SAM dargestellt. Dagegen ist in (B) die Injektion von ASF auf einem RCA-SAM abgebildet. (1) Injektion der Glycoproteine. (2) Desorptions-versuche mit Methyl- -D-mannopyranose bzw. Lactose (2) (zu Abschnitt 5.5.2.1 und 5.5.2.2).
Anhang - 133 -
8.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien
Tabelle 11: Verwendete Geräte. Verfahren Geräte Hersteller
AV-300 Steuerungssoftware: Topspin 2.1
Bruker BioSpin
Auswertungssoftware: SpinWorks 3 Kirk Marat, University of Manitoba
NMR-Spektroskopie
NMR-Röhrchen 5 mm (527-PP-7) Wilmad Labglass
Elementaranalyse Vario EL III Elementar
ESI-Massenspektrometrie API 4000 Steuerungs- und Auswertungssoftware: Analyst 1.4.2
AB Sciex
Dünnschichtchromatographie Kieselgel 60 F254 DC-Platten Merck
SPR-Interaktionsstudien Biacore 3000 Verwendete Sensorchips: C1, CM5 Chips zur SAM-Herstellung: SIA Kit Au Steuerungssoftware: Biacore 3000 Control Software 3.2 Auswertungssoftware: Biaevaluation 3.2
GE Healthcare
MALDI-Massenspektrometrie Ultraflex II TOF/TOF mit MALDI MTP AnchorChip 800-384 Steuerungssoftware: flexControl 2.4 Auswertungssoftware: flexAnalysis 2.4, BioTools 3.0 (MASCOT-Suche)
Bruker Daltonics
Affinitätsseparation Econo-System Gradientenpumpe Econo Detektor Econo UV Monitor Model EM-1 Recorder Econo Model 1327 Econo-Glassäulen (5x100) mm
Bio-Rad
Isoelektrische Fokussierung Protean IEF Cell IPG-Streifen: IPG Ready Strips 7 cm, 11 cm und 17 cm (pH 3-10)
Bio-Rad
1D-SDS-PAGE Mini-Protean-System Mini-Protean 2 Cell TGX-Minigele (10 wells, Any kD) Stromversorgung PowerPac 1000
Bio-Rad
2D-SDS-PAGE Criterion-System Criterion-Cell 8-16 % Tris-HCl Gele, 10 % Tris-HCl Gele Stromversorgung PowerPac 1000
Bio-Rad
Modulares HPLC-System 1050er Serie: Degasser, Binäre Pumpe 1100er Serie: Autosampler (GA1313A) Variabeler Uv/Vis-Detektor (GA 1314A) 1200er Serie: Säulenofen (GA1316A) Steuerungs- und Auswertungssoftware: ChemStation Build 164
Agilent Flüssigchromatographie
HPLC-Säule Luna NH2 (2x100 mm 5 µm Aminosäule)
Phenomenex
Spekol UV/Vis Analytik Jena
1420 Multiabel Counter VICTOR3 PerkinElmer
Mikrotiterplatte 96well, Polystyrol Greiner Bio-One
Einmalküvetten PMMA 1,5 mL Brand
UV/Vis-Spektroskopie
Quarzglasküvetten 100-QS 1 mL Hellma
Kontaktwinkelmessung DSA 100E Krüss
Zellaufschluss Sonifier 450 Branson
Anhang - 134 -
Tabelle 12: Sonstige Geräte und Verbrauchsmaterialien. Gerät/ Verbrauchsmaterial Hersteller
Analysenwaage AG285 Mettler-Toledo
Analysenwaage R 160 P Sartorius mechatronics
Blockthermostat TCR 200 Carl Roth
Dispenser Handystep (Bradford-Test) Brand
Dodeca Stainer (Gelfärbung) Bio-Rad
Einwegspritzen Omnifix Luer Lock (10 und 5 mL) B. Braun
Feinwaage BL 3100 Sartorius mechatronics
Filtermembranen 0,2 µm (Nylon) Whatman
Filternutsche (Porosität 3 und 4) VWR
Filterpapiere Machery-Nagel
Gefriertrocknung Alpha I-5 Christ
Gelscanner Gene Genius Syngene
Inkubator MCO-17AC Sanyo
Kontaktthermometer VT 5 VWR
Laborschüttler Laboshake C. Gerhardt
Magnetrührer Mini MR Standard Ika
Magnetrührer mit Heizfunktion RCT Classic Ika
Mikropipette Reference oder Research (0,1-2,5 L; 1-10 L; 10-100 L; 100-1000 L und 500-5000 L)
Eppendorf
pH-Indikatorstreifen (pH 0-14) Merck
pH-Meter 766 Calimatic Knick
Pipettenspitzen Eppendorf
Reagenzröhren (15 und 50 mL) Sarstedt
Reinstwasser-System clear plus SG Wasseraufbereitungs- und Regenerierstation
Reinstwasser-System MilliQ Synthesis A10 kombiniert mit Elix 3 Millipore
Rotationsverdampfer Laborota 4000 Heidolph
Rotator für Reagenz- und Probenröhrchen VWR
Safe-Lock Gefäße (Vials, Reaktionsgefäße) 1,5 mL und 2 mL Eppendorf
Schott Duran Glasflaschen Schott
Spotpicker PROTEINEER spII (Gelscanfunktion) Bruker Daltonics
Spritzenpumpe 11Plus Harvard Apparatus
Spritzenvorsatzfilter 0,2 µm Whatman
Trockenschrank UT 6120 Heraeus
Ultraschallbad Sonorex RK 102 II Bandelin electronic
Vakuumtrockenschrank VT 6025 Thermo Scientific
Vakuumzentrifuge Alpha RVC mit Kondensator L-1 Christ
Vivaspin 6-, Vivaspin 20-Ultrafiltrationsröhrchen (MWCO 10 kDa) Sartorius Stedim Biotech
Vortexer Minishaker MS 2 Ika
Zentrifuge 3K1 Sigma Laborzentrifugen
Zentrifuge 5804R Eppendorf
Anhang - 135 -
8.3 Chemikalien Für die Gefährdungsbeurteilung der vewendeten Chemikalien und Zubereitungen wird
die neue GHS-Kennzeichnung (Globally Harmonized System of Classification,
Labelling and Packaging of Chemicals) verwendet. Bei kursiver Schreibweise wurde
die alte Kennzeichnung verwendet.
GHS02 GHS05 GHS06 GHS07 GHS08 GHS09 Xi/Xn F
Tabelle 13: Verwendete Chemikalien. Stoff Gefahren-
symbole Gefahren-hinweise
Sicherheits-hinweise
CAS-Nummer
Hersteller
1,3,5-Trichloro-2,4,6-triazin GHS05 GHS06
H302 H314 H317 H330
P260 P280 P284 P305+P351+P338 P310
108-77-0 Sigma-Aldrich
11-Mercaptoundecansäure GHS07 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
71310-21-9
Sigma-Aldrich
1H-Benzotriazol GHS07 H302 H312 H319 H412
P273 P280 P305+P351+P338
95-14-7 Sigma-Aldrich
1-Octadecanthiol GHS07 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
2885-00-9 Merck
2-Aminobenzothiazol GHS07 H302 H319
P305+P351+P338 136-95-8 Sigma-Aldrich
2-Naphthalenethiol GHS07 H302 - 91-60-1 Sigma-Aldrich
2-Naphthalensulfonamid GHS07 H319 P305+P351+P338 1576-47-2 Sigma-Aldrich
4-Aminoquinaldin GHS07 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
6628-04-2 Sigma-Aldrich
4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose
- - - 20869-27-6 Sigma
5-Aminondan GHS07 H302 H312 H332
P280 24425-40-9 Aldrich
5-Dimethylamino-1-naphthalen-sulfonamid
- - - 1431-39-6 Sigma-Aldrich
5-Methyl-1H-benzotriazol
GHS07 H302 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
136-85-6 Sigma-Aldrich
ABA (m-Aminophenylboronsäure)
GHS07 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
206658-89-1
Aldrich
Aceton GHS02 GHS07
H225 H319 H336
P210 P261 P305+P351+P338
67-64-1 Sigma
Anhang - 136 -
Stoff Gefahren-symbole
Gefahren-hinweise
Sicherheits-hinweise
CAS-Nummer
Hersteller
Acetonitril GHS02 GHS07
H225 H302 H312 H319 H332
P210 P280 P305+P351+P338
75-05-8 Sigma-Aldrich
Acetonitril (picograde) GHS02 GHS07
H225 H302 H312 H319 H332
P210 P280 P305+P351+P338
75-05-8 Sigma-Aldrich
Aleuria Aurantia Lektin - - - - Vector Laboratories
Aminopropyltriethoxysilan GHS05 GHS07
H302 H314
P280 P305+P351+P338 P310
919-30-2 Sigma-Aldrich
Ammoniumbicarbonat GHS07 H302 - 1066-33-7 Sigma-Aldrich
Asialofetuin Typ I - - - - Sigma-Aldrich
Benzoylformiat (Benzoylameisensäure)
GHS07 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
611-73-4 Sigma-Aldrich
Benzylamin GHS05 GHS07
H302 H312 H314
P280 P305+P351+P338 P310
100-46-9 Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin - - - 9048-46-8 Sigma-Aldrich
Cäsiumacetat - - - 3396-11-0 Sigma-Aldrich
Chloroform GHS07 GHS08
H302 H315 H319 H351 H373
P281 P305+P351+P338
Sigma-Aldrich
Chloroform-d1 GHS07 GHS08
H302 H315 H319 H351 H373
P281 P305+P351+P338
865-49-6 Sigma-Aldrich
Concanavalin A Typ V GHS08 H317 H334
P261 P280 P342+P311
11028-71-0 Sigma-Aldrich
Dikaliumhydrogenphosphat - - - 7758-11-4 Merck
Dimethylformamid GHS02 GHS07 GHS08
H226 H312 H319 H332 H360D
P201 P280 P305+P351+P338P308+P313
68-12-2 Sigma-Aldrich
Dimethylsulfoxid - - - 67-68-5 Sigma-Aldrich
Dimethylsulfoxid-d6 - - - 2206-27-1 Sigma-Aldrich
Dinatriumhydrogenphosphat - - - 7558-79-4 Merck
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimidhydrochlorid)
GHS05 GHS07
H315 H318 H335
P261 P280 P305+P351+P338
25952-53-8
GE Healthcare
Eisessig GHS02 GHS05
H226 H314
P280 P305+P351+P338P310
64-19-7 Merck
Ethanol GHS02 H225 P210 64-17-5 Sigma-Aldrich
Ethanolamin GHS05 GHS07
H302 H312 H314 H332
P280 P305+P351+P338P310
141-43-5 GE Healthcare
Ethylacetat GHS02 GHS07
H225 H319 H336
P210 P261 P305+P351+P338
141-78-6 Merck
Ethylendiamin GHS02 GHS05 GHS07 GHS08
H226 H302 H312 H314 H317 H334
P261 P280 P305+P351+P338P310
107-15-3 Sigma-Aldrich
Anhang - 137 -
Stoff Gefahren-symbole
Gefahren-hinweise
Sicherheits-hinweise
CAS-Nummer
Hersteller
Fetuin - - - 9014-81-7 Sigma-Aldrich
Glucose Oxidase aus A. niger GHS08 H334 P261 P342+P311
9001-37-0 Serva
Glycerol - - - 56-81-5 Sigma-Aldrich
Glycin - - 56-40-6 Bio-Rad
Harnstoff - - - 57-13-6 Bio-Rad
HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure)
- - - 7365-45-9 Sigma-Aldrich
Hexan GHS02 GHS07 GHS08 GHS09
H225 H304 H315 H336 H361f H373 H411
P210 P261 P273 P281 P301+P310 P331
110-54-3 Merck
Human Haptoglobin Typ 1,1 - - - - Sigma-Aldrich
Kaliumdihydrogenphosphat - - - 7778-77-0 Merck
Kaliumhydroxyd GHS05 GHS07
H302 H314
P280 P305+P351+P338P310
1310-58-3 Scharlau
L-Fucose
Magnesiumchlorid Xi R36/37 S22-24/25 7786-30-3 Merck
Magnesiumsulfat - - - 7487-88-9 Scharlau
Meraptoethanol GHS05 GHS07 GHS09
H301 H310 H315 H317 H318 H330 H410
P260 P273 P280 P284 P301+P310 P302+P350
60-24-2 Sigma-Aldrich
Methanol GHS02 GHS06 GHS08
H225 H301 H311 H331 H370
P210 P260 P280 P301+P310 P307+P311
67-56-1 Sigma-Aldrich
Methanol (picograde) GHS02 GHS06 GHS08
H225 H301 H311 H331 H370
P210 P260 P280 P301+P310 P307+P311
67-56-1 Sigma-Aldrich
Methyl- -D-glucopyranose - - - 97-30-3 Sigma-Aldrich
Methyl- -D-mannopyranose - - - 617-04-9 Sigma-Aldrich
N-Acetyl-D-glucosamin - - - 7512-17-6 Sigma-Aldrich
Natriumacetat - - - 127-09-3 Sigma-Aldrich
Natriumchlorid - - - 7647-14-5 Merck
Natriumhydrogencarbonat - - - 144-55-8 Merck
NHS (N-Hydroxysuccinimid)
- - - 6066-82-6 GE Healthcare
Ninhydrin GHS07 H302 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
485-47-2 Sigma-Aldrich
polyklonaler Anti-Human Hapto-globin Antikörper (Schaf, IgG)
- - - - abcam
Ricinus Communis Agglutinin - - - - Sigma-Aldrich
Saccharose - - - 57-50-1 Sigma-Aldrich
SDS (Natriumdodecylsulfat)
GHS02 GHS06
H228 H302 H311 H315 H319 H335
P210 P261 P280 P305+P351+P338 P312
151-21-3 Bio-Rad
Sorbitol - - - 50-70-4 Sigma-Aldrich
Thiaminhydrochlorid - - - 67-03-8 Sigma-Aldrich
Anhang - 138 -
Stoff Gefahren-symbole
Gefahren-hinweise
Sicherheits-hinweise
CAS-Nummer
Hersteller
Thiaminpyrophosphat - - - 154-87-0 Sigma-Aldrich
Thyroglobulin aus der Rinder-schilddrüse
- - - 9010-34-8 Sigma-Aldrich
