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Departamento de Biotecnología

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El Dr. Pedro L. Rodríguez Egea, Investigador Científico del CSIC (Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas de Valencia) y el Prof. Ramón Serrano Salom, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular del Dpto. de Biotecnología de la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de la UPV.

CERTIFICAN que la Ingeniera Agrónoma SILVIA RUBIO NOVELLA ha realizado bajo su dirección en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas el trabajo que lleva por título “La biosíntesis del coenzima A y su papel en el establecimiento de la plántula, en la respuesta al estrés salino/osmótico y en el almacenamiento de lípidos en Arabidopsis thaliana “, y autorizan su presentación para optar al grado de Doctor en Biotecnología,

Y para que así conste, expiden y firman el presente certificado en Valencia, mayo de 2009.

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RESUMEN

El Coenzima A (CoA) es un cofactor en multitud de reacciones enzimáticas, entre ellas la oxidación de ácidos grasos, carbohidratos y aminoácidos y muchas otras reacciones de biosíntesis. En el mundo vegetal, el acetil-CoA (AcCoA) es un metabolito clave en el ciclo de Krebs, en ciclo del glioxilato y gluconeogénesis, en la biosíntesis de isoprenoides (en la ruta citosólica del mevalonato), de ácidos grasos y de derivados de la ruta de fenilpropanoides, así como en la acetilación de histonas. El profundo impacto del CoA en el metabolismo celular se traduce también en un importante papel en la respuesta de la planta ante situaciones de estrés salino/osmótico, por ejemplo mediante la síntesis de osmolitos. Con el objeto de estudiar las consecuencias fisiológicas que tiene sobre la planta la manipulación de la biosíntesis de CoA, hemos llevado a cabo abordajes de pérdida y ganancia de función en tres genes de la ruta, i.e. HAL3A, HAL3B y PPAT. HAL3A codifica una descarboxilasa de fosfopantotenoilcisteína que genera fosfopanteteína, el antepenúltimo intermediario en la biosíntesis de CoA. El genoma de Arabidopsis contiene un segundo gen, HAL3B, homólogo a HAL3A, aunque con un papel secundario, demostrado por el fenotipo en establecimiento del doble mutante heterozigoto aaBb y que no muestra Aabb. La fosfopanteteína generada en la reacción catalizada por HAL3A/HAL3B es el sustrato de PPAT, un enzima que transfiere adenilato a este sustrato para generar defosfoCoA, el penúltimo intermediario en la biosíntesis de CoA.

Como se presumía del papel crucial de CoA en el metabolismo celular, un doble mutante hal3ahal3b fue letal durante el desarrollo embrionario. Plántulas con una sola copia funcional de HAL3B y nulas para HAL3A (aaBb) fueron viables y completaban el ciclo vital, no obstante mostraban un fenotipo de dependencia de sacarosa en el establecimiento de plántula, el cual es un atributo común con mutantes afectados en la �-oxidación de los ácidos grasos. Medidas del contenido en ácidos grasos y acil-CoAs de plántulas de 5 días en medio carente de sacarosa mostraban una detención en el catabolismo de los lípidos de reserva y una reducción en la biosíntesis de CoA, con una disminución de ∼80% en los niveles de acetil-CoA. Adicionalmente, los individuos aaBb mostraban una reducción severa en la producción de semillas y en la tolerancia a estrés salino. Similares efectos fenotípicos fueron obtenidos con un mutante de reducción de función del gen PPAT, i.e. ppat-1. En el mutante ppat-1 hay una reducción de ∼90% en la expresión de PPAT, lo cual conduce a un severo retraso en el crecimiento. En cambio, plantas 35S:PPAT mostraban mayor crecimiento, resistencia a estrés salino/osmótico y mayor acumulación de ácidos grasos en semillas que plantas tipo silvestre. Estos resultados sugieren que la manipulación en plantas de cosecha de los niveles de CoA podría conducir a una mejora de la resistencia al estrés abiótico y del contenido lipídico en semillas oleaginosas y en general, en una mayor producción de biomasa.

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ABSTRACT

Coenzyme A (CoA) is a cofactor in many enzymatic reactions, including oxidation of fatty acids, carbohydrates and amino acids and many other biosynthetic reactions. In plants, acetyl-CoA represents a key metabolite for Krebs cycle, glioxylate cycle and gluconeogenesis, isoprenoid biosynthesis (mevalonic pathway in the citosol), fatty acid synthesis or synthesis of fenylpropanoid derivatives and is also involved in histone acetyilation. The deep impact of this central precursor in cellular metabolism may again be observed in the salt/osmotic stress plant response, for instance through osmolite biosynthesis. In order to study the plant physiological consequences of altering CoA intracellular levels, loss and gain-of-function genetical approaches of the genes involved in the biochemical pathway have been carried out, e.g. HAL3A, HAL3B and PPAT. HAL3A codifies for a phophopantothenoil cysteine decarboxilase that generates phosphopatheteine, the antepenultimate intermediary in CoA biosynthesis. Arabidopsis genome contains a second gene, HAL3B, homologous to HAL3A, but with a secondary role, as shown by the seedling establishment phenotype of doble heterozigous mutant aaBb, which is not shown by mutant Aabb. Phosphopantheteine generated in the reaction catalized by the enzyme HAL3A/HAL3B is the substrate for the next enzyme in the pathway, PPAT, which catalizes the transfer of an adenilyl monophosphate to produce defosfo-CoA, the penultimate intermediary in the biosynthesis of CoA.

