План лекции:

1. Полиморфиз ДНК и его источники

2. Виды генетического полиморфизма

3. Методы выявления полиморфизма ДНК (основные ДНК-технологии)

4. Практическое значение ДНК-технологий

5. Использование ДНК-технологий в научных исследованиях

ДНК-технологии - новые подходы, которые позволяют с высокой эффективностью выявлять любые изменения в геноме*. Основаны на информации о последовательности геномной ДНК у представителей одного вида и разных видов. *Геном - совокупность наследственного материала в клетке организма

2000 г , дрозофила, нематода, арабидопсис

2002 г мышь

2003 г человек

Человек (5 геномов) Мышь Собака Корова Свинья гвинейская Ленивец Броненосец Кенгуровая крыса Лошадь Кошка

Кролик Крыса Суслик Тупайя Дельфин Шимпанзе Горилла Орангутан Макака-резус Кенгуру

2009 год

Секвенирование 1-ого генома человека - 3 млрд руб, мыши — 300 млн, коровы — 30 млн. Сейчас геном человека стоит 30-60 тыс руб

Можно сравнивать геномы разных видов, а также изучать внутривидовую изменчивость генетического материала

26%

7%

36%

60% 90%

98%

Уровень сходства генома человека с геномами других организмов

Хромолитография Густава Мютцеля "Человеческие расы мира"

http://polesh-chuk.livejournal.com/144454.html

сходство геномов - 99,9%

Геном определяет как видовые особенности, так и внутривидовые различия

В геноме человека 3,2 миллиардов нуклеотидов, т.е. между людьми существуют различия по 3,2 млн нуклеотидов !

Каждый человек уникален, поскольку уникален его геном → между любыми двумя людьми, если они не монозиготные (однояйцовые) близнецы, всегда имеются значительные индивидуальные различия

Монозиготные близнецы

ДНК полиморфизм — существование у одного вида различий по нуклеотидной последовательности. Источником ДНК-полиморфизма служат мутации, которые могут не только передаваться потомком, но и размножаться в популяции. Когда один из вариантов нуклеотидных последователь-ностей определенного участка ДНК выявляется более чем у 1% особей, то такую вариабельность чаще всего называют ДНК-полиморфизмом, если же менее 1% — просто мутацией. Отличие между мутациями и полиморфизмом достаточно условно.

Причины возникновение мутаций - внешние: Космическая и солнечная радиация (УФ, рентгеновское излучение);

земная радиация.

Мутагены окружающей среды (в основном - антропогенной природы: промышленные и бытовые отходы, ядерные взрывы; удобрения и ядохимикаты, мутагены пищевых продуктов, лекарства).

В жареном мясе → гетероциклические амины, в копченом → полициклические гидрокарбоноты

Нитрозамины – образуются из алкалоидов табака ( злокач. опухоли легких, пищевода…)

Причины возникновение мутаций - внутренние:

Инфекции - вирусные. Размножаясь в клетках хозяина, вирусные частицы встраивают «хозяйские» гены в свою ДНК.

Ошибки при репликации ДНК (недостаточно эффективная работа систем репарации).

Каждый раз, когда клетка делится, копируется > 3 млрд нуклеотидов! Феномен точного удвоения молекулы ДНК, в основе которого лежит комплементарность оснований этой молекулы, составляет молекулярную основу наследственности и обеспечивает будущее всего вида.

При репликации ДНК частота встраивания ошибочных нуклеотидов - 10-4-10-5 на нуклеотид/клетку/генерацию. Но те же ферменты выступают в роли «корректоров» и снижают число предмутационных повреждений до 10-7 -10-8 на нуклеотид/клетку/на генерацию. Включение пострепликативных систем репарации приводит к частоте ошибок при ДНК-репликации не выше 1 на 109–1010 нуклеотидов. Т.о. повреждение ДНК – это не мутация (предмутационное повреждение). Мутация – это наследственное (фиксированное) изменение в нуклеотидной последовательности генома организма.

Чем больше раз копируется (реплицируется) ДНК, тем больше в ней накапливается ошибок.

Ооцит – до мейоза проходит через 25 митозов.

Число митозов, через которое проходит сперматогонии до мейоза, зависит от возраста мужчины: если 18 лет 100 митозов если 50 лет 800 митозов

Ошибки репликации – причина того, что у новорожденного человека, «мужских» мутаций в среднем в 5 раз больше, чем «женских».

РЕЗУЛЬТАТ:

От матери ребенок получает в среднем 15 мутаций, независимо от ее возраста. А от отца — в зависимости от возраста: отцу 20 лет — 25 мутаций, отцу 40 лет — 65, отцу 50 лет — 85 мутаций.