Toluol GHS02 GHS07 GHS08
H225 H304 H315 H336 H361d H373
P210 P261 P281 P301+P310 P331
108-88-3 Sigma-Aldrich
Trifluoressigsäure GHS05 GHS07
H314 H332 H412
P273 P280 P305+P351+P338P310
76-05-1 Sigma-Aldrich
Trimethylsilylimidazol GHS02 GHS07
H225 H315 H319 H335
P210 P261 P305+P351+P338
18156-74-6 Sigma-Aldrich
Tris (Tris(hydroxymethyl)-amino-methan)
GHS07
H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
77-86-1 Sigma-Aldrich
Wasser-d2 - - - 7789-20-0 Sigma-Aldrich
-Cyano-4-hydroxyzimtsäure GHS07 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
28166-41-8 Sigma-Aldrich
DTT (Dithiothreitol)
GHS07 H302 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
3483-12-3 Serva
IAA (Iodessigsäure)
GHS05 GHS06
H301 H314
P280 P301+P310 P305+P351+P338 P310
64-69-7 Sigma-Aldrich
Tabelle 14: Verwendete, gebrauchsfertige Zubereitungen, Testkits und Trägermaterialen
Zubereitung Gefahren-symbole
Gefahren-hinweise
Sicherheits-hinweise
Hersteller
Laemmli-Puffer - - - Bio-Rad
Bradford-Reagenz GHS07 GHS08
H315 H319 H371
P260 P305+P351+P338
Sigma-Aldrich
Toyopearl AF-Tresyl-650M GHS07 H315 H319 H335
P261 P305+P351+P338
Tosoh
ABA-Sepharose - - - Sigma-Aldrich
Coomassie-Färbelösung - H314 - Carl Roth
Trypsin Singles (Proteomics grade)
F, Xn
11-20/21/22-36/37/38-42
23-24-26-36/37 Sigma-Aldrich
HBS-N-Puffer - - - GE Healthcare
HBS-EP-Puffer - - - GE Healthcare
Acetatpuffer pH 5 - - - GE Healthcare
Kieselgel 100 - - P260 Merck
Protein-Marker 6,5-200 kDa - - - Serva
Tabelle 15: Herstellerverzeichnis
Name des Herstellers Hersteller mit Ort und Land
AB Sciex AB Sciex Germany GmbH
abcam abcam plc, Cambridge, Vereinigtes Königreich
Agilent Agilent Technologies Deutschland GmbH, Böblingen, Deutschland
Analytik Jena Analytik Jena AG, Jena, Deutschland
Anhang - 139 -
Name des Herstellers Hersteller mit Ort und Land
B. Braun B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland
Bandelin electronic Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Berlin Deutschland
Bio-Rad Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Deutschland
Brand BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland
Branson Branson Ultraschall, Niederlassung der EMERSON Technologies GmbH & Co. OHG, Dietzenbach, Deutschland
Bruker BioSpin Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Deutschland
Bruker Daltonics Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland
C. Gerhardt C. Gerhardt GmbH & Co. KG, Königswinter, Deutschland
Carl-Roth Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland
Christ Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Deutschland
Elementar Elementar Analysensysteme GmbH, Hanau, Deutschland
Eppendorf Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
GE Healthcare GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Deutschland
Greiner Bio-One Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland
Harvard Apparatus Harvard Apparatus, Holliston, USA
Heidolph Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Kelheim, Deutschland
Hellma Hellma GmbH & Co. KG, Müllheim, Deutschland
Heraeus Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland
IKA IKA-Werke GmbH & CO. KG, Staufen, Deutschland
Knick Knick Elektronische Messgeräte GmbH & Co. KG, Berlin, Deutschland
Krüss A. Krüss Optronic GmbH, Hamburg, Deutschland
Machery-Nagel Machery-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Deutschland
Merck Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Mettler-Toledo Mettler-Toledo GmbH, Greifensee, Schweiz
Millipore Millipore GmbH, Schwalbach, Deutschland
PerkinElmer PerkinElmer Inc., Waltham, USA
Phenomenex Phenomenex Ltd., Aschaffenburg, Deutschland
Sanyo Sanyo Sales & Marketing Europe GmbH, München, Deutschland
Sarstedt Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutschland
Sartorius mechatronics Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
Sartorius Stedim Biotech Sartorius Stedim Biotech S.A., Aubagne Cedex, Frankreich
Scharlau Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Spanien
Schott Schott AG, Mainz, Deutschland
Serva SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland
SG Wasseraufbereitungs- und Regenerierstation
SG Wasseraufbereitungs- und Regenerierstation GmbH, Barsbüttel, Deutschland
Sigma Laborzentrifugen Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Deutschland
Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen bei München, Deutschland
Syngene Synoptics Ltd, Cambridge, Vereinigtes Königreich
Thermo Scientific Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold, Deutschland
Tosoh Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Deutschland
Vector Laboratories Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA
VWR VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland
Wilmad Labglass Wilmad Labglass, Buena, USA
Abbildungsverzeichnis - 140 -
9 Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Grundschema der Affinitätsseparation. Die Einteilung der Verfahrensschritte erfolgt in Adsorption (1), Waschen (2), Desorption (3) und Regeneration (4).
Abb. 2: Klassifizierung der Affinitätsseparationsverfahren auf Basis der benutzten Liganden nach Vijayalakshmi [41, Seite 71]. In den Klammern sind mögliche Zielmoleküle der aufgeführten Liganden angegeben.
Abb. 3: Schematische Darstellung des Schlüssel-Schloss-Prinzips (A) und des Induced-Fit-Modells (B)
Abb. 4: Schematische Darstellung der wichtigsten Wasserstoffbrücken, die an der Bindung zwischen Concanavalin A und eines Trimannosids beteiligt sind. Entnommen aus [57, Seite 975].
Abb. 5: Darstellung hydrophober und polarer Bereiche von Kohlenhydraten am Beispiel von -D-Glucose. In Rot dargestellt sind OH-Gruppen, in Blau die hydrophoben Bereiche der Glucose.
Abb. 6: Strukturformel von m-Aminophenylboronsäure (ABA).
Abb. 7: Bildung eines cyclischen Esters aus ABA und einem Diol. In Abb. 7A sind die gekoppelten Gleichgewichte dargestellt. Abb. 7B zeigt, dass Keq eine Kombination von Ktrigonal und Ktetraedrisch ist. Zwecks Übersichtlichkeit fehlt das koordinativ gebundene Wasser in Abb. 7B.
Abb. 8: Immobilisierung von m-Aminophenylboronsäure an einem tresylierten Träger. Im Rahmen einer nucleophilen Substitution reagiert die primäre Aminogruppe von ABA mit dem elektrophilen Kohlenstoffatom unter Abspaltung der Tresylgruppe.
Abb. 9: ABA-Affinitätsseparation von Seehundplasma mit ABA-Toyopearl AF-Tresyl-650M (A). Daneben ist eine Auftragung von Plasma auf den Träger ohne ABA-Liganden zu sehen (B).
Abb. 10: 2D-Gele des Seehundplasmas (A) und der Desorptionsfraktion (B). Der Proteinmarker ist bei (A) auf der rechten, bei (B) auf der linken Seite aufgetragen worden. Für die 2D-Gelelektrophorese werden 7 cm IPG-Streifen (pH 3-10) und entsprechende Fertiggele (Tris-HCl, 8-16 %) für die Mini-Protean-Zelle verwendet.
Abb. 11: Affinitätschromatogramme der Einzelaufgaben von GOD (A), Fetuin (B) und BSA (C) und als Gemischaufgabe der drei Proteine (D).
Abb. 12: 1D-Gel der Standards und Proben. Belegung der Gel-Taschen: 1. Marker, 2. BSA, 3. GOD, 4. Fetuin, 5. Durchlauffraktion, 6. Desorptionsfraktion, 7. leer, 8. Ausgangsprotein-gemisch, 9. Laemmli-Puffer, 10. Marker.
Abb. 13: Darstellung einer Untereinheit der BFD als Stick-Modell (links) und als Ribbon-Modell (rechts); TPP (1), Mn2+ (2), Ca2+ (3). PDB-Datei 1bfd aus [98].
Abb. 14: Allgemeines Reaktionsschema der durch BFD katalysierten C-C-Kupplungsreaktion zwischen einem Aldehyd und einem -Ketocarbonsäure [99, Seite 312].
Abb. 15: Schematischer Trennzyklus der ligandvermittelten Aufreinigung von BFD. 1: Absättigung mit TPP. 2: Aufgabe des BFD-haltigen Gemisches. 3: Adsorption von BFD an TPP und Ausspülen der unerwünschten Stoffe. 4: Desorption von TPP und damit auch der daran gebundenen BFD. 5: Regeneration.
Abb. 16: Strukturformel von Thiaminpyrophosphat.
Abb. 17: Chromatogramm eines typischen Versuches mit TPP. 1: Entfernen des Überschusses von TPP durch Waschen mit Laufpuffer. 2: Desorption von TPP
Abb. 18: Strukturformel von Thiamin.
Abb. 19: 31P-NMR-Spektren von TPP (A) und TPP und ABA (B).
Abb. 20: Mögliche binäre Komplexe von ABA mit TPP.
Abb. 21: Beispielchromatogramm für die ligandvermittelte Affinitätsseparation mit TPP nach Aufgabe von 2 mL E. coli-Aufschluss. Durchlauffraktion während des Adsorptionsschrittes (1), Desorptionsfraktion (2).
Abbildungsverzeichnis - 141 -
Abb. 22: 2D-Gele des Zellaufschlusses (1) (8-16 % Tris-HCl Gel), der ABA-TPP-Desorptions-fraktion (2) (8-16 % Tris-HCl Gel) und der TPP-Desorptionsfraktion (3) (10 % Tris-HCl Gel).
Abb. 23: Beispiel zur Identifizierung von BFD in 2D-Gelen. Die Gelspots werden ausgeschnitten, tryptisch verdaut und der peptide mass fingerprint gemessen. Auf der linken Seite ist das MS-Spektrum des peptide mass fingerprints von BFD zu sehen. Rechts die nachfolgende MASCOT-Suche zeigt eine erfolgreiche Identifizierung (75 % Sequenzhomologie) von BFD an. Übereinstimmende Peptide sind in roter Farbe dargestellt.
Abb. 24: Darstellung von polaren Regionen (rot) und unpolaren Regionen (grau) im ABA-Molekül
Abb. 25: Schematischer Aufbau (A) und Struktur (B) des durch Ferrand et al. synthetisierten macrocyclischen Liganden. Beide Abbildungen sind aus [133, Seite 3185] entnommen.
Abb. 26: Darstellung der in dieser Arbeit verwendeten Triazinliganden. Im unteren Teil der Abbildung ist der Triazinkern orange hinterlegt. Die Substituenten des Triazinkerns sind in roter Farbe hervorgehoben. Im Fall von NH2-TBL1 ist der Substituent Benzylamin und für NH2-TBL2 ist es 5-Aminoindan (vgl. Abschnitt 4.4). Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Immobilisierung an das Trägermaterial erfolgt.
Abb. 27: Strukturformel von Cibacron Blue F3GA (A); optimierte Struktur von Cibacron Blue F3GA als Ligand für alkalische Phosphatase (B) und Pferdeleber-Alkoholdehydrogenase (C). Rot hinterlegt sind bei (B) und (C) die strukturellen Änderungen gegenüber Cibacron Blue F3GA. Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Immobilisierung erfolgt.