As it could be envisaged since CoA performes a crucial role in cellular metabolism, doble mutant, hal3ahal3b, was lethal during embrionic development. Seedlings with one functional copy of gene HAL3B and devoid of gene HAL3A (aaBb) were viable and completed the life cycle, however, they did show a sucrose dependent phenotype during seedling establishment, which is a comon attribute with mutants affected in the �-oxidation of fatty acids. Fatty acid and acyl-CoAs measurements in 5-day-old seedlings grown in medium with and without sucrose showed a delay in oil storage catabolism in aaBb mutant, and also a reduction in CoA biosynthesis with a decrease of 80% of acetyl-CoA levels. Additionally, aaBb individuals showed a severe reduction in seed production and sensibility to salt stress. Similar phenotypic effects were obtained with a reduction of function mutant in gene PPAT (mutant ppat-1). In ppat-1 mutant there is a reduction in PPAT transcript levels of 90%, which leads to a severe delay in development and a diminished growth compared to wild type. On the contrary, plants which carried the construct 35S:PPAT showed enhanced development in general, enhanced resistance to salt/osmotic stress and increased accumulation of storage oil in seeds when compared to wild type. These results suggest that manipulation of crop plants in the levels of CoA could lead to improved resistance to abiotic stress and lipid content in oilseeds including higher biomass production in general.

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RESUM

El coenzim A (CoA) és un cofactor en multitud de reaccions enzimàtiques, entre elles l'oxidació d'àcids grassos, carbohidrats i aminoàcids i moltes reaccions de biosíntesi. En el món vegetal, l'acetil-CoA (AcCoA) és un metabòlit clau en el cicle de Krebs, cicle del glioxilat i gluconeogènesi, biosíntesi de isoprenoides (en la ruta citosòlica del mevalonat), d'àcids grassos i derivats de la ruta fenilpropanoids i acetilació d'histones. El profund impacte del CoA en el metabolisme cel lular es tradueix també en un important paper en la resposta de la planta davant de situacions d'estrès osmòtic, per exemple mitjançant la síntesi d’osmòlits. Amb l'objecte d'estudiar les conseqüències fisiològiques que té sobre la planta la manipulació de la biosíntesi de CoA, hem dut a terme abordatges de pèrdua i guany de funció en tres gens de la ruta, com són: HAL3A, HAL3B i PPAT. HAL3A codifica una descarboxilasa de fosfopantotenoilcisteina que genera fosfopanteteina, l'antepenúltim intermediari en la biosíntesi de CoA. El genoma d'Arabidopsis conté un segon gen, HAL3B, altament homòleg a HAL3A, encara que amb un paper secundari, demostrat pel fenotip d´establisment de plàntula que mostrava el doble mutant heterozigot aaBb y que no mostrava Aabb. La fosfopanteteina generada en la reacció catalitzada per HAL3A/HAL3B és el substrat de PPAT, un enzim que transfereix adenilat a aquest substrat per generar defosfoCoA, el penúltim intermediari en la biosíntesi de CoA.

Com es presumia del paper crucial de CoA en el metabolisme cel lular, un doble mutant hal3ahal3b va ser letal durant el desenvolupament embrionari. Plàntules amb una sola còpia funcional de HAL3B i nul·les per HAL3A (aaBb) van ser viables i completaven el cicle vital, no obstant mostraven un fenotip de dependència de sacarosa en l'establiment de plàntula, el qual és un atribut comú amb mutants afectats en la ß -oxidació dels àcids grassos. Mesures del contingut en àcids grassos i acil-CoAs de plàntules de 5 dies en medi amb manca de sacarosa mostraven una detenció en el catabolisme dels lípids de reserva i una reducció en la biosíntesi de CoA, amb una disminució de ~ 80% en els nivells d'acetil-CoA. Adicionalment, els individus aaBb mostraven una reducció severa en la producció de llavors i en la tolerància a estrès salí. Similars efectes fenotípics van ser obtinguts amb un mutant de reducció de funció del gen PPAT, com és el ppat-1. Al mutant ppat-1 hi ha una reducció de ~ 90% en l'expressió de PPAT, la qual cosa condueix a un sever retard en el creixement. En canvi, les plantes 35S:PPAT mostraven major creixement, resistència a estrès salí / osmòtic i major acumulació d'àcids grassos en llavors que plantes de tipus silvestre. Aquests resultats suggereixen que la manipulació en plantes de collita dels nivells de CoA podria conduir a una millora de la resistència a l'estrès abiòtic i del contingut lipídic en llavors oleaginoses i en general en major producció de biomassa vegetal.

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Índice de contenidos I. INTRODUCCIÓN....................................................................................................................................... 1 Biosíntesis del coenzima A (CoA).......................................................................................................... 1.1 Estructura química del coenzima A (CoASH).................................................................................. 1.2 Importancia del CoA y del acetil-CoA en la célula ……………………………………………………. 1.3 Antecedentes en la ruta bioquímica universal de síntesis del CoA................................................ 1.4 La biosíntesis de pantotenato (vitamina B5) y su transporte........................................................... 1.5 Ruta de biosíntesis del CoA en Arabidopsis thaliana ………………………………………………… 1.5.1 Antecedentes en la ruta de biosíntesis del CoA en plantas. Ganancia y pérdida de función

en genes de la ruta ………………………………………………………………………………... 1.5.2 Pantotenato quinasa PANK1 (CoaA1, At1g6044) y PANK2 (CoaA2, At4g32180) ………… 1.5.3 4´-Fosfopantotenoilcisteína sintasa (CoaB1 y CoaB2, PPCS, At1g12350 y At5g02080 .….. 1.5.4 4´-Fosfopantotenoilcisteína descarboxilasa (CoaC, PPCDC, HAL3A, At3g18030 y HAL3B,

At1g48605) ……………………………………………………………………………………... 1.5.5 4´-Fosfopanteteína adenilato transferasa (CoaD, PPAT, At2g18250) ………………………. 1.5.6 Desfosfo-Coenzima A quinasa, CoaE (At2g27490, DPCK)………………………………….. 1.6 Regulación de los niveles del CoA en la célula ……………………………………………………….. 1.6.1 Regulación de los genes implicados en la ruta de biosíntesis de CoA ……………………… 1.6.2 Localización y regulación del CoA por compartimentalización ………………………………. 1.6.3 Regulación de los niveles del CoA por degradación ………………………………………….. 2. Cultivos oleaginosos. Valor industrial………………………………………………………………………. 2.1 Arabidopsis como semilla oleaginosa..………………………………………………………………….. 3. El metabolismo de la semilla oleaginosa.…………………………………………………………………… 3.1 Desarrollo y maduración de la semilla en A. thaliana ………………………………………………… 3.1.1 Morfogénesis temprana del embrión o embrio-morfogénesis..……………………………….. 3.1.2 Fase de maduración....................…………………………………………………………………