Каждый год жизни отца добавляет ребенку две новые мутации Вывод - мужчинам, откладывающим рождение ребенка на поздний возраст, стоит пересмотреть свои жизненные планы.

В 2004 г ср.возраст отцов -35 лет, в 2007 г 40 лет, у каждого 10-ого папа старше 50 лет.

90% мутаций нейтральны, однако позднее отцовство рассматривается как один из факторов увеличения генетического груза.

Генетический груз — накопление летальных и сублетальных отрицательных мутаций, вызывающих при переходе в гомозиготное состояние выраженное снижение жизнеспособности особей, или их гибель

«Характерное время, за которое бесконтрольное накопление мутаций создаст человеческие генотипы, едва-едва выживающие в больнице - 100 поколений»

Профессор Алексей Кондрашов

Демографическая генетика – изучает влияния особенностей репродукции на генофонд* и влияние генетических особенностей на воспроизводство _________

*Генофонд — совокупность генов, которыми обладают все члены данной популяции или вида

Уровень полиморфизма зависит не только от скорости мутирования

Мутации могут быстро размножится в популяции – если они улучшают выживаемость и/или плодовитость или

нужны человеку (естественный или искусственный отбор)

Частота мутаций (полиморфных вариантов) меняется из-за различных популяционно-генетических процессов, в том числе из-за «дрейфа генов» - случайного изменения частоты аллелей при снижении численности популяции («бутылочное горлышка»)

Дрейф генов → размножение редких аллелей, исчезновение каких-либо аллелей, сохранение вредных аллелей и др.

Виды генетического полиморфизма: полиморфизм единичных нуклеотидов (SNP - Single Nucleotide Polymorphisms) - самый распространенный тип вариабельности нуклеотидных последовательностей ДНК (99% всех измененных вариантов).

Мы отличаемся друг от друга в 1 позиции нуклеотидов из 800 – 1000

Число повторов варьирует от человека к человеку (внутри одного вида животных, растений).

Короткие тандемные повторы – STR (Short Tandem Repeat) - различие в числе коротких нуклеотидных

последовательностей (мини-(>7) и микросателлиты (1-7)

Методы выявления полиморфизма ДНК: 1) Секвенирование геномов или их

информативных участков (ДНК митохондрий, хлоропластов, ядерная ДНК, ДНК отдельных участков У-хромосомы)

2) Использование ДНК-маркеров (анализ

небольших фрагментов ДНК), содержащих микросателлиты или SNP (в том числе, ДНК митохондрий и У-хромосомы)

В клетке 1000 митохондрий В митохондрии 1 – 8 молекул кольцевой ДНК В 1 молекуле мтДНК 16,5 тыс пар нуклеотидов (37 генов — 13 кодируют белки, 22 — гены тРНК, 2 — рРНК) .

мтДНК много и она высоко информативна 1) материнское наследование 2) отсутствие рекомбинации мтДНК (простоте реконструкции

предковых форм) 3) высокий уровень полиморфизма мтДНК (скорость эволюции

мтДНК > чем ядерной ДНК в 10-20 раз)

ДНК хромосомы Y высоко информативна (86 генов, из низ 23 – кодируют белок)

1) высокий уровень полиморфизма ДНК (>скорость мутирования); 2) отцовское наследование 3) отсутствие рекомбинации по 95% длины Y-хромосомы (простота

реконструкции предковых форм).

385a 385b 388 389i 389ii 390 391 392 393 426

Кузен 1 12 17 12 13 29 24 11 13 13 10

Кузен 2 12 17 12 13 29 24 11 13 13 10

Кузен 3 12 17 12 13 29 24 11 14 13 10

На Y-хромосоме описано > 400 SNP и 500 STR (микросателл). Гаплотип Y-хромосомы- совокупность полиморфных участков (SNP и/или

STR) Y-хромосомы, которые наследуются вместе .