Abb. 28: Strukturformeln der triazinbasierten Liganden für humanes IgG (A) und für den monoklonalen anti-HIV Antikörper 4E10 (B). Blau hinterlegt ist der Molekülteil, an dem die Anbindung an das Trägermaterial erfolgt.
Abb. 29: Temperaturgesteuerte, nucleophile Substitution der Chloratome durch Aminogruppen.
Abb. 30: Vereinfachte Darstellung der Resonanzbedingung. Keine Resonanz findet statt, wenn die Komponente des Lichtvektors, die parallel zur Metallschicht verläuft, hinsichtlich Energie und Richtung mit der Anregungsenergie und Richtung des Verlaufs der Oberflächen-plasmonenwelle übereinstimmt (A). Dagegen ist in (B) die Resonanzbedingung erfüllt.
Abb. 31: Schematischer Aufbau eines SPR-Biosensors mit Prismenkoppler (A). Ändert sich der Brechungsindex der Lösung im Fließkanal, ändert sich der Resonanzwinkel (B), Wird die Änderung des Resonanzwinkels, ausgedrückt in Resonanzeinheiten, in Abhängigkeit von der Zeit graphisch dargestellt, erhält man das Sensorgramm (C). Schematische Darstellung des optischen Systems des Biacore 3000 (D, C) [175, Seite 19-22].
Abb. 32: Zusammenhang zwischen der SPR und der Affinitätsseparation. Im oberen Teil der Abbildung sind die Schritte der Affinitätsseparation dargestellt. Im Sensorgramm sind die Schritte grau hinterlegt. Adsorption (1), Waschen (2), Desorption (3) und Regeneration (4).
Abb. 33: Reaktionsmechanismus der Aktivierung gefolgt von der Immobilisierung der Triazinliganden auf einer CM5-Chipoberfläche (R = Dextranmatrix). Nach der Reaktion mit EDC und NHS bildet sich ein aktivierter NHS-Ester aus, der in der Lage ist, mit den synthetischen Liganden unter Ausbildung einer Carbonsäureamid-Gruppe zu reagieren.
Abb. 34: Immobilisierung von NH2-TBL1 (A) und NH2-TBL2 (B) auf CM5-Sensorchips. Der obere Teil der Abbildung von A und B zeigt bezüglich der Ordinatenachse das gesamte Sensorgramm, während der untere Teil der Abbildung den Bereich zwischen 21000 und 27000 RU vergrößert darstellt. Experimentelle Bedingungen zu A: (1) Aktivierung, (2) NH2-TBL1-Injektion (7 µL, 2,2 mg/mL), (3) Ethanolamin-Injektion (50 µL), (4) Ethanol-Injektion (70 %, 2x5 µL), (5) Ethanolamin-Injektion (25 µL). Experimentelle Bedingungen zu B: (1) Aktivierung, (2) NH2-TBL2-Injektion (3 µL, 0,2 mg/mL), (3) Ethanolamin-Injektion (50 µL), (4) Ethanol-Injektion (70 %, 5 µL). Der Doppelpfeil in (B) zeigt graphisch die Immobilisierungsausbeute an.
Abb. 35: Zur Bestimmung der theoretischen Ligandendichte wird die Konformation von NH2-TBL2 gewählt, bei der der größtmögliche Abstand der 5-Aminoindan-Substituenten auftritt. Die Konformation wird einer Energieminimierung unterzogen, und der Abstand zwischen beiden am weitesten voneinander entfernten Kohlenstoffatomen von 5-Aminoindan bestimmt (A). Drauf-sicht mit skizzierter Kreisfläche (B). Hexagonal dichteste Kreispackung der Liganden unter der Annahme, dass sich die Kreisflächen nicht überlappen (C). Überlappung der Kreisflächen (D).
Abbildungsverzeichnis - 142 -
Abb. 36: Hydrolyse und Derivatisierung der TBL-Liganden.
Abb. 37: Massenspektren der derivatisierten Hydrolyseprodukte von TBL1- (A), TBL2- (B) und APS-Silica (C) nach Hydrolyse und Derivatisierung. Die Molekülpeaks der Liganden und von APS-Silica sind schwarz eingerahmt.
Abb. 38: Fragmentspektren der Hydrolyseprodukte nach Derivatisierung von TBL1- (A) und TBL2-Silica (B).
Abb. 39: Schematische Darstellung einer SPR-Interaktionsmessung.
Abb. 40: Sensorgramme zum Einfluss von HBS-N-, HBS-EP- und Tris-Puffer auf das Adsorptionsverhalten von NH2-TBL2 zu GOD. Bedingungen: 1 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 1629 RU.
Abb. 41: Sensorgramme der Interaktion von NH2-TBL2 mit BSA. Bedingungen für (A): 1 mg/mL BSA, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 3599 RU. Bedingungen für (B): 1 mg/mL BSA, Fluss: 30 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 1634 RU.
Abb. 42: Sensorgramme zu den Desorptionsversuchen von NH2-TBL2 mit GOD (A) und TG (B). Zur besseren Übersicht ist nur die Ligandenflusszelle dargestellt. Bedingungen und Bemerkungen: (A): 1 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte Ligandenmenge: 3599 RU. (B): 1 mg/mL TG, Fluss: 10 µL/min, immobilisierte Ligandenmenge: 3599 RU. Verwendete Desorptionsreagenzien: 1. Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in HBS-N-Puffer), 2. Ethanol/Wasser (7:3, v/v), 3. Natriumdodecylsulfat (0,5 % in Wasser w/v).
Abb. 43: Adsorptionsisothermen von GOD mit TBL1-Silica, TBL2-Silica und APS-Silica (A). Darstellung eines Desorptionsversuches (B). Bei (1) erfolgt die Injektion von 0,5 mL einer GOD-Lösung in Tris-Puffer (10 mM Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH 7). Die Injektion von Methyl- -D-mannopyranose (0,5 M in Tris-Puffer) bei (2) zeigt zwar einen Anstieg der Intensität durch die Eigenabsorption von Methyl- -D-mannopyranose, jedoch keinen Desorptionspeak. Bei (3) wird der Tris-Puffer über das Adsorbens gefördert und die Intensität sinkt wieder. Erst nach Waschen mit Ethanol/Wasser (2:8, v/v) konnte GOD desorbiert werden (4).
Abb. 44: Beispielchromatogramm eines Zuckergemisches bestehend aus Methyl- -D-mannopyranose, N-Acetyl-D-glucosamin und Saccharose
Abb. 45: (A) Methyl- -D-mannopyranose-Kalibrierung ohne internen Standard. (B) Methyl- -D-mannopyranose-Kalibrierung mit internem Standard (Saccharose). Jede Verdünnungsstufe ist zweimal injiziert worden. Auf der Abszissenachse ist die absolute injizierte Masse von Methyl- -D-mannopyranose angegeben. Unter Verwendung eines internen Standards wird die Peakfläche von Methyl- -D-mannopyranose durch die Peakfläche des internen Standards Saccharose dividiert.
Abb. 46: Adsorption verschiedener Mono- und Disaccharide gelöst in Wasser oder DMF an TBL1-, TBL2- und APS-Silica. Die Zuckermischungen bestehen aus Methyl- -D-mannopyranose und N-Acetylglucosamin. (1) Methyl- -D-mannopyranose in Wasser, (2) Methyl- -D-mannopyranose in DMF, (3) Methyl- -D-mannopyranose-Gemisch in Wasser, (4) Methyl- -D-mannopyranose-Gemisch in DMF, (5) N-Acetylglucosamin in Wasser, (6) N-Acetylglucosamin in DMF, (7) N-Acetylglucosamin-Gemisch in Wasser, (8) N-Acetylglucosamin-Gemisch in DMF, (9) 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose in Wasser, (10) 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose in DMF, (11) Methyl- -D-glucopyranose in Wasser, (12) Methyl- -D-glucopyranose in DMF.
Abb. 47: Spezifische Desorption von TG durch Fucose. Nach dem Ende der Injektion einer 0,15 µM TG-Lösung bei einem Fluss von 10 µL/min (1) genügt zur vollständigen Desorption ein kurzer Impuls einer 100 mM Fucose-Lösung (2).
Abb. 48: Bestimmung der Dissoziationskonstanten von AAL und TG (A und B) sowie zwischen dem polyklonalen Antikörper und Haptoglobin (C und D). In A und C der Abbildung sind die Sensorgramme der Konzentrationsreihen dargestellt. Die Konzentrationen von TG und Haptoglobin sind in µmol/L angegeben. Das Resonanzsignal im Gleichgewicht (grau hinterlegter Bereich in A und B) wird gegen die jeweilige Konzentration zum Erhalt der Adsorptionsisothermen aufgetragen (C und D). Experimentelle Bedingungen: Fluss 10 µL/min; Injektionsvolumen 110 µL; Kontaktzeit 660 s, Puffer HBS-EP.
Abbildungsverzeichnis - 143 -
Abb. 49: Strukturformeln der Ligandenmodelle am Beispiel von NH2-TBL2 mit hoher (A), mittlerer (B) und geringer Ligandendichte (C). Orange hinterlegt ist die Dextranmatrix. Um die Berechnungszeit zu verringern, ist bei hohen und mittleren Ligandendichten auf einen größeren Ausschnitt der Dextranmatrix verzichtet worden.
Abb. 50: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL2 (Dextranmodell) mit Methyl- -D-mannopyranose. Die Struktur des Zuckers ist gelb hinterlegt. In (A) ist NH2-TBL2 (hoch), in (B) NH2-TBL2 (mittel) und in (C) NH2-TBL2 (niedrig) abgebildet. In (D) ist die Orientierung einer CH- -Wasserstoffbrücke zwischen NH2-TBL2 (mittel) und Methyl-
-D-mannopyranose dargestellt. Farbliche Zuordnung der Atome: Kohlenstoff grau; Wasserstoff hellgrau; Sauerstoff rot; Stickstoff blau. Wasserstoffbrücken zwischen zwei Atomen sind als grün gepunktete Linie dargestellt.
Abb. 51: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten G-Werten von NH2-TBL1 mit Methyl- -D-mannopyranose, dessen Struktur gelb hinterlegt ist. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL1 niedrig (C).
Abb. 52: Strukturformeln der verwendeten Benzotriazole.
Abb. 53: Schematische Darstellung der Messverfahren sowie Verdeutlichung der Herausforderung bei Messungen im Spurenbereich. (A) Schematische Darstellung eines Anreicherungsverfahrens. (B) Schematische Darstellung eines chemischen Sensors. (C) Bei Messungen im Spurenbereich mittels chemischer Sensoren muss KD hinreichend klein sein, damit das Gleichgewicht weit auf der Seite des Ligand-Schadstoff-Komplexes (LM) liegt. (D) Des Weiteren steigt der Messfehler, hier verdeutlicht durch die Horwitzfunktion [236, Seite 68A], je geringer die Konzentration des Analyten ist.
Abb. 54: Strukturen der verwendeten Liganden. TBL-LC11 (A); TBL-LC19 (B); TBL-LC02 (C); TBL-LC20 (D).
Abb. 55: Simulationsergebnisse von BT und 5-MeBT gegenüber TBL-LC02, TBL-LC11, TBL-LC19, TBL-LC20 und APS-Silica (A). Orientierung von TBL-LC19 gegenüber BT bei der Konformation bei der niedrigsten Freien Bindungsenergie (B). BT ist in der Abbildung gelb hinterlegt. Die Linien zwischen TBL-LC19 und BT deuten die - -Wechselwirkung an [206].
Abb. 56: Ergebnisse der Adsorptionsversuche. BT (1), 5-MeBT (2).
Abb. 57: Schematische Darstellung eines SAMs aus 11-Mercaptoundecansäure (A). Zur Definition des Kontaktwinkels (B).
Abb. 58: Tropfenbild nach Aufbringen eines SAMs aus 1-Octadecanthiol (A) und 11-Mercaptoundecansäure (B)
Abb. 59: Beispielsensorgramme von Injektionen von GOD (A) und BSA (B) auf Con A beschichtete SAMs. Injektion von GOD oder BSA bei (1 in Abb. 59A und Abb. 59B). Desorption mit Methyl- -D-mannopyranose bei (2 in Abb. 59A und Abb. 59B).
Abb. 60: Beispielsensorgramme von Injektionen von ASF (A) und BSA (B) auf RCA beschichtete SAMs. Injektion von ASF oder BSA bei (1 bei Abb. 60A und Abb. 60B). Desorption mit Lactose bei (2 bei Abb. 60A und Abb. 60B).