3.1.2.1 Estadíos de maduración temprana y maduración intermedia.................................. 3.1.2.2 Estadío de maduración tardía …………………………………………………………

3.2 La germinación de la semilla y el establecimiento de la plántula.................................................... 3.2.1 La germinación desde un punto de vista global ……………………………………………….. 3.2.2 La germinación y establecimiento de Arabidopsis desde el punto de vista metabólico ……

3.2.2.1 La movilización de las reservas durante la germinación y el establecimiento de la plántula ……………………………………………………………………………………

3.2.2.1.1 Lipolisis …………………………………………………………………………... 3.2.2.1.2 Transporte al peroxisoma y activación de los ácidos grasos ….................. 3.2.2.1.3 �-oxidación de los ácidos grasos (saturados) en semillas............................ 3.2.2.1.4 Ciclo del glioxilato..……………………………………………………………….

3.2.2.1.4.1 Ciclo del glioxilato y gluconeogénesis ………………………………... 3.2.2.1.4.2 Ciclo del glioxilato y gluconeogénesis mediante la ruta de

fotorrespiración …………………………………………………………... 3.2.2.1.5 Respiración de los lípidos ……………………………………………………..

3.2.2.2 Papel de la �-oxidación de los lípidos en el desarrollo embrionario, en la germinación y en el establecimiento de la plántula ………………………………….

4. Regulación de la expresión génica en la movilización lipídica..………………………………………… 4.1 Regulación a nivel de la transcripción de genes implicados en movilización lipídica durante la

germinación y el crecimiento post-germinativo ……………………………………………………….. 4.2 Ayuno de carbohidratos. Efecto de la sacarosa en los procesos movilización de los lípidos ........ 4.3 Señalización de la sacarosa en el metabolismo ………………………………………………………. II. OBJETIVOS.............................................................................................................................................. III. RESULTADOS..........................................................................................................................................

CAPÍTULO I: An Arabidopsis mutant impaired in Coenzyme A biosynthesis is sugar dependent for seedling establishment .....................................................................................................

CAPÍTULO II: The Coenzyme A biosynthetic enzyme phosphopantetheine adenylyltransferase plays a crucial role in plant growth, salt/osmotic stress resistance, and seed lipid storage ……

IV DISCUSIÓN .............................................................................................................................................. V CONCLUSIONES....................................................................................................................................... VI BIBLIOGRAFÍA.........................................................................................................................................

1 3 3 4 6 6 9 10 11 13 13 16 20 20 20 22 23 25 26 28 28 28 29 29 33 33 33 34 34 36 37 39 40 40 41 42 43 47 47 47 48 49 50 53 65 79 95 99

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I. Introducción

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1. Biosíntesis del coenzima A (CoA)

1.1 Estructura química del coenzima A (CoA-SH) La molécula de CoA contiene en su estructura química (figura 1) un grupo 4´-

fosfopanteteína unido covalentemente mediante enlace fosfo anhídrido al grupo 3´-fosfoadenosina difosfato. Su grupo 4´-fosfopanteteína contiene el grupo tiol (-SH) que confiere las propiedades reactivas al CoA-SH, ya que favorece la formación del enlace tioéster rico en energía al unirse a grupos carboxilos (-COOH). De este modo actúa como una molécula portadora de grupos acilo. El término “A” hace referencia a su papel como activador de acilos, como el acetato, dando lugar, entre otros, al acetil-CoA. Esta reacción

está favorecida por el carácter nucleofílico del anión tiolato (-S-) que se forma en el

transcurso de dicha reacción de tioesterificación. La principal función del CoA-SH es activar metabolitos con grupos carboxilos (-COOH) como los ácidos grasos (dando lugar a aciles-CoA; CH3-(CH2)n-CO-S-CoA), los ácidos orgánicos intermediarios del ciclo de Krebs o los aminoácidos, dando lugar a la formación de tioésteres.

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Figura 1. Estructura química del coenzima A en su forma reducida (CoASH).

Los tioésteres formados son buenos electrófilos para reaccionar con grupos nucleófilos como alcoholes (-OH), aminas (-NH) o grupos carbonados nucleófilos como el anión enolato, donde favorecen la transferencia de grupos acilo (R-CO-). No obstante, en condiciones acuosas, la transferencia de grupos acilo no está favorecida, lo cual convierte al cofactor (CoA-SH) en el transportador ideal de acilos. Esta dualidad del CoA-SH para transferir grupos acilo o por el contrario transportarlos establemente, es la que otorga al CoA su versatilidad y amplio espectro de uso como cofactor en todos los sistemas biológicos (revisado por Begley et al., 2001).

Por otro lado, el grupo 4´-fosfopanteteína del CoA-SH puede actuar como grupo prostético de varias enzimas a las que se une covalentemente. Así, este grupo prostético se une al grupo hidroxilo de un residuo de serina de la proteína portadora de acilos (ACP;

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acyl-carrier-protein), involucrada en la síntesis de ácidos grasos en procariotas. También en eucariotas, el enzima ACP, activado con este grupo prostético, actúa como subunidad de la sintetasa de ácidos grasos (FAS; fatty-acid-synthetase). También utilizan este grupo prostético la policétido sintetasa y la sintetasa no ribosómica de péptidos.