Области применения Результат

Судебная экспертиза Установление родства, опознание останков,

Криминалистика Идентификация преступника

Таможенная экспертиза Идентификация видовой, сортовой (породной) принадлежности

Спорт Предсказание успехов в спорте, выбор спортивного направления

Медицина. Ветеренария

Диагностика заболеваний и предрасположенностей к заболеваниям

ДНК-паспортизация Каталоги сортов, пород, медицинские паспорта

Практическое значение ДНК-технологий:

Дактилоскопия – метод идентификации человека по отпечаткам пальцев

У.Гершель установил индивидуальность и постоянство отпечатков пальцев (1877). Ф. Гальтон выделил элементы для их описания и добился введения Д как метода регистрации в Англии преступников (1895). С 1905 г.- используется в суде в качестве доказательства

Сэр Фрэнсис Гальтон

Баронет Уильям Гершель

ДНК-дактилоскопия (геномная дактилоскопия, основанная на использовании ДНК-маркеров)

GСТАTGGCGGTAACTGT TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA CTGCАТССАТССGСТАG

GСТАTGGCGGTAACTGT TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA CTGCАТССАТССGСТАG

Праймер 2

Праймер 1

STR - маркеры (от Short Tandem Repeat)

Сэр Алек Джеффрис Разработана профессором Джефрисом (Лестерский Университет) в 1984 г.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод, позволяющий размножить определенный фрагмент генома. Изобретен в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом (1993 г – Нобелевская премия)

Нуклеотидная последовательность праймеров задается экспериментатором

ДНК – маркеры

Позволяет многократно размножить фрагменты ДНК до 3000 пн. Если внутри фрагмента есть микросателлит, то продукты ПЦР от разных людей будут отличаться

ПЦР

В отличие от традиционной дактилоскопии, ДНК-дактилоскопия устанавливает не только идентичность отпечатков, но и родственные связи между донорами ДНК Источники ДНК:

Клетки волосяного фоликула

Клетки слизисной (слюна)

Кровь

Сперма

Кожа, зубы, кости и пр.

Принципы А.Джеффриса использованы для создания целого набора ДНК-маркеров для идентификации личности человека

Для индивидуальной идентификации необходимо всего 10 маркеров – вероятность случайного совпадения 1.2 x 10-18)

Для ДНК-дактилоскопии анализируют не один ДНК-маркер (не один фрагмент ДНК), а 10-16 ДНК-маркеров

ФБР

ДНК-дактилоскопия (геномная дактилоскопия)

Установление родства Если отец/мать и ребенок по какому-то ДНК-маркеру (STR) не имеют общей полосы (признака), то отцовство/материнство отсутствует, или – произошла мутация. Если есть различие по ≥ 3-м STR-локусам, отцовство/материнство однозначно исключается (100%). Но вывод обязательно подтверждается повторным исследованием образцов ДНК

Приказом МЗ РФ №161 от 24.04.2003 г уровень доказательности экспертного заключения определен следующим образом: «При не исключении родства для одного из родителей и бесспорного родства другого родителя – не ниже 99,90%.При исключении родства для одного из родителей и отсутствии другого родителя – не ниже 99,75%».

Подтвердить отцовство со 100% вероятностью невозможно. Достоверность отцовства при анализе образцов отца и ребенка по 16 STR-локусам составляет более 99,99%.

Проведение ДНК-экспертизы по установлению родства: • при подмене детей в роддоме;

• при сомнениях в правильности ЭКО (ооцит от матери?);

• для предоставления в суд док-ва факта отцовства (материнства);

• установление родства для получения алиментов или наследства (или отказа от них);

• определение истинного отца (если таковой неизвестен);

• подтверждение отцовства для переезда матери с ребенком за границу на родину отца (когда мать является гражданкой РФ, а отец – гражданином другой страны);

• опознание изуродованных трупов в результате природных и техногенных катастроф, терактов, войн.

ДНК-дактилоскопия (геномная дактилоскопия)

Идентификация преступника

Преступник !!!

ДНК пре-ступника

Кровь жертвы

П о д о з р е в а е м ы е

Национальная база ДНК Великобритании - самый большой банк ДНК в мире (содержит 2,7 млн проб ДНК осуждённых и подозреваемых). Еженедельно раскрывается до 2 тысяч преступлений (раскрываемость — до 90%). Обсуждается вопрос о введении генной паспортизации всего населения.

В США Национальная база данных ДНК (в 2002 - 800 тысяч проб осуждённые за совершение тяжких и особо тяжких преступлений).

В базе данных Исландии содержатся ДНК всего населения ( 300 тысяч человек).

Метод ДНК-анализа применяется в экспертно-криминалисти-ческой практике Канады, Японии, Китая, Малайзии, Сингапура, Таиланда, Чили, Колумбии, Н.Зеландии и др.