Abb. 61: BFD-Desorptionsfraktion ohne vorhergehende Absättigung mit TPP (zu Abschnitt 3.3.6.4)
Abb. 62: BFD-Desorptionsfraktion bei Verwendung eines HEPES-Laufpuffers mit einem pH-Wert von 6.9 (zu Abschnitt 3.4).
Abb. 63: ESI-MS von TBL1 (zu Abschnitt 4.4.1).
Abb. 64: ESI-MS von TBL2 (zu Abschnitt 4.4.1).
Abb. 65: ESI-MS von NH2-TBL1 (zu Abschnitt 4.4.2).
Abb. 66: ESI-MS von NH2-TBL2 (zu Abschnitt 4.4.2).
Abb. 67: 1H-NMR-Spektrum von TBL1 in DMSO-D6. H-1, H-2, H-3: 7,28 ppm (breites s, 10H, CH aromatisch); H-4: 4,59 ppm (breites s, 4H, CH2 Benzylamin). Bei dem 9,05 ppm-Signal kann
Abbildungsverzeichnis - 144 -
es sich um die sekundären Amingruppen handeln [117, Seite 127]. Bei 2,50 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.1).
Abb. 68: 1H-NMR-Spektrum von TBL2 in CDCl3. H-1: 7,40 ppm (s, 2H, CH aromatisch); H-2: 7,24 ppm (d, 2H, CH aromatisch, 3J(H-3) = 9,1 Hz); H-3: 7,16 ppm (d, 2H, CH aromatisch, 3J(H-2) = 8,0 Hz); H-4: 2,89 ppm (t, 8H, CH2 aliphatisch, 3J(H-5) = 7,2 Hz); H-5: 2,09 ppm (quint, 4H, CH2 aliphatisch, 3J(H-4) = 7,4 Hz) (zu Abschnitt 4.4.1).
Abb. 69: 1H-NMR-Spektrum von NH2-TBL1 in DMSO. H-1, H-2, H-3: 7,19-7,45 ppm (m, 10H, CH aromatisch); H-4: 4,53 ppm (breites s, 4H CH2 Benzylamin); H-5: 3,60 ppm (breites s, 2H, CH2 Ethylendiamin); H-6: 2,98 ppm (d, 2H, CH2 Ethylendiamin, J = 27,8 Hz). Bei den Signalen größer 8 ppm handelt es sich vermutlich um die Protonen der Aminogruppen [117, Seite 127]. Bei 2,50 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.2).
Abb. 70: 1H-NMR-Spektrum von NH2-TBL2 in DMSO. H-1: 7,49 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-2: 7,38 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-3: 7,20 ppm (breites s, 2H, CH aromatisch); H-4: 2,84 ppm (breites s, 8H, CH2); H-5: 2,02 ppm (quint, 4H, CH2,
3J(H-4) = 7,1 Hz); H-6: 3,67 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin); H-7: 3,11 ppm (s, 2H, CH2 Ethylendiamin). Bei den Signalen größer 8 ppm handelt es sich vermutlich um die Protonen der Aminogruppen [117, Seite 127]. Bei 2,52 ppm handelt es sich um DMSO (zu Abschnitt 4.4.2).
Abb. 71: 13C-NMR (DEPT45) von TBL1 in DMSO. C-1: 127,9 ppm; C-2: 128,8 ppm; C-3 127,5 ppm; C-4: 44,5 ppm (zu Abschnitt 4.4.1).
Abb. 72: 13C-NMR von TBL2 in CDCl3. C-1: 117,6 ppm; C-2: 119,5 ppm; C-3: 124,4 ppm; C-4: 33,0 ppm; C-5: 25,6 ppm; C-6: 32,4 ppm (zu Abschnitt 4.4.1).
Abb. 73: 13C-NMR (DEPT45) von NH2-TBL1 in DMSO. C-1: 128,2 ppm; C-2: 128,7 ppm; C-3 127,9 ppm; C-4: 43,6 ppm; C-5: 44,3 ppm; C-6: 38,5 ppm (zu Abschnitt 4.4.2).
Abb. 74: 13C-NMR (DEPT45) von NH2-TBL2 in DMSO. C-1: 118,5 ppm; C-2: 120,5 ppm; C-3: 124,6 ppm; C-4: 32,8 ppm; C-5: 25,6 ppm; C-6: 32,2 ppm; C-7: n.n.; C-8: 38,8 ppm (zu Abschnitt 4.4.2).
Abb. 75: Fragmentspektrum von (3-Aminopropyl)-tri-(trimethylsilyloxy)-silan (Hydrolyseprodukt von APS-Silica) (zu Abschnitt 4.6.2.2).
Abb. 76: Effekt von DMSO auf die aktivierte Oberfläche eines CM5-Chips. Im oberen Teil der Abbildung ist das gesamte Sensorgramm zu sehen, im unteren Teil ist der Bereich zwischen 20500 RU und 23000 RU auf der Ordinatenachse vergrößert dargestellt. Die Oberfläche wird aktiviert (1) und anschließend mit 10 % DMSO in Acetatpuffer behandelt (2). Kurz danach erfolgt die Deaktivierung mit Ethanolamin (3). Wie aus der vergrößerten Abbildung hervorgeht, ist nur eine minimale Änderung des Resonanzsignals zu beobachten. Die Immobilisierung wird durch DMSO demnach nicht beeinflusst (zu Abschnitt 4.6.1).
Abb. 77: Injektion von NH2-TBL1 (A) und NH2-TBL2 (B) auf eine nichtaktivierte CM5-Chipoberfläche (NH2-TBL1: 5 µL, 0.31 mg/mL, 5 µL/min; 5 µL, NH2-TBL2: 0.22 mg/mL, 5 µL/min). In beiden Fällen findet eine Vorkonzentrierung auf der Dextranoberfläche des CM5-Chips statt (400 RU bei NH2-TBL1, 50 RU bei NH2-TBL2). Es wird die Differenz nach dem Injektionsende und der Basislinie gebildet. Dies ist in der Abbildung durch die Pfeile und kenntlich gemacht (zu Abschnitt 4.6.1).
Abb. 78: Sensorgramm zur Interaktion von GOD mit NH2-TBL2 bei geringer Ligandendichte. Bedingungen: 2 mg/mL GOD, Fluss: 5 µL/min, immobilisierte NH2-TBL2-Menge: 88 RU. Die Pfeile kennzeichnen Desorptionsversuche mit Methyl- -D-mannopyranose (0.5 M in HBS-N-Puffer) (zu Abschnitt 4.7.1).
Abb. 79: Sensorgramme zur Interaktion von NH2-TBL1 mit GOD (A), TG (B) und BSA (C). Bedingungen: 0,8 mg/mL für jedes Protein, Fluss: 20 µL/min, immobilisierte NH2-TBL1-Menge: 100 RU. Die Pfeile markieren Anfang und Ende der Injektionen (zu Abschnitt 4.7.1).
Abb. 80: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 mit -Man(1 6) -Man(3 1) -Man (Trimannosylkern). Das Trisaccharid ist gelb hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A); NH2-TBL1 (mittel) (B); NH2-TBL2 (hoch) (C); NH2-TBL2 (mittel) (D) (zu Abschnitt 4.8.3.2).
Abbildungsverzeichnis - 145 -
Abb. 81: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 mit 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Das Disaccharid ist gelb hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A); NH2-TBL1 (mittel) (B); NH2-TBL2 (hoch) (C); NH2-TBL2 (mittel) (D) (zu Abschnitt 4.8.3.2).
Abb. 82: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL1-Silica (A) und TBL2-Silica (B) mit Methyl- -D-mannopyranose. Das Monosaccharid ist gelb hinterlegt (zu Abschnitt 4.8.3.2).
Abb. 83: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL1-Silica (A) und TBL2-Silica (B) mit 4-O- -D-Galactopyranosyl-D-mannopyranose. Das Disaccharid ist gelb hinterlegt (zu Abschnitt 4.8.3.2).
Abb. 84: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 zu GOD aus A. Niger. Der obere Teil der Abbildung zeigt die an der Interaktion beteiligten Aminosäuren und Zucker zum Liganden an, die in der Abbildung in gelber Farbe hinterlegt sind. Der untere Teil zeigt die Lage der Liganden in Bezug auf die gesamte Untereinheit von GOD. Liganden und Kontaktregion zum Enzym sind hier in brauner Farbe hinterlegt. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL1 (niedrig) (C) (zu Abschnitt 4.8.3.3).
Abb. 85: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL2 zu GOD aus A. Niger. Zur weiteren Erklärung vgl. Abb. 84 (zu Abschnitt 4.8.3.3).
Abb. 86: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von TBL2-Silica zu GOD aus A. Niger. Der linke Teil der Abbildung zeigt die an der Interaktion beteiligten Aminosäuren und Zucker zum Liganden an, die in gelber Farbe hinterlegt sind. Der rechte Teil zeigt die Lage der Liganden in Bezug auf die gesamte Untereinheit von GOD (zu Abschnitt 4.8.3.3).
Abb. 87: Darstellung der Konformationen mit den niedrigsten GB-Werten von NH2-TBL1 und NH2-TBL2 zu GOD aus P. Amagasakiense. NH2-TBL1 (hoch) (A), NH2-TBL1 (mittel) (B), NH2-TBL2 (hoch) (C), NH2-TBL2 (mittel). Zur weiteren Erklärung vgl. Abb. 84 (zu Abschnitt 4.8.3.3).
Abb. 88: Immobilisierung Con A (A) und RCA (B) an einen SAM bestehend aus 11-Mercaptoundecansäure. Nach der Aktivierung (1) schließt sich die Injektion der Lektin-Lösung an (2) gefolgt von der Deaktivierung verbliebener aktivierter Carboxygruppen (3) (zu Abschnitt 5.5.2.1 und 5.5.2.2).
Abb. 89: Sensorgramme von Immobilisierungen außerhalb des Biacore 3000. In (A) ist die Injektion von GOD auf einem Con A-SAM dargestellt. Dagegen ist in (B) die Injektion von ASF auf einem RCA-SAM abgebildet. (1) Injektion der Glycoproteine. (2) Desorptionsversuche mit Methyl- -D-mannopyranose bzw. Lactose (2) (zu Abschnitt 5.5.2.1 und 5.5.2.2).
Tabellenverzeichnis - 146 -
10 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Zusammenstellung der intermolekularen Kräfte.
Tabelle 2: Gesamtassoziationskonstanten Keq von Glucose und Fructose mit Phenylboronsäure bei verschiedenen pH-Werten [87, Seite 11208].
Tabelle 3: Zusammenstellung Parameter und Ergebnisse der Bindungsstudien von TPP an ABA-Toyopearl
Tabelle 4: Immobilisierungsexperimente von NH2-TBL1 und NH2-TBL2. Die Differenz der Resonanzsignale wird nach 10 min bestimmt, nachdem die Injektion von Ethanol oder Ethanolamin abgeschlossen ist.
Tabelle 5: Ergebnisse der Elementaranalyse.
Tabelle 6: Massenspektrometereinstellungen
Tabelle 7: Lamarckian-genetic-Algorithmus Parameter
Tabelle 8: Ergebnisse der Docking-Simulationen bei Verwendung des Dextranmodells.
Tabelle 9: Ergebnisse der Docking-Simulationen bei Verwendung des Silicamodells.
Tabelle 10: Konzentrationen ausgewählter Benzotriazole in verschiedenen Gewässern und Abwässern.
Tabelle 11: Verwendete Geräte.
Tabelle 12: Sonstige Geräte und Verbrauchsmaterialien.
Tabelle 13: Verwendete Chemikalien.