1.2 Importancia del CoA y del acetil-CoA en la célula

Cuando en 1945 Fritz Lipmann descubre que el principal cofactor implicado en la activación del acetato es el CoA (Lipmann, 1953), aún se desconocía que al menos un 4% de todos los enzimas conocidos utilizan CoA como cofactor (Begley et al., 2001; revisado por Leonardi (a) et al., 2005). Se conocen más de 400 reacciones enzimáticas catalizadas por este cofactor (base de datos KEGG, Kanehisa et al., 2006).

El papel de este cofactor en el metabolismo primario y secundario de los seres vivos es esencial. El CoA activa el acetato para producir acetil-CoA, el cual es una mlécula central en el metabolismo. El acetil-CoA se forma a partir de varias rutas catabólicas. Por ejemplo, el piruvato formado a partir de la degradación de aminoácidos como alanina o serina, o bien, de la degradación de la glucosa por la vía de la glicólisis, es convertido por acción de la piruvato deshidrogenasa en acetil-CoA. También se forma acetil-CoA directamente por la degradación de aminoácidos como leucina, isoleucina o fenilalanina. Otra importante fuente de formación del acetil-CoA es a través de la degradación oxidativa de los ácidos grasos durante la �-oxidación en la que por cada dos carbonos de un acilo se consume una molécula de CoA y se produce otra de acetil-CoA. Este proceso es clave durante el crecimiento post-germinativo temprano de plantas con semillas oleaginosas.

Los destinos del acetil-CoA en el metabolismo celular son múltiples (figura 2). Particularmente en eucariotas vegetales, interviene en rutas metabólicas clave como la síntesis cloroplástica de ácidos grasos y de fosfolípidos, esteroles, polímeros protectores como la cutina y lignina, o de compuestos polifenólicos como flavonoides, estilbenos y antocianinas...etc. El primer paso en la síntesis de ácidos grasos implica la carboxilación de acetil-CoA por el enzima acetil-CoA carboxilasa hasta la formación de malonil-CoA, que posteriormente pasa por etapas de elongación. La síntesis de ácidos grasos tiene un importante valor durante la maduración intermedia y tardía de la semilla oleaginosa.

En cada vuelta del ciclo de Krebs se incorpora una molécula de acetil-CoA que se condensa con oxalacetato para dar lugar a citrato, el cual se isomeriza a isocitrato. Cuatro de los pasos de este ciclo son oxidaciones en las que la energía de oxidación se conserva, con gran eficiencia, mediante la formación de cofactores reducidos (NADH y FADH2), claves para el metabolismo energético. La liberación de la energía de estos cofactores conduce a la síntesis acoplada de ATP. Además, los intermediarios de cuatro y cinco átomos de carbono del ciclo actúan de intermediarios biosintéticos de una amplia gama de productos, como ciertos aminoácidos. Las reacciones anapleróticas reponen

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estos intermediarios, como es la carboxilación del piruvato para dar oxalacetato, entre otras.

Por otro lado, y cuando el estado metabólico la célula lo demande, el acetil-CoA procedente de la �-oxidación, a través de una serie de reacciones que tienen lugar en los glioxisomas y en el citosol, se convierte en fosfoenolpiruvato (PEP), y éste entra en la vía citosólica de la gluconeogénesis, para dar lugar a la formación de azúcares a partir de ácidos grasos.

El acetil-CoA interviene también en la ruta citosólica de síntesis de isoprenoides (MVA; ruta del mevalonato), y el isopentenilpirofosfato (IpPP) formado es el precursor de la síntesis de moléculas derivadas del isopreno, como son las hormonas citoquininas o los brasinoesteroides.

Es también necesario en la acetilación de histonas del núcleo, reacción catalizada por acetil transferasas de histonas (HATs) que tienen un importante papel en la regulación de la expresión génica por modificación de la estructura de la cromatina…etc, (Nexon y Cox, 2000; revisado por Leonardi (a) et al., 2005).

Figura 2. Metabolismo del acetil-CoA en plantas.

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1.3 Síntesis del CoA a partir de pantotenato El CoA se sintetiza en cinco pasos a partir del precursor pantotenato (o vitamina

B5), en una ruta lineal, esencial y universal, conservada en todos los taxones. Los metabolitos que intervienen en la ruta de biosíntesis del CoA son comunes a todos los seres vivos, en cambio los enzimas que componen la ruta difieren en su estructura entre los distintos organismos. Actualmente se han clonado y caracterizado todos los genes que codifican los enzimas que intervienen en esta ruta tanto en procariotas, arquea y eucariotas.

Escherichia coli es el organismo en el que la ruta se reconstituyó primero y en el que ha sido más extensamente estudiada la actividad y regulación bioquímica de los enzimas que la componen (Spitzer y Weiss, 1985; Song y Jackowski, 1992 y 1994; Vallari et al., 1987; Geerlof et al., 1999; Rock et al., 2000 y 2003; Begley et al., 2001; Strauss et al., 2001; Kupke et al., 2002; Izard, 2003; Leonardi et al., 2005a; Miller et al., 2007). Por genómica comparativa se identificaron los ortólogos en humanos y también se determinó su actividad enzimática y su modo de regulación (Afshar et al., 2001; Zhou et al., 2001; Daugtherty et al., 2002; Aghajanian, 2002; Manoj et al., 2003; Zhyvoloup et al., 2003; Leonardi et al., 2005a; Bosveld et al., 2008).

Se ha comprobado que la levadura posee también los genes ortólogos de la síntesis de CoA presentes en humanos, lo cual sugiere que la ruta en levadura es similar a la de E.coli y humanos (Daugerty et al., 2002; Leonardi et al., 2005a).

Los enzimas ortólogos en plantas fueron identificados por similitud de secuencia con los de E. coli y con los de humanos usando el programa BLAST. Después se asignó su función y se determinó su actividad mediante la reconstitución in vitro de la ruta con los enzimas recombinantes (Kupke et al, 2001; Kupke et al., 2003; revisado por Leonardi et al., 2005a).