Российские криминалисты пока собирают базы ДНК преступни-ков и неопознанных трупов. С 1.01.2009 действует закон «О государственной геномной регистрации граждан РФ». Он подразумевает обязательный отбор образцов ДНК у всех преступников, осужденных за тяжкие и особо тяжкие преступления, а также за преступления, связанные с сексуальным насилием. Для остальной части населения это дело добровольное

Поддержание чистоты пород домашних и сельскохозяйственных животных, сортов растений, торговые сделки и арбитраж

В.А.Орехов, ООО Гордис http://www.myshared.ru/slide/743720/

В.А.Орехов, ООО Гордис

http://www.myshared.ru/slide/743720/

ДНК-идентификация диких животных: - незаконная охота, - торговля редкими и исчезающими видами (20 млрд $ в год)

В.А.Орехов, ООО Гордис http://www.myshared.ru/slide/743720/

В.А.Орехов, ООО Гордис http://www.myshared.ru/slide/743720/

В.А.Орехов, ООО Гордис http://www.myshared.ru/slide/743720/

"Штрихкод жизни" (Barcoding of Life) - -международный проект по ДНК-идентификации (ДНК-штрихкодированию) всех видов организмов (электронные базы данных доступны всем)

Цель: разработка ДНК-штрихкодов в качестве строгой системы идентификации для всех эукариот и применение этого нового инструмента анализа в целях лучшего использования, охраны и выявления биоразнообразия

http://www.nearmedic.ru/upload/files/Doc_237_862.pdf

ДНК-идентификация предполагаемых останков Императора Николая II Романова и членов его семьи

Rogaev E.I. et al. PNAS. 2009. 106(13):5258.

Подтверждена гипотеза об обнаружении останков всех членов царской семьи

Профессор Евгений Рогаев

Дом Ипатьева, Екатеринбург, 1918

17 июля 1918 года в Ипатьевском доме Екатеринбурга были расстреляны Император Николай II и его семья

Захоронение останков царской семьи в Петропавловской крепости в 1998 г - была одной из важнейших церемоний легитимации клана Ельцина - попытка продемонстрировать «преемственность» РФ от Российской Империи.

Места захоронений Романовых и их приближенных под Екатеринбургом

В 2007 г обнаружено 2-ое захоронение (в 60 м от 1го) Презентация Е.И. Рогаева, Москва, ИОГен

Анализ половых и аутосомных STR-маркеров предполагаемых останков семьи Романовых

Новые останки №146 и Т147 из 2го захоронения не идентичны ранее найденным, но принадлежат той же семье. Это останки Марии и Алексея. Rogaev E. et al. PNAS. 2009. 106 (13): 5258

Отображение на дисплее окна мониторинга электрофореза

(Array Viewer) прибора ABI 3730 Genetic Analyzer.

Презентация Е.И. Рогаева, Москва, ИОГен

Покушение на жизнь Императора Николая II (Япония 11 мая 1891). Одна рубашка с пятнами крови Императора Николая II – в музее Японии, другая - рубашка хранится в Эрмитаже

Митохондриальная родословная по линии императрицы Александры Федоровны

Королева Виктория

(1819-1901) Prince Albert

(1817-1898)

O. T. (b.1943)

Princess Victoria of

Hesse (1863-1950)

Princess Beatrice

(1885-1917)

D. W. (b.1985)

K. S. (b.1959)

V. S. (b.1991)

Prince Philip

(b.1921) Презентация Е.И. Рогаева, Москва, ИОГен

Nicholas Dmitry

(b. 1922) (b. 1926)

Nicholas I (1796-1855)

Alexander II (1818–1881) Nicholas (1831-1891) Michael (1832-1909)

Nicholas II (1868-1918)

Alexei (1904-1918)

A2

(b.1957)

A3

(b.1963)

A1 (b. 1923)

Генотипирование ДНК мужской линии семьи Романовых

(ДНК- маркеры Y-хромосомы )

Презентация Е.И. Рогаева, Москва, ИОГен

Это мутация в акцепторном сайте сплайсинга (3-ий интрон) А →Г, которая приводила к укорочению белка фактора IX, или плазменного тромбопластина

LANNOY and HERMANS. Haemophilia (2010), 16, 843–847

У цесаревича Алексея, императрицы Александры и княжны Анастасии выявлены мутации гемофилии В в Х-хромосоме

Во всех королевских династиях, берущих начало от королевы Виктории была гемофилия В

LANNOY and HERMANS. Haemophilia (2010), 16, 843–847

(Rogaev E., Moliaka Y, Faskhutdinova G, Goltsov A., Lahti A, Hildebrandt C, Kittler E, Morozova I. Genomic identification in the historical case of the Nicholas II royal family. PNAS. 2009. 106(13):5258.