Tabelle 14: Verwendete, gebrauchsfertige Zubereitungen, Testkits und Trägermaterialen
Tabelle 15: Herstellerverzeichnis
11 Literaturverzeichnis [1] von Holleben, M., Pani, M., Heinemann, A.; "Medizinische Biotechnologie in
Deutschland 2011 / Biopharmazeutika: Wirtschaftsdaten und Nutzen der Personalisierten Medizin". (2011); Boston Consulting Group, München
[2] Hatti-Kaul, R.; "Downstream processing in industrial biotechnology" in Industrial Biotechnology; Soetaert, W., Vandamme, E.J. (Herausgeber); 1. Auflage (2010); Wiley-VCH, Weinheim
[3] Prasad, N.K.; Downstream Process Technology: A New Horizon in Biotechnology, 1. Auflage (2010); PHI Learning, New Dehli
[4] Jungbauer, A.; "Chromatographic media for bioseparation". Journal of Chromatography A 1065 (2005) Seite 3-12
[5] Walsh, G.; Pharmaceutical Biotechnology, 1. Auflage (2007); John Wiley & Sons, West Sussex
[6] Gabius, H.J., Siebert, H.C., Andre, S., Jimenez-Barbero, J., Rüdiger, H.; "Chemical biology of the sugar code". Chembiochem 5 (2004) Seite 740-764
[7] Nelson, D.L., Cox, M.M.; Lehninger Principles of Biochemistry, 4. Auflage (2004); Bedford, Freeman & Worth Publishing Group, New York
[8] Kren, V., Martinkova, L.; "Glycosides in medicine: The role of glycosidic residue in biological activity". Current Medicinal Chemistry 8 (2001) Seite 1303-1328
[9] Murray, R.K.; "Glycoproteins" in Harper's Illustrated Biochemistry; Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A., Rockwell, V.W. (Herausgeber); 26. Auflage (2001); The McGraw-Hill Companies, New York
[10] Brooks, S.A., Dwek, M.V., Schumacher, U.; Functional & Molecular Glycobiology, 1. Auflage (2002); BIOS Scientific Publishers, Abingdon
[11] Ambrosi, M., Cameron, N.R., Davis, B.G.; "Lectins: tools for the molecular understanding of the glycocode". Organic & Biomolecular Chemistry 3 (2005) Seite 1593-1608
[12] Lis, H., Sharon, N.; "Lectins: Carbohydrate-specific proteins that mediate cellular recognition". Chemical Reviews 98 (1998) Seite 637-674
[13] Ohtsubo, K., Marth, J.D.; "Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease". Cell 126 (2006) Seite 855-867
[14] Lindhorst, T.K.; "Struktur und Funktion von Kohlenhydraten". Chemie in Unserer Zeit 34 (2000) Seite 38-52
[15] Rudd, P.M., Elliott, T., Cresswell, P., Wilson, I.A., Dwek, R.A.; "Glycosylation and the immune system". Science 291 (2001) Seite 2370-2376
[16] Frank, C., Werber, D., Cramer, J.P., Askar, M., Faber, M., an der Heiden, M.A., Bernard, H., Fruth, A., Prager, R., Spode, A., Wadl, M., Zoufaly, A., Jordan, S., Stark, K., Krause, G.; "Epidemic profile of shiga-toxin-producing Escherichia coli O104:H4 outbreak in Germany - Preliminary report". The New England Journal of Medicine (2011) Seite 1-11
[17] Römer, W., Berland, L., Chambon, V., Gaus, K., Windschiegl, B., Tenza, D., Aly, M.R.E., Fraisier, V., Florent, J.C., Perrais, D., Lamaze, C., Raposo, G., Steinem, C., Sens, P., Bassereau, P., Johannes, L.; "Shiga toxin induces tubular membrane invaginations for its uptake into cells". Nature 450 (2007) Seite 670-675
[18] Tarr, P.I., Gordon, C.A., Chandler, W.L.; "Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome". Lancet 365 (2005) Seite 1073-1086
[19] Kalisz, H.M., Hecht, H.J., Schomburg, D., Schmid, R.D.; "Effects of carbohydrate depletion on the structure, stability and activity of glucose oxidase from Aspergillus niger". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology 1080 (1991) Seite 138-142
[20] Kalisz, H.M., Hendle, J., Schmid, R.D.; "Structural and biochemical properties of glycosylated and deglycosylated glucose oxidase from Penicillium amagasakiense". Applied Microbiology and Biotechnology 47 (1997) Seite 502-507
[21] Spiro, R.G.; "Studies on fetuin, a glycoprotein of fetal serum. 1. Isolation, chemical composition and physicochemical properties". Journal of Biological Chemistry 235 (1960) Seite 2860-2869
[22] Green, E.D., Adelt, G., Baenziger, J.U., Wilson, S., Vanhalbeek, H.; "The asparagine-linked oligosaccharides on bovine fetuin - Structural analysis of N-glycanase-released oligosaccharides by 500 MHz 1H-NMR Spectroscopy". Journal of Biological Chemistry 263 (1988) Seite 18253-18268
[23] Malthiery, Y., Lissitzky, S.; "Primary structure of human thyroglobulin deduced from the sequence of its 8448-base complementary-DNA". European Journal of Biochemistry 165 (1987) Seite 491-498
[24] Yamamoto, K., Tsuji, T., Irimura, T., Osawa, T.; "The structure of carbohydrate unit B of porcine thyroglobulin". Biochemical Journal 195 (1981) Seite 701-713
[25] Tsuji, T., Yamamoto, K., Irimura, T., Osawa, T.; "Structure of carbohydrate unit A of porcine thyroglobulin". Biochemical Journal 195 (1981) Seite 691-699
[26] Deshpande, V., Venkatesh, S.G.; "Thyroglobulin, the prothyroid hormone: Chemistry, synthesis and degradation". Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology 1430 (1999) Seite 157-178
[27] Krishnamoorthy, L., Mahal, L.K.; "Glycomic analysis: An array of technologies". Acs Chemical Biology 4 (2009) Seite 715-732
[28] Wu, A.M., Lisowska, E., Duk, M., Yang, Z.G.; "Lectins as tools in glycoconjugate research". Glycoconjugate Journal 26 (2009) Seite 899-913
[29] Rosenfeld, H., Lassen, S., Prange, A.; "Characterization of Haptoglobin in the Blood Plasma of Harbor Seals (Phoca vitulina)". Journal of Proteome Research 8 (2009) Seite 2923-2932
[30] Helmholz, H., Naatz, S., Lassen, S., Prange, A.; "Isolation of a cytotoxic glycoprotein from the Scyphozoa Cyanea lamarckii by lectin-affinity chromatography and characterization of molecule interactions by surface plasmon resonance". Journal of Chromatography B 871 (2008) Seite 60-66
[31] Rosenfeld, H., Aniulyte, J., Helmholz, H., Liesiene, J., Thiesen, P., Niemeyer, B., Prange, A.; "Comparison of modified supports on the base of glycoprotein interaction
studies and of adsorption investigations". Journal of Chromatography A 1092 (2005) Seite 76-88
[32] Cartellieri, S., Hamer, O., Helmholz, H., Niemeyer, B.; "One-step affinity purification of fetuin from fetal bovine serum". Biotechnology and Applied Biochemistry 35 (2002) Seite 83-89
[33] Helmholz, H., Cartellieri, S., He, L., Thiesen, P., Niemeyer, B.; "Process development in affinity separation of glycoconjugates with lectins as ligands". Journal of Chromatography A 1006 (2003) Seite 127-135
[34] Monzo, A., Bonn, G.K., Guttman, A.; "Lectin-immobilization strategies for affinity purification and separation of glycoproteins". Trac - Trends in Analytical Chemistry 26 (2007) Seite 423-432
[35] Madera, M., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M.V.; "High-sensitivity profiling of glycoproteins from human blood serum through multiple-lectin affinity chromatography and liquid chromatography/tandem mass spectrometry". Journal of Chromatography B 845 (2007) Seite 121-137
[36] Loris, R., Hamelryck, T., Bouckaert, J., Wyns, L.; "Legume lectin structure". Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology 1383 (1998) Seite 9-36
[37] Frenoy, J.P., Tran, A.T., Bourrillon, R.; "Structure and stability of Ricinus communis Hemagglutinin". Biochemical Journal 240 (1986) Seite 227-231
[38] Wimmerova, M., Mitchell, E., Sanchez, J.F., Gautier, C., Imberty, A.; "Crystal structure of fungal lectin - Six-bladed -propeller fold and novel fucose recognition mode for Aleuria aurantia lectin". Journal of Biological Chemistry 278 (2003) Seite 27059-27067
[39] Turkova, J.; Bioaffinity Chromatography, 1. Auflage (1993); Elsevier, Amsterdam
[40] Zopf, D., Ohlson, S.; "Weak-affinity chromatography". Nature 346 (1990) Seite 87-88
[41] Vijayalakshmi, M.A.; "Pseudobiospecific ligand affinity chromatography". Trends in Biotechnology 7 (1989) Seite 71-76
[42] Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Smith, P.K.; Immobilized Affinity Ligand Techniques, (1992); Acadamic Press, San Diego
[43] Zhang, H., Li, X.J., Martin, D.B., Aebersold, R.; "Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry". Nature Biotechnology 21 (2003) Seite 660-666
[44] Müller-Dethlefs, K., Hobza, P.; "Noncovalent interactions: A challenge for experiment and theory". Chemical Reviews 100 (2000) Seite 143-167
[45] Stone, A.J.; The Theory of Intermolecular Forces, 1. Auflage (1996); Oxford University Press, Oxford
[46] Steed, J.W., Atwood, J.L.; Supramolecular Chemistry, 2. Auflage (2009); John Wiley & Sons, West Sussex
[47] Takahashi, O., Kohno, Y., Nishio, M.; "Relevance of weak hydrogen bonds in the conformation of organic compounds and bioconjugates: Evidence from recent experimental data and high-level ab initio MO calculations". Chemical Reviews 110 (2010) Seite 6049-6076
[48] Nishio, M.; "The CH/ hydrogen bond in chemistry. Conformation, supramolecules, optical resolution and interactions involving carbohydrates". Physical Chemistry Chemical Physics 13 (2011) Seite 13873-13900
[49] Barwell, N.P., Davis, A.P.; "Substituent effects in synthetic lectins - Exploring the role of CH/ interactions in carbohydrate recognition". Journal of Organic Chemistry 76 (2011) Seite 6548-6557
[50] Cragg, P.J.; Supramolecular Chemistry: From Biological Inspiration to Biomedical Applications, 1. Auflage (2011); Springer-Verlag, Dodrecht
[51] Wedler, G.; Lehrbuch der physikalischen Chemie, 4. Auflage (1997); Wiley-VCH, Weinheim
[52] Rosenfeld, H., Peper, S., Täffner, T., Kötke, M., Fonka, M.A., Temme, H., Niemeyer, B.; "Effektive Stofftrennung in Gas- und Flüssigphase durch selektive Adsorption". Chemie Ingenieur Technik 83 (2011) Seite 1229-1236
[53] Koshland, D.E.; "Application of a theory of enzyme specificity to protein synthesis". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 44 (1958) Seite 98-104
[54] Schneider, H.J.; "Binding Mechanisms in Supramolecular Complexes". Angewandte Chemie International Edition 48 (2009) Seite 3924-3977
[55] Sharon, N., Lis, H.; "Lectins - Cell-agglutinating and sugar-specific proteins". Science 177 (1972) Seite 949-959
[56] Lee, R.T., Lee, Y.C.; "Affinity enhancement by multivalent lectin-carbohydrate interaction". Glycoconjugate Journal 17 (2000) Seite 543-551
[57] Naismith, J.H., Field, R.A.; "Structural basis of trimannoside recognition by concanavalin A". Journal of Biological Chemistry 271 (1996) Seite 972-976
[58] Gohlke, H., Klebe, G.; "Approaches to the description and prediction of the binding affinity of small-molecule ligands to macromolecular receptors". Angewandte Chemie International Edition 41 (2002) Seite 2645-2676
[59] Steed, J.W., Atwood, J.L.; Supramolecular Chemistry, Second Edition (2009); John Wiley & Sons, Ltd., West Sussex
[60] Klein, E., Ferrand, Y., Barwell, N.P., Davis, A.P.; "Solvent effects in carbohydrate binding by synthetic receptors: Implications for the role of water in natural carbohydrate recognition". Angewandte Chemie International Edition 47 (2008) Seite 2693-2696
[61] Davis, A.P., James, T.D.; "Carbohydrate receptors" in Functional Synthetic Receptors; Schrader, T., Hamilton, A.D. (Herausgeber); Seite 45-109; 1. Auflage (2005); Wiley-VCH, Weinheim
[62] Liu, X.C., Scouten, W.H.; "Boronate affinity chromatography". Methods in Molecular Biology 147 (2000) Seite 119-128
[63] Liu, X.C.; "Boronic acids as ligands for affinity chromatography". Chinese Journal of Chromatography 24 (2006) Seite 73-80
[64] Kuivila, H.G., Keough, A.H., Soboczenski, E.J.; "Areneboronates from diols and polyols". Journal of Organic Chemistry 19 (1954) Seite 780-783