1.4 La biosíntesis de pantotenato (vitamina B5) y su transporte

El precursor del CoA es el pantotenato. Posee un carácter ubicuo, esencial y universal y se encuentra en la biosfera en abundancia. Los animales y algunos microbios (Streptococus pneumoniae, Lactobacillus lactis y Haemophilus influenziae) carecen de la capacidad de sintetizar pantotenato de novo por lo que son dependientes de su toma desde el exterior. En cambio, las plantas y la mayoría de bacterias y hongos son capaces de biosintetizar el precursor de novo (Jackowski y Rock, 1981; revisado por Leonardi et al., 2005a).

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La síntesis de pantotenato

En bacterias se ha dilucidado completamente la ruta (figura 3). Ésta consiste en cuatro pasos catalíticos y dos ramas. Comienza con el precursor 2-cetoisovalerato (�-KIVA;� oxoácido del aminoácido valina), al que el enzima cetopantoato hidroximetil transferasa (KPHMT; panB) transfiere el grupo hidroximetil del 5,10-metileno tetrahidrofolato, dando lugar a cetopantoato. A continuación, el cetopantoato es reducido a pantoato por la cetopantoato reductasa (KPR; panE), y se oxida el cofactor reducido NADPH. En una rama separada, a partir de L-aspartato se sintetiza �-alanina por el enzima L-aspartato-�-descarboxilasa (ADC; panD). Finalmente, tras la condensación entre pantoato y �-alanina por la pantotenato sintetasa (PtS; panC), y con intervención del ATP, se sintetiza pantotenato (Ottenhof et al., 2004, Coxon et al., 2005).

Figura 3. Ruta de biosíntesis de pantotenato en E.coli. En la ruta intervienen cuatro enzimas: KPHMT, KPR, ACD y PtS. Los genes que codifican cada enzima se presentan en itálica. Adaptado de Ottenhof et al., 2004.

La primera evidencia de la existencia de la ruta de síntesis de pantotenato en plantas se encuentra en mutantes de Datura inoxia, los cuales requieren pantotenato en el medio de crecimiento, así como también pantoato y cetopantoato (revisado por Coxon et al., 2005). En Arabidopsis thaliana se han identificado mediante el programa BLAST los dos genes del primer paso de la ruta catalizado por la KPHMT (panB1 y panB2; At2g46110 y At3g61530) (Ottenhoff et al., 2004), y un gen del último paso, catalizado por la PtS (panC; At5g48840) (Genshel et al., 2004), y se ha comprobado que complementan los respectivos mutantes auxótrofos de E. coli (Genschel et al., 1999; Ottenhoff et al, 2004; Jonczyk et al., 2007). La ruta en plantas mantiene similitud con la de bacterias en su tramo lineal pero se desconoce en plantas el mecanismo preciso de síntesis de �-

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alanina. No se ha encontrado hasta el momento ningún homólogo en plantas del enzima ADC (panD) o de la KPR (panE) de E. coli (Ottenhoff et al, 2004). No existe homología tampoco entre los genes de E. coli y los de levadura; por tanto, la síntesis de �-alanina debe ser distinta entre procariotas y eucariotas. En levadura y humanos, la �-alanina parece proceder de la poliamina espermina y de la degradación del uracilo (White et al., 2001).

Estudios de localización subcelular en Arabidopsis demuestran que las dos isoformas del gen AtKPHMT (panB1 y panB2) se localizan en la mitocondria, y en cambio el último enzima de la ruta, la PtS (At5g48840; panC), se localiza en el citosol (revisado por Coxon et al, 2005). Por tanto, en plantas, a diferencia de en E.coli, la síntesis del pantotenato está compartimentalizada, por lo que deben existir transportadores entre los compartimentos para los intermediarios de la ruta.

Un trabajo realizado en Arabidopsis con mutantes de T-DNA de pérdida de función en el gen AtPtS, en el que se muestra letalidad embrionaria del doble mutante pts-1pts-2, demuestra que este defecto en el crecimiento se puede rescatar por adición exógena de pantotenato, y asimismo que no debe existir en Arabidopsis otra ruta alternativa de síntesis de pantotenato. En Arabidopsis, la regulación de la síntesis de pantotenato está mediada por los niveles de precursores del citosol como el pantoato, pero no por regulación bioquímica del enzima PtS (panC) (Jonczyk y Genschel, 2006). En consonancia, tampoco una mayor actividad del enzima AtPtS por sobreexpresión de su gen implica mayores niveles del producto pantotenato. Es decir, el enzima AtPtS es esencial pero no limitante en la síntesis de pantotenato (Jonczyk et al., 2007).

En la etapa de desarrollo temprano de la semilla (comprendida entre 2-8 DAF; days-after-flowering), hay reducción de los niveles de transcrito de panC y un aumento de los de panB y se detectan bajos niveles del producto pantotenato. Estos bajos niveles del producto guardan relación con los bajos niveles de transcrito de panC pero no se corresponden con la inducción observada de panB, en consecuencia, este comportamiento biosintético sólo se puede explicar por una regulación post-transcripcional de los genes de la ruta (Jonczyk et al., 2007).

La toma y transporte del pantotenato desde el exterior a la célula

E. coli produce pantotenato en exceso y el que no es incorporado en la síntesis del CoA es excretado al exterior celular, lo que sugiere que el pantotenato no es limitante en la síntesis del cofactor (Jackowski y Rock, 1981; Jonczyk y Genschel, 2006). La toma de pantotenato desde el exterior la lleva a cabo la pantotenato permeasa (PanF) en un sistema simportador de cotransporte de sodio unidireccional de alta especificidad (Vallardi y Rock, 1985; Jackowski y Alix, 1990). Dicha toma de pantotenato incrementa en 10 veces si se sobreexpresa esta permeasa (Jackowski y Alix, 1990). No obstante, una mayor actividad de PanF, no implica mayores niveles de CoA. Tampoco el ritmo de transporte del pantotenato o el aumento de sus niveles intracelulares, depende de los niveles intracelulares de CoA (revisado por Leonardi et al., 2005a).