Методами ДНК-идентификации подтверждена гипотеза об обнаружении останков всех членов царской семьи

Анализ ядерной аутосомной ДНК, Y- хромосомной ДНК и митох. ДНК свидетельствует об обнаружении останков отца (установлен как Император Николай II), матери и пятерых детей (4 девочки и мальчик)

Сейчас с помощью ДНК-технологий диагностируют более 200 наследственных заболеваний, таких как: Фенилкетонурия

Муковисцидоз

Миодистрофия Дюшенна/Беккера

Хорея Гентингтона

Гемофилия А, В

Болезнь Вильсона – Коновалова и др. …

Инфекции крови (качественное и количественное определение) и др. http://www.tvkultura.ru/issue.html?id=107918

Фундаментальные исследования генетических основ заболеваний → ДНК-диагностика заболеваний

Какой вид спорта или тип физических нагрузок больше подойдет вам или вашему ребенку? Бег на короткие дистанции vs. тяжелая атлетика?

СПОРТИВНАЯ ГЕНЕТИКА Выявление и анализ влияния генов на физические качества человека (генетика развития, медицинская генетика).

Практический аспект - генетический отбор в спорт. ~40 генов обуславливают спортивные способности

http://www.sportgenetic.ru/geneticnow/gen/

Полный спортивный паспорт: выяснение индивидуальной генетической предрасположенности к различным видам спорта и особенностям тренировочного процесса (с развернутой интерпретацией) * 34 гена - 23600 руб http://similia21.ru/sportivnaya-genetika

Миостатин подавляет деления клеток и приводит к апоптозу клеток

Мутации в гене миостатина вызывают увеличение мышечной массы

порода Бельгийская голубая

СПОРТИВНАЯ ГЕНЕТИКА - влияние генов на физические качества человека • генетический отбор в спорт.

Гиганты ринга с высоким уровнем гормона роста

Проанализировав ДНК-полиморфизм, можно многое узнать:

•способность к обучению,

•уровень интеллекта

•предрасположенность к алкогольной, наркотической зависимости, игромании

•спортивные качества

•откуда вышли ваши предки (популяционная генетика)

•вкусовые предпочтения

•переносимость боли

•длительность жизни

•разные специфические особенности (реакция на запах пота, зуд, синдром «беспокойных ног» и многое другое)

Персональная генетика http://mygenome.su/articles/58/

ПАЛЕОГЕНЕТИКА

Может быть в будущем мы воссоздадим вымершие виды ????

Мамонты жили в эпоху великих оледенений (плейстоцен), закончившуюся 11,7 тысяч лет назад

Нога мамонта Mammuthus primigenius

митохондриальный

геном мамонта

Чукотке

Анализ древней ДНК, выделенной из скелетов неандертальца и современного человека

Science Feb 13 2008, V.323; Cell.

2008 Aug 8;134(3):416-26

Полностью секвенирован митохондри-альный и часть ядерного генома останков неандертальца, которым ~30 000 лет. Вывод: за 6 000 лет сосущество-вания неандертальцы внесли вклад в формирование генома H.sapiens. - Геномы жителей Евразии (не Африки!!!) содержат 2,5±0,6% неандертальских генов

В 2010 г секвенировали геном Денисова человека (Homo altaiensis). Прочтен сначала митохондриальный, а потом

и часть ядерного генома

Останки (зубы и фаланги кисти - возраст ~40 тыс лет) найдены в пещере Горного Алтая

Геномы меланезийцев вдобавок к неандертальским имеют еще 4,8±0,5% денисовских генов

Денисова пещера

Вот как возник наш геном:

2. Часть сапиенсов вышла из Африки в Юго-Западную Азию (tAfr). Здесь они скрещивались с неандертальцами (поток генов от неандертальцев к предкам современных евразийцев, f1).

1. Наши предки отделились от предков неандертальцев и денисовцев 270 -440 тысяч лет назад (в момент времени tv ).

3. Позже отдельные популяции сапиенсов скрещивались с денисовцами (поток генов f2). Эти популяции стали предками современных меланезийцев, (жителей Новой Гвинеи и островов к востоку от нее.

2014 г: геном современного человека неафриканского происхождения содержит около 20% генома неандертальца.

“Если какие-то из вариантов генов отсутствуют у африканцев, но есть у не африканцев и неандертальцев - то это те гены, которые мы приобрели у последних”:

Sankararaman et al. The genomic landscape of Neanderthal ancestry in present-day humans. Nature, published online January 29, 2014

Vernot and Akey. Resurrecting Surviving Neandertal Lineages from Modern Human Genomes. Science, published online January 29, 2014

гены для образования кератиновых волокон,

гены восприимчивости человека к волчанке, циррозу печени, болезни Крона, сахарному диабету второго типа и др.