[65] Lorand, J.P., Edwards, J.O.; "Polyol complexes and structure of the benzeneboronate ion". Journal of Organic Chemistry 24 (1959) Seite 769-774
[66] Wiberg, N.; Lehrbuch der Anorganischen Chemie, 101. Auflage (1995); de Gruyter, Berlin
[67] Jin, S., Cheng, Y.F., Reid, S., Li, M.Y., Wang, B.H.; "Carbohydrate recognition by boronolectins, small molecules, and lectins". Medicinal Research Reviews 30 (2010) Seite 171-257
[68] James, T.D.; "Boronic acid-based receptors and sensors for saccharides" in Boronic Acids; Hall, D.G. (Herausgeber); Seite 441-479; 1. Auflage (2005); Wiley-VCH, Weinheim
[69] Singhal, R.P., Desilva, S.S.M.; "Boronate affinity chromatography". Advances in Chromatography 31 (1992) Seite 293-335
[70] Glad, M., Ohlson, S., Hansson, L., Mansson, M.O., Mosbach, K.; "High-Performance Liquid Affinity-Chromatography of Nucleosides, Nucleotides and Carbohydrates with Boronic Acid-Substituted Microparticulate Silica". Journal of Chromatography 200 (1980) Seite 254-260
[71] Elliger, C.A., Chan, B.G., Stanley, W.L.; "p-Vinylbenzeneboronic acid polymers for separation of vicinal diols". Journal of Chromatography A 104 (1975) Seite 57-61
[72] Çiçek, H.; "Nucleotide isolation by boronic acid functionalized hydrogel beads". Journal of Bioactive and Compatible Polymers 20 (2005) Seite 245-257
[73] Higa, S., Suzuki, T., Hayashi, A., Tsuge, I., Yamamura, Y.; "Isolation of catecholamines in biological fluids by boric acid gel". Analytical Biochemistry 77 (1977) Seite 18-24
[74] Bongartz, D., Hesse, A.; "Selective extraction of quercetrin in vegetable drugs and urine by off-line coupling of boronic acid affinity chromatography and high performance liquid chromatography". Journal of Chromatography B 673 (1995) Seite 223-230
[75] Higa, S., Kishimoto, S.; "Isolation of 2-hydroxycarboxylic acids with a boronate affinity gel". Analytical Biochemistry 154 (1986) Seite 71-74
[76] Hansson, C., Agrup, G., Rorsman, H., Rosengren, A.M., Rosengren, E.; "Chromatographic separation of catecholic amino acids and catecholamines on immobilized phenylboronic acid". Journal of Chromatography A 161 (1978) Seite 352-355
[77] Schott, H., Rudloff, E., Schmidt, P., Roychoudhury, R., Kossel, H.; "Dihydroxyboryl-Substituted Methacrylic Polymer for Column Chromatographic Separation of Mononucleotides, Oligonucleotides, and Transfer Ribonucleic-Acid". Biochemistry 12 (1973) Seite 932-938
[78] Ackerman, S., Cool, B., Furth, J.J.; "Removal of DNA from RNA by chromatography on acetylated N-[N'-(m-Dihydroxylborylphenyl)Succinamyl]aminoethyl cellulose". Analytical Biochemistry 100 (1979) Seite 174-178
[79] Zanette, D., Soffientini, A., Sottani, C., Sarubbi, E.; "Evaluation of phenylboronate agarose for industrial-scale purification of erythropoietin from mammalian cell cultures". Journal of Biotechnology 101 (2003) Seite 275-287
[80] Preinerstorfer, B., Lämmerhofer, M., Lindner, W.; "Synthesis and application of novel phenylboronate affinity materials based on organic polymer particles for selective trapping of glycoproteins". Journal of Separation Science 32 (2009) Seite 1673-1685
[81] Suksrichavalit, T., Yoshimatsu, K., Prachayasittikul, V., Bülow, L., Ye, L.; "Clickable affinity ligands for effective separation of glycoproteins". Journal of Chromatography A 1217 (2010) Seite 3635-3641
[82] Li, Y.C., Pfüller, U., Larsson, E.L., Jungvid, H., Galaev, I.Y., Mattiasson, B.; "Separation of mistletoe lectins based on the degree of glycosylation using boronate affinity chromatography". Journal of Chromatography A 925 (2001) Seite 115-121
[83] Clarke, W., Hage, D.S.; "Clinical applications of affinity chromatography". Separation and Purification Reviews 32 (2003) Seite 19-60
[84] James, T.D., Phillips, M.D., Shinkai, S.; Boronic acids in saccharide recognition, 1. Auflage (2006); RSC Publishing, Cambridge
[85] Bosch, L.I., Fyles, T.M., James, T.D.; "Binary and ternary phenylboronic acid complexes with saccharides and Lewis bases". Tetrahedron 60 (2004) Seite 11175-11190
[86] Springsteen, G., Wang, B.H.; "A detailed examination of boronic acid-diol complexation". Tetrahedron 58 (2002) Seite 5291-5300
[87] Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B.H.; "The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols - It is not as simple as it appears". Tetrahedron 60 (2004) Seite 11205-11209
[88] Myöhänen, T.A., Bouriotis, V., Dean, P.D.; "Affinity chromatography of yeast -glucosidase using ligand-mediated chromatography on immobilized phenylboronic acids". Biochemical Journal 197 (1981) Seite 683-688
[89] Liu, X.C., Scouten, W.H.; "Studies on oriented and reversible immobilization of glycoprotein using novel boronate affinity gel". Journal of Molecular Recognition 9 (1996) Seite 462-467
[90] Adamek, V., Liu, X.C., Zhang, Y.A., Adamkova, K., Scouten, W.H.; "New aliphatic boronate ligands for affinity chromatography". Journal of Chromatography A 625 (1992) Seite 91-99
[91] Liu, X.C., Scouten, W.H.; "New ligands for boronate affinity chromatography". Journal of Chromatography A 687 (1994) Seite 61-69
[92] Singhal, R.P., Ramamurthy, B., Govindraj, N., Sarwar, Y.; "New ligands for boronate affinity chromatography - Synthesis and properties". Journal of Chromatography A 543 (1991) Seite 17-38
[93] Wen, Z.Z., Niemeyer, B.; "Evaluation of two different concanavalin A affinity adsorbents for the adsorption of glucose oxidase". Journal of Chromatography B 857 (2007) Seite 149-157
[94] Hirayama, K., Akashi, S., Furuya, M., Fukuhara, K.; "Rapid confirmation and revision of the primary structure of bovine serum albumin by ESI-MS and Frit-FAB LC/MS". Biochemical and Biophysical Research Communications 173 (1990) Seite 639-646
[95] Brena, B.M., Batistaviera, F., Ryden, L., Porath, J.; "Selective adsorption of immunoglobulins and glucosylated proteins on phenylboronate agarose". Journal of Chromatography A 604 (1992) Seite 109-115
[96] Liu, S.Q., Bakovic, L., Chen, A.C.; "Specific binding of glycoproteins with poly(aniline boronic acid) thin film". Journal of Electroanalytical Chemistry 591 (2006) Seite 210-216
[97] Hasson, M.S., Muscate, A., Henehan, G.T.M., Guidinger, P.F., Petsko, G.A., Ringe, D., Kenyon, G.L.; "Purification and crystallization of benzoylformate decarboxylase". Protein Science 4 (1995) Seite 955-959
[98] Hasson, M.S., Muscate, A., McLeish, M.J., Polovnikova, L.S., Gerlt, J.A., Kenyon, G.L., Petsko, G.A., Ringe, D.; "The crystal structure of benzoylformate decarboxylase at 1.6 Å resolution: Diversity of catalytic residues in thiamin diphosphate-dependent enzymes". Biochemistry 37 (1998) Seite 9918-9930
[99] Iding, H., Siegert, P., Mesch, K., Pohl, M.; "Application of alpha-keto acid decarboxylases in biotransformations". Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology 1385 (1998) Seite 307-322
[100] Ward, O.P., Singh, A.; "Enzymatic asymmetric synthesis by decarboxylases". Current Opinion in Biotechnology 11 (2000) Seite 520-526
[101] Sukumaran, J., Hanefeld, U.; "Enantioselective C-C bond synthesis catalysed by enzymes". Chem. Soc. Rev. 34 (2005) Seite 530-542
[102] Siegert, P., McLeish, M.J., Baumann, M., Iding, H., Kneen, M.M., Kenyon, G.L., Pohl, M.; "Exchanging the substrate specificities of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis and benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida". Protein Engineering Design & Selection 18 (2005) Seite 345-357
[103] Wilcocks, R., Ward, O.P., Collins, S., Dewdney, N.J., Hong, Y.P., Prosen, E.; "Acyloin formation by benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida". Applied and Environmental Microbiology 58 (1992) Seite 1699-1704
[104] Wilcocks, R., Ward, O.P.; "Factors affecting 2-hydroxypropiophenone formation by benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida". Biotechnology and Bioengineering 39 (1992) Seite 1058-1063
[105] Weiss, P.M., Garcia, G.A., Kenyon, G.L., Cleland, W.W., Cook, P.F.; "Kinetics and mechanism of benzoylformate decarboxylase using 13C and solvent deuterium-isotope effects on benzoylformate and benzoylformate analogues". Biochemistry 27 (1988) Seite 2197-2205
[106] Iding, H., Dünnwald, T., Greiner, L., Liese, A., Müller, M., Siegert, P., Grötzinger, J., Demir, A.S., Pohl, M.; "Benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas putida as stable catalyst for the synthesis of chiral 2-hydroxy ketones". Chemistry - A European Journal 6 (2000) Seite 1483-1495
[107] Pohl, M., Siegert, P., Mesch, K., Bruhn, H., Grötzinger, J.; "Active site mutants of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis - A site-directed mutagenesis study of L112, I472, I476, E473 and N482". European Journal of Biochemistry 257 (1998) Seite 538-546
[108] Maestas, R.R., Prieto, J.R., Kuehn, G.D., Hageman, J.H.; "Polyacrylamide-boronate beads saturated with biomolecules - New general support for affinity chromatography of enzymes". Journal of Chromatography A 189 (1980) Seite 225-231
[109] Matsuura, A., Iwashima, A., Nose, Y.; "Purification of thiamine-binding protein from Escherichia coli by affinity chromatography". Biochemical and Biophysical Research Communications 51 (1973) Seite 241-246
[110] Muniyappa, K., Adiga, P.R.; "Isolation and characterization of thiamin-binding protein from chicken egg white". Biochemical Journal 177 (1979) Seite 887-894
[111] Obrien, T.A., Schrock, H.L., Russell, P., Blake, R., Gennis, R.B.; "Preparation of Escherichia coli pyruvate oxidase utilizing a thiamine pyrophosphate affinity column". Biochimica et Biophysica Acta - Enzymology 452 (1976) Seite 13-29
[112] Lopez-de-Alba, P.L., Lopez-Martinez, L., Cerda, V., Amador-Hernandez, J.; "Simultaneous determination and classification of riboflavin, thiamine, nicotinamide and pyridoxine in pharmaceutical formulations, by UV-visible spectrophotometry and multivariate analysis". Journal of the Brazilian Chemical Society 17 (2006) Seite 715-722
[113] Dwivedi, B.K., Arnold, R.G.; "Chemistry of thiamine degradation in food products and model systems: A review". Journal of Agricultural and Food Chemistry 21 (1973) Seite 54-60
[114] Farrer, K.T.H.; "The thermal destruction of vitamin B1. 1. The influence of buffer salts on the rate of destruction of aneurin at 100 °C". Biochemical Journal 39 (1945) Seite 128-132
[115] Gold, K.; "Some factors affecting stability of thiamine". Limnology and Oceanography 13 (1968) Seite 185-188
[116] O’Brien, T.A., Schrock, H.L., Russell, P., Blake, R., Gennis, R.B.; "Preparation of Escherichia coli pyruvate oxidase utilizing a thiamine pyrophosphate affinity column". Biochimica et Biophysica Acta - Enzymology 452 (1976) Seite 13-29
[117] Hesse, M., Meier, H., Zeeh, B.; Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie, 7. Auflage (2002); Georg Thieme Verlag, Stuttgart
[118] Lachmann, H., Schnackerz, K.D.; "P-31 nuclear magnetic resonance titrations - Simultaneous evaluation of all pH-dependent resonance signals". Organic Magnetic Resonance 22 (1984) Seite 101-105
[119] Chauvet-Monges, A.M., Hadida, M., Crevat, A., Vincent, E.J.; "Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance study of the thiamine diphosphate-magnesium interaction". Archives of Biochemistry and Biophysics 207 (1981) Seite 311-315
[120] Berger, S., Braun, S., Kalinowski, H.-O.; 31P-NMR-Spektroskopie, 1. Auflage (1993); Georg Thieme Verlag, Stuttgart
[121] Cohn, M., Hughes, T.R.; "Phosphorus magnetic resonance spectra of adenosine diphosphate and triphosphate.1. Effect of pH". Journal of Biological Chemistry 235 (1960) Seite 3250-3253