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En Saccharomyces cerevisiae, el pantotenato se transporta por un simportador de protones acoplado también de alta afinidad pero que no mantiene similitud con el gen PANF y está codificado por el gen FEN2 (revisado por Leonardi et al., 2005).

En mamíferos el transporte de pantotenato está mediado por un transportador multivitamínico dependiente de sodio (SMVT; sodium-multivitaminic-transporter), que actúa mediante gradiente electroquímico en contra de gradiente. Este sistema también transporta lipoato y biotina (revisado por Leonardi et al., 2005a).

En plantas todavía no se conoce el transportador para el pantotenato.

1.5 Ruta de biosíntesis del CoA en Arabidopsis thaliana En plantas, cada paso de la ruta de síntesis de CoA está catalizado por enzimas

únicos monofuncionales. La ruta en Arabidopsis thaliana fue reconstituida in vitro por Kupke y colaboradores (2003) combinando los enzimas recombinantes. La biosíntesis de CoA (figura 4) comienza con la fosforilación del pantotenato catalizada por la pantotenato quinasa (PANK). Se conocen en Arabidopsis cinco miembros de la familia de la pantotenato quinasa, pero existen dos isoformas predominantes, AtCoaA1 y AtCoaA2, codificadas por los genes At1g60440 y At4g32180, y que catalizan la formación de 4´-fosfopantotenato y difosfato de adenosina (ADP). A continuación tiene lugar la adición de una L-cisteína (L-Cys) al 4´-fosfopantotenato mediada por el enzima 4´-fosfo-N-pantotenoil-cisteína sintetasa (PPCS; AtCoaB1 y AtCoaB2, isoformas codificadas por At1g12350 y At5g02080), con el consumo de una molécula de trifosfato de adenosina (ATP) y dando lugar a 4´-fosfopantotenoilcisteína, monofosfato de adenosina (AMP) y pirofosfato (PPi). En el siguiente paso, el enzima 4´-fosfo-N-pantotenoil-cisteína descarboxilasa (PPCDC; AtCoaC1 y AtCoaC2, o HAL3A y HAL3B, isoformas codificadas por At3g18030 y At1g48605 respectivamente) cataliza la descarboxilación del extremo –COOH de la cisteína dando lugar al compuesto 4´-fosfopanteteína (PhP). El penúltimo paso lo realiza el enzima 4´-fosfopanteteína adenilato transferasa, PPAT (AtCoaD, At2g18250), con la adición reversible de un grupo adenilato del ATP (AMP) a la 4´-fosfopanteteína, produciéndose 3´-defosfo-CoA y PPi. Finalmente, el último paso consiste en la fosforilación del grupo –OH en el extremo 3´ de la ribosa del 3´-desfosfo-CoA por el enzima desfosfo-CoA quinasa (DPCK; AtCoaE, At2g27490) dando lugar a la síntesis del coenzima-A (CoA-SH).

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Figura 4. Ruta universal de síntesis del CoA. En la parte superior aparece la nomenclatura simplificada de los enzimas en Arabidopsis (AtCoaA, AtCoaB, AtCoaC o AtHAL3, AtCoaD y AtCoaE). En la parte inferior aparecen las abreviaturas de las actividades bioquímicas correspondientes (PANK, PPCS, PPCDC, PPAT y DPCK). Adaptado de Daugherty et al., 2002.

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1.5.1 Antecedentes en la ruta de biosíntesis del CoA en plantas. Ganancia y pérdida de función en genes de la ruta

En plantas, la actividad bioquímica con el enzima recombinante y la estructura terciaria del enzima AtHAL3A (AtCoaC; PPCDC) ha sido estudiada extensamente (Albert et al., 2000; Kupke et al., 2001; Hernandez-Acosta et al., 2002; Steinbacher et al., 2003). El primer trabajo con plantas transgénicas para un enzima de la ruta fue llevado a cabo por Espinosa-Ruiz y colaboradores (1999), donde se realizó la sobreexpresión y la expresión de RNA antisentido del gen AtHAL3A.

Esta memoria muestra un análisis genético realizado con mutantes de T-DNA de pérdida de función en los genes AtHAL3A y AtHAL3B que aporta la primera evidencia genética acerca del papel esencial del CoA en plantas (doble mutante hal3ahal3b; Rubio et al., 2006), y posteriormente, Tilton y colaboradores (2006) confirmaron con mutantes de pérdida de función de los genes PANK1 y PANK2 (doble mutante pank-1pank-2) la esencialidad de esta ruta biosintética. Se presentan también en esta memoria las consecuencias fenotípicas y metabólicas de la pérdida de función y la sobreexpresión del gen que codifica el segundo enzima regulador en la ruta, PPAT (Rubio et al., 2008). Así como también se describe por primera vez en planta el modo de regulación bioquímica del enzima recombinante PPAT (AtCoaD) (Rubio et al., 2008).

Localización subcelular de los enzimas de la ruta en Arabidopsis thaliana

Aspectos como la localización subcelular de los enzimas de la ruta de síntesis del CoA en planta permanecen incompletos todavía. Datos del análisis de la secuencia de los enzimas utilizando programas como CloroP o PSORT indican que la ruta de síntesis en Arabidopsis tiene lugar probablemente en el citosol. Además el último enzima de la

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síntesis del pantotenato en plantas (PtS) también se localiza en el citosol (Ottenhoff et al., 2004). En un principio, la actividad de la pantotenato quinasa en plantas se describió por primera vez en el estroma de cloroplastos de espinaca y tenía una actividad 50 veces mayor que las fracciones citosólicas (Falk y Guerra, 1993). No obstante, las dos isoformas del gen PANK de Arabidopsis (Tilton et al., 2006) no presentan secuencias de localización cloroplástica.

Se postula que el CoA se debe encontrar multicompartimentalizado en organelos clave como mitocondrias, peroxisomas, cloroplastos…etc y también en el citosol. Con todo, todavía no hay trabajos sobre la localización subcelular de los enzimas de la ruta de biosíntesis de CoA en plantas.

1.5.2 Pantotenato quinasa PANK1 (CoaA1, At1g6044) y PANK2 (CoaA2, At4g32180)

La pantotenato quinasa, también conocida como CoaA o PANK, actúa en el primer paso de la ruta de síntesis del CoA y cataliza la conversión de pantotenato a 4´-fosfopantotenato con ayuda de una molécula de ATP. Es el principal enzima regulador de la ruta ya que en células de E. coli y de mamífero, el pantotenato se acumula en alta cantidad demostrando que este primer paso en la ruta es limitante (Song y Jackowski, 1992; Song y Jackowski, 1997; Rock et al., 2000).

La PANK de Arabidopsis se identificó por su alta similitud de secuencia con la del hongo Aspergillus nidulans. Mantiene también muy alta homología con el enzima de humanos (PANK1�) y el de levadura, y muy poca con la proteína de la bacteria E. coli. El enzima monofuncional AtPANK1 ha sido clonado y posteriormente caracterizado in vitro (Kupke et al., 2003). Recientemente se ha comprobado la actividad de una segunda isoforma de la pantotenato quinasa, AtPANK2, mediante complementación de mutantes de E. coli deficientes en ésta. El análisis genético con mutantes de pérdida de función ha establecido la relevancia fisiológica de esta actividad en la planta. La pérdida de función de ambos genes, pank1-1pank2-1, conduce a letalidad embrionaria (Tilton et al., 2006). El trabajo de Tilton y colaboradores demuestra también que no existe otro enzima en la planta que pueda compensar la pérdida de ambas isoformas.

Regulación de la actividad de la PANK

Las PANKs de los distintos organismos se agrupan en tres clases diferentes según su secuencia aminoacídica. Las del tipo I y II son determinantes para regular el flujo de la ruta, ya que son inhibidas por CoA, por sus tioésteres o por ambos (Vallari et al., 1987; Rock et al., 2000). La actividad de la pantotenato quinasa bacteriana (CoaA; PANK) está regulada por un mecanismo de retroinhibición por parte del CoA y, de manera menos eficiente, por sus tioésteres (Vallardi et al., 1987). Un aumento en el número de copias del gen CoaA de E. coli sólo supone un incremento de 2.7 veces en los

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niveles de CoA, corroborando la retroinhibición del enzima por el producto de la ruta (Song y Jackowski, 1992; Song y Jackowski, 1997). En el caso de mamíferos,� la sobreexpresión de la isoforma mPanK1� conducía a un aumento de 13 veces en los niveles de CoA intracelulares. Además, el CoA inducía su actividad, y sólo era inhibida por acetil-CoA, lo que ilustra una regulación distinta de las PANK según el tipo de organismo (Rock et al., 2000).

La inhibición de la PANK por CoA es competitiva con el ATP ya que la estructura cristalizada del enzima CoaA de E. coli muestra que forma complejos binarios con CoA o con AMPPNP (adenosina 5´-(�-�-imido) trifosfato; análogo no hidrolizable del ATP). El CoA y el ATP se unen al enzima con orientación y en sitios muy distintos, aunque los fosfatos � y � del CoA y del ATP se unen en el mismo sitio, explicando así la inhibición competitiva entre el CoA y el ATP. El grupo tiol (-SH) del CoA se une en el sitio destinado a los residuos aromáticos del enzima. Cepas de E. coli con la PANK refractaria a la inhibición por CoA muestran mayores niveles de metabolitos derivados del fosfopantotenato como la fosfopanteteína, que es excretada al exterior celular, y aumentan también los niveles de CoA, indicando la importancia de la inhibición de la PANK en la regulación de los niveles de CoA (Rock et al., 2003).

El enzima CoaA de Staphilococcus aureus, al contrario que el de E. coli, no está regulado por retroinhibición negativa del CoA ni de sus tioésteres; este hecho da lugar a una mayor acumulación de CoA intracelular (Leonardi et al., 2005b).

La principal pantotenato quinasa eucariótica identificada es la del hongo Aspergillus nidulans y su regulación estaba mediada por el acetil-CoA como inhibidor (Calder et al., 1999).

Existen cuatro genes que codifican la pantotenato quinasa en mamíferos: PANK1, PANK2, PANK3 y PANK4. El primero fue descubierto en ratón (PANK1) y tiene dos isoformas, PANK1-� y PANK1-�. PANK1 de mamíferos mantiene alta homología con la del hongo A. nidulans y muy baja con la de E. coli, al igual que ocurre con AtPANK. En ensayos in vitro, la isoforma PANK1� se estimula por CoA y se inhibe fuertemente por acetil-CoA (Rock et al, 2000). En cambio, la isoforma PANK1� se regula por retroinhibición negativa con CoA y con aciles-CoA de cadena larga, y en muy alta medida por acetil-CoA y malonil-CoA (revisado por Leonardi et al., 2005a). En humanos, la pérdida de la función de la PANK2 está asociada a un desorden neurodegenerativo hereditario conocido como síndrome de Hallervorden-Spatz (Kuo et al., 2005; revisado por Leonardi et al., 2005a; Bosveld et al., 2008).

La PANK de ratón, junto con la de A. nidulans, mantiene una alta identidad de secuencia con otra proteína del tipo PANK denominada Fumble L (FBL), de la mosca de la fruta (Drosofila melanogaster), aunque en esta última no se ha podido demostrar la actividad bioquímica. La pérdida de función en FBL conduce a anormalidades neuroplásticas en el estadio de pupa y letalidad (revisado por Leonardi et al., 2005a; Afshar et al., 2001).

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1.5.3 4´-Fosfopantotenoilcisteína sintasa (CoaB1 y CoaB2, PPCS, At1g12350 y At5g02080).