[122] Itokawa, Y., Kimura, M., Nishino, K.; "Thiamin-binding proteins". Annals of the New York Academy of Sciences 378 (1982) Seite 327-336
[123] Griffith, T.W., Leach, F.R.; "Effect of osmotic shock on vitamin transport in Escherichia coli". Archives of Biochemistry and Biophysics 159 (1973) Seite 658-663
[124] Mitsunaga, T., Matsuda, M., Shimizu, M., Iwashima, A.; "Isolation and properties of a thiamine-binding protein from buckwheat seed". Cereal Chemistry 63 (1986) Seite 332-335
[125] Muniyappa, K., Adiga, P.R.; "Nature of the thiamin-binding protein from chicken egg yolk". Biochemical Journal 193 (1981) Seite 679-685
[126] Nishimune, T., Hayashi, R.; "Thiamine-binding protein and thiamine uptake by Escherichia coli". Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects 244 (1971) Seite 573-583
[127] Nishimura, H., Uehara, Y., Sempuku, K., Iwashima, A.; "Purification and some properties of thiamine-binding protein from rice bran". Journal of Nutritional Science and Vitaminology 30 (1984) Seite 1-10
[128] Bradford, M.M.; "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding". Analytical Biochemistry 72 (1976) Seite 248-254
[129] Obrien, T.A., Schrock, H.L., Russell, P., Blake, R., Gennis, R.B.; "Preparation of Escherichia coli pyruvate oxidase utilizing a thiamine pyrophosphate affinity column". Biochimica et Biophysica Acta - Enzymology 452 (1976) Seite 13-29
[130] Kötke, M., Rosenfeld, H., Peper, S., Niemeyer, B.; "Comparison of purification efficiencies of different affinity separation techniques". The Open Analytical Chemistry Journal 4 (2010) Seite 27-34
[131] Lowe, C.R., Dean, P.D.; Affinity Chromatography, 1. Auflage (1974); John Wiley & Sons, London
[132] Xia, F., Nagrath, D., Cramer, S.M.; "Effect of pH changes on water release values in hydrophobic interaction chromatographic systems". Journal of Chromatography A 1079 (2005) Seite 229-235
[133] Walker, D.B., Joshi, G., Davis, A.P.; "Progress in biomimetic carbohydrate recognition". Cellular and Molecular Life Sciences 66 (2009) Seite 3177-3191
[134] Davis, A.P.; "Synthetic lectins". Organic & Biomolecular Chemistry 7 (2009) Seite 3629-3638
[135] Kubik, S.; "Synthetic lectins". Angewandte Chemie International Edition 48 (2009) Seite 1722-1725
[136] Mazik, M., Cavga, H.; "Carboxylate-based receptors for the recognition of carbohydrates in organic and aqueous media". Journal of Organic Chemistry 71 (2006) Seite 2957-2963
[137] Ferrand, Y., Crump, M.P., Davis, A.P.; "A synthetic lectin analog for biomimetic disaccharide recognition". Science 318 (2007) Seite 619-622
[138] Ferrand, Y., Klein, E., Barwell, N.P., Crump, M.P., Jimenez-Barbero, J., Vicent, C., Boons, G.J., Ingale, S., Davis, A.P.; "A synthetic lectin for O-linked -N-acetylglucosamine". Angewandte Chemie International Edition 48 (2009) Seite 1775-1779
[139] Mazik, M.; "Molecular recognition of carbohydrates by acyclic receptors employing noncovalent interactions". Chemical Society Reviews 38 (2009) Seite 935-956
[140] Gupta, G., Lowe, C.R.; "An artificial receptor for glycoproteins". Journal of Molecular Recognition 17 (2004) Seite 218-235
[141] Palanisamy, U.D., Hussain, A., Iqbal, S., Sproule, K., Lowe, C.R.; "Design, synthesis and characterisation of affinity ligands for glycoproteins". Journal of Molecular Recognition 12 (1999) Seite 57-66
[142] Palanisamy, U.D., Winzor, D.J., Lowe, C.R.; "Synthesis and evaluation of affinity adsorbents for glycoproteins: an artificial lectin". Journal of Chromatography B 746 (2000) Seite 264-281
[143] Palanisamy, U.D., Lowe, C.R.; "Characterisation of glycoprotein ligands synthesised using solid-phase combinatorial chemistry". Journal of Chromatography A 1075 (2005) Seite 95-102
[144] Lowe, C.R.; "Combinatorial approaches to affinity chromatography". Current Opinion in Chemical Biology 5 (2001) Seite 248-256
[145] Linhult, M., Gülich, S., Hober, S.; "Affinity ligands for industrial protein purification". Protein and Peptide Letters 12 (2005) Seite 305-310
[146] Lowe, C.R., Lowe, A.R., Gupta, G.; "New developments in affinity chromatography with potential application in the production of biopharmaceuticals". Journal of Biochemical and Biophysical Methods 49 (2001) Seite 561-574
[147] Dean, P.D., Watson, D.H.; "Protein purification using immobilised triazine dyes". Journal of Chromatography A 165 (1979) Seite 301-319
[148] Labrou, N., Clonis, Y.D.; "The affinity technology in downstream processing". Journal of Biotechnology 36 (1994) Seite 95-119
[149] Denizli, A., Piskin, E.; "Dye-ligand affinity systems". Journal of Biochemical and Biophysical Methods 49 (2001) Seite 391-416
[150] Small, D.A.P., Atkinson, T., Lowe, C.R.; "Preparative high performance liquid affinity chromatography". Journal of Chromatography A 266 (1983) Seite 151-156
[151] Anspach, F.B., Unger, K.K., Davies, J., Hearn, M.T.W.; "Affinity chromatography with triazine dyes immobilized onto activated non-porous monodisperse silicas". Journal of Chromatography A 457 (1988) Seite 195-204
[152] Curling, J.; "Affinity chromatography - From textile dyes to synthetic ligands by design, Part I". Biopharm International 15 (2004) Seite 50-55
[153] Lowe, C.R., Burton, S.J., Burton, N., Stewart, D.J., Purvis, D.R., Pitfield, I., Eapen, S.; "New developments in affinity chromatography". Journal of Molecular Recognition 3 (1990) Seite 117-122
[154] Clonis, Y.D., Labrou, N.E., Kotsira, V.P., Mazitsos, C., Melissis, S., Gogolas, G.; "Biomimetic dyes as affinity chromatography tools in enzyme purification". Journal of Chromatography A 891 (2000) Seite 33-44
[155] Lindner, N.M., Jeffcoat, R., Lowe, C.R.; "Design and applications of biomimetic anthraquinone dyes - Purification of calf intestinal alkaline phosphatase with immobilized terminal ring analogs of CI Reactive Blue-2". Journal of Chromatography A 473 (1989) Seite 227-240
[156] Clonis, Y.D., Lowe, C.R.; "Monosized adsorbents for high performance affinity chromatography - Application to the purification of calf intestinal alkaline phosphatase and human urine urokinase". Journal of Chromatography A 540 (1991) Seite 103-111
[157] Teng, S.F., Sproule, K., Hussain, A., Lowe, C.R.; "A strategy for the generation of biomimetic ligands for affinity chromatography. Combinatorial synthesis and biological evaluation of an IgG binding ligand". Journal of Molecular Recognition 12 (1999) Seite 67-75
[158] Teng, S.F., Sproule, K., Hussain, A., Lowe, C.R.; "Affinity chromatography on immobilized "biomimetic" ligands. Synthesis, immobilization and chromatographic assessment of an immunoglobulin G-binding ligand". Journal of Chromatography B 740 (2000) Seite 1-15
[159] Surolia, A., Pain, D., Khan, M.I.; "Protein A: Nature's universal anti-antibody". Trends in Biochemical Sciences 7 (1982) Seite 74-76
[160] Platis, D., Maltezos, A., Ma, J.K.C., Labrou, N.E.; "Combinatorial de novo design and application of a biomimetic affinity ligand for the purification of human anti-HIV mAb 4E10 from transgenic tobacco". Journal of Molecular Recognition 22 (2009) Seite 415-424
[161] Clonis, Y.D.; "Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop". Journal of Chromatography A 1101 (2006) Seite 1-24
[162] Blotny, G.; "Recent applications of 2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine and its derivates in organic synthesis". Tetrahedron 62 (2006) Seite 9507-9522
[163] Vollhardt, K.P.C., Schore, N.E.; Organische Chemie, 3. Auflage (2000); Wiley-VCH, Weinheim
[164] Brückner, R.; Reaktionsmechanismen, 2. Auflage (2003); Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg
[165] Alekseeva, N.V., Yakhontov, L.N.; "Reactions of pyridines, pyrimidines and 1,3,5-triazines under the nucleophilic reagent effect". Russian Chemical Reviews 59 (1990) Seite 514-530
[166] Hollink, E., Simanek, E.E., Bergbreiter, D.E.; "Strategies for protecting and manipulating triazine derivates". Tetrahedron Letters 46 (2005) Seite 2005-2006
[167] Li, R.X., Dowd, V., Stewart, D.J., Burton, S.J., Lowe, C.R.; "Design, synthesis, and application of a protein A mimetic". Nature Biotechnology 16 (1998) Seite 190-195
[168] Bächle, D.; "Cyclische Peptide als Glycomimetika für die L2/HNK-1-Erkennungssequenz: Synthese und Oberflächenplasmonresonanzstudien". (2004) Dissertation Universität Bielefeld
[169] Kittel, C.; Einführung in die Festkörperphysik, 12. Auflage (2002); Oldenbourg-Verlag, München
[170] Barnes, W.L., Dereux, A., Ebbesen, T.W.; "Surface plasmon subwavelength optics". Nature 424 (2003) Seite 824-830
[171] Homola, J., Yef, S., Myszka, D.; "Surface Plasmon Resonance Biosensors" in Optical Biosensors: Present & Future; Ligler, F., Taitt, C. (Herausgeber); 1. Auflage (2002); Elsevier, Amsterdam
[172] Kretschmann, E., Raether, H.; "Radiative decay of non radiative surface plasmons excited by light". Zeitschrift für Naturforschung Teil A: Astrophysik Physik und Physikalische Chemie 23 (1968) Seite 2135-2136
[173] Nagata, K., Handa, H.; Real-Time Analysis of Biomolecular Interactions, 1. Auflage (2007); Springer, Tokyo
[174] Stenberg, E., Persson, B., Roos, H., Urbaniczky, C.; "Quantitative determination of surface concentration of protein with surface plasmon resonance using radiolabeled proteins". Journal of Colloid and Interface Science 143 (1991) Seite 513-526
[175] Biacore 3000, Instrument Handbook, Ausgabe Mai 2007 (2007);
[176] Jason-Moller, L., Murphy, M., Bruno, J.; "Overview of Biacore systems and their applications". Current Protocols in Protein Science 19 (2006) Seite 19.13.1-19.13.14
[177] Löfås, S., Johnsson, B.; "A novel hydrogel matrix on gold surfaces in surface plasmon resonance sensors for fast and efficient covalent immobilization of ligands". Journal of the Chemical Society - Chemical Communications (1990) Seite 1526-1528
[178] Homola, J.; "Surface plasmon resonance sensors for detection of chemical and biological species". Chemical Reviews 108 (2008) Seite 462-493
[179] Cannon, M.J., Myszka, D.G., Bagnato, J.D., Alpers, D.H., West, F.G., Grissom, C.B.; "Equilibrium and kinetic analyses of the interactions between vitamin B-12 binding proteins and cobalamins by surface plasmon resonance". Analytical Biochemistry 305 (2002) Seite 1-9
[180] Samsonova, J.V., Uskova, N.A., Andresyuk, A.N., Franek, M., Elliott, C.T.; "Biacore biosensor immunoassay for 4-nonylphenols: Assay optimization and applicability for shellfish analysis". Chemosphere 57 (2004) Seite 975-985
[181] Svedhem, S., Enander, K., Karlsson, M., Sjöbom, H., Liedberg, B., Löfås, S., Mårtensson, L.G., Sjöstrand, S.E., Svensson, S., Carlsson, U., Lundström, I.; "Subtle differences in dissociation rates of interactions between destabilized human carbonic anhydrase II mutants and immobilized benzenesulfonamide inhibitors probed by a surface plasmon resonance biosensor". Analytical Biochemistry 296 (2001) Seite 188-196
[182] Becker, H.G.O., Beckert, R., Domschke, G., Fanghänel, E., Habicher, W.D., Metz, P., Pavel, D., Schwetlick, K.; Organikum, 21. Auflage (2000); Wiley-VCH, Weinheim
[183] Johnsson, B., Löfås, S., Lindquist, G.; "Immobilization of proteins to a carboxymethyldextran-modified gold surface for biospecific interaction analysis in surface plasmon resonance sensors". Analytical Biochemistry 198 (1991) Seite 268-277
[184] Thiesen, P.H., Jansen, J., Rosenfeld, H., Niemeyer, B.; "Surface modification with epoxy- and thiolgroups - a modular construction system". Proceedings of the 42nd Meeting of the German Colloid Society, Aachen (2005) Seite L47B
[185] Radi, S., Attayibat, A., Ramdani, A., Bacquet, M.; "Synthesis and characterization of novel silica gel supported N-pyrazole ligand for selective elimination of Hg(II)". European Polymer Journal 44 (2008) Seite 3163-3168
[186] Lowe, C.R., Glad, M., Larsson, P.O., Ohlson, S., Small, D.A.P., Atkinson, T., Mosbach, K.; "High performance liquid affinity chromatography of proteins on cibacron blue F3G-A bonded silica". Journal of Chromatography A 215 (1981) Seite 303-316
[187] Zhuravlev, L.T.; "Characterization of amorphous silica surface". Reaction Kinetics and Catalysis Letters 50 (1993) Seite 15-25
[188] Unger, K.K.; Porous Silica, 4. Auflage (1994); Elsevier, Amsterdam
[189] Verzele, M., Mussche, P., Sandra, P.; "Characterization of high-performance liquid-chromatographic stationary phases - The nature of silica-gel bonded material". Journal of Chromatography A 190 (1980) Seite 331-337
[190] Halket, J.M., Zaikin, V.G.; "Derivatization in mass spectrometry - 1. Silylation". European Journal of Mass Spectrometry 9 (2003) Seite 1-21
[191] Little, J.L.; "Artifacts in trimethylsilyl derivatization reactions and ways to avoid them". Journal of Chromatography A 844 (1999) Seite 1-22
[192] Murray, R.K.; "Plasma Proteins & Immunoglobulins" in Harper's Illustrated Biochemistry; Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A., Rockwell, V.W. (Herausgeber); 26. Auflage (2003); The McGraw-Hill Companies, New York
[193] Mohammad, J., Zeerak, A., Hjerten, S.; "Dye-ligand affinity-chromatography on continuous beds". Biomedical Chromatography 9 (1995) Seite 80-84
[194] Reichardt, C.; Solvents and Solvent Effects in Organic Chemistry, 3. Auflage (2004); Wiley-VCH, Weinheim
[195] Rogatsky, E., Jayatillake, H., Goswami, G., Tomuta, V., Stein, D.; "Sensitive LC MS quantitative analysis of carbohydrates by Cs+ attachment". Journal of the American Society for Mass Spectrometry 16 (2005) Seite 1805-1811
[196] Kohler, M., Leary, J.A.; "LC/MS/MS of carbohydrates with postcolumn addition of metal chlorides using a triaxial electrospray probe". Analytical Chemistry 67 (1995) Seite 3501-3508
[197] Mazik, M.; "Design of lectin mimetics". Chembiochem 9 (2008) Seite 1015-1017
[198] Mazik, M., Buthe, A.C.; "Recognition properties of receptors based on dimesitylmethane-derived core: Di- vs. monosaccharide preference". Organic & Biomolecular Chemistry 7 (2009) Seite 2063-2071
[199] Mazik, M., Buthe, A.C.; "Highly effective receptors showing di- vs. monosaccharide preference". Organic & Biomolecular Chemistry 6 (2008) Seite 1558-1568
[200] Mazik, M., Cavga, H.; "Carboxylate-Based Receptors for the Recognition of Carbohydrates in Organic and Aqueous Media". Journal of Organic Chemistry 71 (2006) Seite 2957-2963
[201] Giles, C.H., MacEwan, T.H., Nakwha, S.N., Smith, D.; "A system of classification of solution adsorption isotherms, and its use in diagnosis of adsorption mechanisms and it measurement of specific surface areas of solids". Journal of the Chemical Society (1960) Seite 3973-3993
[202] Mattiasson, B.; "Affinity immobilization". Methods in Enzymology 137 (1988) Seite 647-656
[203] Duverger, E., Frison, N., Roche, A.C., Monsigny, M.; "Carbohydrate-lectin interactions assessed by surface plasmon resonance". Biochimie 85 (2003) Seite 167-179
[204] Leach, A.R.; Molecular modelling - Principles and applications, 2. Auflage (2001); Pearson Education, Harlow
[205] Klebe, G.; Wirkstoffdesign, 2. Auflage (2009); Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg
[206] Duan, S.F., Jana, R., Tunge, J.A.; "Lewis acid-catalyzed diastereoselective hydroarylation of benzylidene malonic esters". Journal of Organic Chemistry 74 (2009) Seite 4612-4614
[207] Taylor, R., Kennard, O.; "Hydrogen-bond geometry in organic crystals". Accounts of Chemical Research 17 (1984) Seite 320-326
[208] Stewart, J.J.P.; "Optimization of parameters for semiempirical methods. 1. Method". Journal of Computational Chemistry 10 (1989) Seite 209-220
[209] Stewart, J.J.P.; "MOPAC: A semiempirical molecular-orbital program". Journal of Computer-Aided Molecular Design 4 (1990) Seite 1-45
[210] Morris, G.M., Goodsell, D.S., Huey, R., Olson, A.J.; "Distributed automated docking of flexible ligands to proteins: Parallel applications of AutoDock 2.4". Journal of Computer-Aided Molecular Design 10 (1996) Seite 293-304
[211] Morris, G.M., Goodsell, D.S., Halliday, R.S., Huey, R., Hart, W.E., Belew, R.K., Olson, A.J.; "Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function". Journal of Computational Chemistry 19 (1998) Seite 1639-1662
[212] Wohlfahrt, G., Witt, S., Hendle, J., Schomburg, D., Kalisz, H.M., Hecht, H.J.; "1.8 and 1.9 Å resolution structures of the Penicillium amagasakiense and Aspergillus niger glucose oxidases as a basis for modelling substrate complexes". Acta Crystallographica D - Biological Crystallography 55 (1999) Seite 969-977
[213] Kalisz, H.M., Hecht, H.J., Schomburg, D., Schmid, R.D.; "Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a deglycosylated glucose oxidase from Aspergillus niger". Journal of Molecular Biology 213 (1990) Seite 207-209
[214] Allen, M.P., Frenkel, D., Talbot, J.; "Molecular-dynamics simulation using hard particles". Computer Physics Reports 9 (1989) Seite 301-353
[215] Konidala, P., Niemeyer, B.; "Molecular dynamics simulations of pea (Pisum sativum) lectin structure with octyl glucoside detergents: The ligand interactions and dynamics". Biophysical Chemistry 128 (2007) Seite 215-230
[216] Neumann, D., Kohlbacher, O., Lenhof, H.P., Lehr, C.M.; "Lectin-sugar interaction - Calculated versus experimental binding energies". European Journal of Biochemistry 269 (2002) Seite 1518-1524
[217] Adam, J., Kriz, Z., Prokop, M., Wimmerova, M., Koca, J.; "In silico mutagenesis and docking studies of Pseudomonas aeruginosa PA-IIL lectin - Predicting binding modes and energies". Journal of Chemical Information and Modeling 48 (2008) Seite 2234-2242
[218] Nurisso, A., Kozmon, S., Imberty, A.; "Comparison of docking methods for carbohydrate binding in calcium-dependent lectins and prediction of the carbohydrate binding mode to sea cucumber lectin CEL-III". Molecular Simulation 34 (2008) Seite 469-479
[219] Huey, R., Morris, G.M., Olson, A.J., Goodsell, D.S.; "A semiempirical free energy force field with charge-based desolvation". Journal of Computational Chemistry 28 (2007) Seite 1145-1152
[220] Muraki, M.; "The importance of CH/ interactions to the function of carbohydrate binding proteins". Protein and Peptide Letters 9 (2002) Seite 195-209
[221] Takahashi, O., Kohno, Y., Iwasaki, S., Saito, K., Iwaoka, M., Tomoda, S., Umezawa, Y., Tsuboyama, S., Nishio, M.; "Hydrogen-bond-like nature of the CH/ interaction as evidenced by crystallographic database analyses and ab initio molecular orbital calculations". Bulletin of the Chemical Society of Japan 74 (2001) Seite 2421-2430
[222] Kiess, M., Hecht, H.J., Kalisz, H.M.; "Glucose oxidase from Penicillium amagasakiense - Primary structure and comparison with other glucose-methanol-choline (GMC) oxidoreductases". European Journal of Biochemistry 252 (1998) Seite 90-99
[223] Richardson, S.D.; "Environmental mass spectrometry: Emerging contaminants and current issues". Analytical Chemistry 82 (2010) Seite 4742-4774
[224] Müller, H.; "Spurenanalyse - Sinn und Nutzen". Akademie-Journal 1 (2003) Seite 31-37
[225] Theobald, N., Loewe, P.; "System Nordsee - Zustand 2005 im Kontext langzeitlicher Entwicklungen". in Berichte des BSH, Nr. 44, Bundesamt für Seeschifffahrt und Hydrographie (2009) Hamburg
[226] Vrana, B., Mills, G.A., Allan, I.J., Dominiak, E., Svensson, K., Knutsson, J., Morrison, G., Greenwood, R.; "Passive sampling techniques for monitoring pollutants in water". Trends in Analytical Chemistry 24 (2005) Seite 845-868
[227] Lindenmayer, D.B., Likens, G.E.; "Adaptive monitoring: a new paradigm for long-term research and monitoring". Trends in Ecology & Evolution 24 (2009) Seite 482-486
[228] la Farre, M., Perez, S., Kantiani, L., Barcelo, D.; "Fate and toxicity of emerging pollutants, their metabolites and transformation products in the aquatic environment". Trends in Analytical Chemistry 27 (2008) Seite 991-1007
[229] Pillard, D.A., Cornell, J.S., Dufresne, D.L., Hernandez, M.T.; "Toxicity of benzotriazole and benzotriazole derivatives to three aquatic species". Water Research 35 (2001) Seite 557-560
[230] Giger, W., Schaffner, C., Kohler, H.P.E.; "Benzotriazole and tolyltriazole as aquatic contaminants. 1. Input and occurrence in rivers and lakes". Environmental Science & Technology 40 (2006) Seite 7186-7192
[231] Reemtsma, T., Miehe, U., Duennbier, U., Jekel, M.; "Polar pollutants in municipal wastewater and the water cycle: Occurrence and removal of benzotriazoles". Water Research 44 (2010) Seite 596-604
[232] Weiss, S., Jakobs, J., Reemtsma, T.; "Discharge of three benzotriazole corrosion inhibitors with municipal wastewater and improvements by membrane bioreactor treatment and ozonation". Environmental Science & Technology 40 (2006) Seite 7193-7199
[233] Wolfbeis, O.S.; "Chemical sensors - survey and trends". Fresenius Journal of Analytical Chemistry 337 (1990) Seite 522-527
[234] Gründler, P.; Chemische Sensoren - Eine Einführung für Naturwissenschaftler und Ingenieure, 1. Auflage (2004); Springer-Verlag, Berlin
[235] Horwitz, W.; "Evaluation of analytical methods used for regulation of foods and drugs". Analytical Chemistry 54 (1982) Seite 67A-76A
[236] Hegnerova, K., Piliarik, M., Steinbachova, M., Flegelova, Z., Cernohorska, H., Homola, J.; "Detection of bisphenol A using a novel surface plasmon resonance biosensor". Analytical and Bioanalytical Chemistry 398 (2010) Seite 1963-1966
[237] Soh, N., Watanabe, T., Asano, Y., Imato, T.; "Indirect competitive immunoassay for bisphenol A, based on a surface plasmon resonance sensor". Sensors and Materials 15 (2003) Seite 423-438
[238] Farre, M., Martinez, E., Ramon, J., Navarro, A., Radjenovic, J., Mauriz, E., Lechuga, L., Marco, M.P., Barcelo, D.; "Part per trillion determination of atrazine in natural water samples by a surface plasmon resonance immunosensor". Analytical and Bioanalytical Chemistry 388 (2007) Seite 207-214
[239] Larsson, A., Angbrant, J., Ekeroth, J., Månsson, P., Liedberg, B.; "A novel biochip technology for detection of explosives - TNT: Synthesis, characterisation and application". Sensors and Actuators B 113 (2006) Seite 730-748
[240] Kim, S.J., Gobi, K.V., Tanaka, H., Shoyama, Y., Miura, N.; "Enhanced sensitivity of a surface-plasmon-resonance (SPR) sensor for 2,4-D by controlled functionalization of self-assembled monolayer-based immunosensor chip". Chemistry Letters 35 (2006) Seite 1132-1133
[241] Kötke, M., Hubo, S., Vargas, C., Fonka, M., Rosenfeld, H., Niemeyer, B.; "New receptors for the detection of organic contaminants in sea water". Procedia Engineering 5 (2010) Seite 375-380
[242] Love, J.C., Estroff, L.A., Kriebel, J.K., Nuzzo, R.G., Whitesides, G.M.; "Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology". Chemical Reviews 105 (2005) Seite 1103-1169
[243] Ulman, A.; "Formation and structure of self-assembled monolayers". Chemical Reviews 96 (1996) Seite 1533-1554
[244] Schröder, M.; "Flugzeit-Sekundärionenmassenspektrometrie an Thiol self assembly Monolagen auf Gold". (2006) Dissertation Westfälische Wilhelms-Universität Münster
[245] Krüss GmbH; "Drop Shape Analysis DSA1 v 1.90 für Kontaktwinkelmess-System DSA100 (Benutzerhandbuch V04607)". (2004)