En Arabidopsis CoaB está codificado por dos genes de copia única independientes. Las dos proteínas CoaB mantienen un 90 % de similitud de secuencia entre ellas y fueron identificadas por homología con el enzima de humanos. Ambas proteínas AtCoaB mantienen alta similitud con las ortólogas de eucariotas superiores e inferiores y muy poca con el extremo amino terminal del enzima bifuncional Dfp de E.coli (CoaBC) (revisado por Leonardi et al., 2005). Mediante el análisis por marcaje génetico se identificó la función biológica de ambos genes en humanos (Daugtherty et al., 2002; Kupke, 2002; Strauss et al., 2001).

CoaB cataliza la reacción de adición de un grupo cisteína, con ayuda de la energía del ATP, al 4´-fosfopantotenato, para dar lugar a 4´-fosfopantotenoil-cisteína. Ensayos de reconstitución de la ruta in vitro con el enzima recombinante demuestran la actividad de AtCoaB1 (Kupke et al., 2003). La actividad de AtCoaB2 permanece por dilucidar.

La estructura cristalizada del enzima CoaB de humanos ha revelado que es un dímero con dos monómeros idénticos. Algún rasgo del plegamiento del monómero la asemeja con enzimas dependientes del cofactor NAD, otros rasgos del plegamiento la asemejan con riboquinasas. Su estructura predice un mecanismo de unión tipo ping pong caracterizado por la formación inicial de un intermediario acil-adenilato seguido de la liberación de pirofosfato (PPi) y de la adición de una cisteína, para formar los productos finales de 4´-fosfopantotenoilcisteína (PPC) y adenilato (AMP) (Manoj et al., 2003).

La región PPC sintasa (CoaB) del enzima bifuncional Dfp de E. coli es también un dímero cuando se expresa separadamente de CoaC. En su forma bifuncional es un complejo grande de 600 kDa con una estructura dodecamérica (Kupke et al., 2000; Kupke 2002).

Mutantes en Drosofila hipomórficos en el locus del gen CoaB inducen alteraciones en el aparato locomotor debido a una disminución en la síntesis de los lípidos del cerebro de la mosca (Bosveld et al., 2008).

1.5.4 4´-Fosfopantotenoilcisteína descarboxilasa (CoaC, PPCDC; HAL3A, At3g18030 y HAL3B, At1g48605)

CoaC en Arabidopsis está codificada por dos genes que mantienen un 86 % de identidad de secuencia entre ellos, AtHAL3A y AtHAL3B (AtCoaC1 y AtCoaC2). CoaC es el enzima de Arabidopsis cuya actividad y estructura han sido más estudiadas.

Se trata de una flavoproteína que tiene unido covalentemente el cofactor flavina (FMN) (Spitzer y Weiss, 1985 y 1988) y cataliza la descarboxilación de 4´-

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fosfopantotenoilcisteína a 4´-fosfopanteteína en una reacción de tipo redox (Kupke et al, 2001; Hernandez-Acosta et al., 2002). En la primera mitad de la reacción, el residuo de cisteína del compuesto 4´-fosfopantotenoilcisteína es oxidado a un intermediario tíoaldehído, el cuál se descarboxila espontáneamente al compuesto 4´-fosfopantotenoil-aminoenetiol. En la segunda mitad de la reacción, este compuesto se reduce a 4´-fosfopanteteína y el cofactor reducido FMNH2 se reoxida.

Estas flavoproteínas, AtHAL3A y 3B, mantienen cierta identidad de secuencia con una amplia familia de flavoproteínas procariotas. La similitud la mantienen con el extremo carboxilo terminal de la proteína bifuncional de E. coli denominada Dfp (Kupke et al. 2001). En E. coli la síntesis de 4´-fosfopanteteína a partir de 4´-fosfopantotenato, L-cisteína, CTP y Mg2+, la cataliza la flavoproteína Dfp (denominación que responde a DNA flavoprotein) y está relacionada con la síntesis de DNA y con el metabolismo del pantotenato. Dfp bacteriana es una proteína bifuncional denominada también CoaBC. Su dominio carboxilo terminal cataliza la síntesis de 4´-fosfopantotenoilcisteína (CoaB), mientras que su dominio amino terminal cataliza la reacción de descarboxilación de 4´-fosfo-N-pantotenoilcisteína para dar lugar a 4´-fosfopanteteína (CoaC) (Kupke et al., 2000).

AtCoaC mantiene también alta similitud de secuencia con la de la flavoproteína EpiD de Staphylococcus epidermidis, que cataliza la descarboxilación oxidativa de peptidil cisteínas, además de estar relacionada con la biosíntesis del péptido lantibiótico epidermina (Kupke et al., 1992, 1994 y 1995; Kupke y Götz, 1997). Este tipo de enzimas se engloba en una nueva familia de proteínas denominada HFCD (homo-oligomeric flavin-containing cysteine decarboxilases; Hernandez-Acosta et al., 2002).

Antecedentes en la relación de HAL3A con la tolerancia al estrés salino y osmótico

El gen HAL3/SIS2 fue descrito en levadura como un gen halotolerante cuya sobreexpresión conferia resistencia al estrés salino en células silvestres y suprimía la sensibilidad a la sal en mutantes en una fosfatasa calcineurina (Ferrando et al. 1995). Su sobreexpresión también complementa parcialmente a mutantes en la proteina fosfatasa Sit4 los cuales muestran pérdida de transcripción en ciclinas G1 del ciclo celular (Di Como et al., 1995; Clotet et al., 1999). Así, el gen HAL3 en levadura muestra un papel regulador de la homeostásis iónica y en el control del crecimiento celular. Posteriormente se demostró que la proteína ScHal3 actúa como subunidad inhibidora de la proteína Ser/Thr fosfatasa del tipo 1 denominada Ppz1. Hal3, a través de la inhibición de Ppz1, modula diversas funciones fisiológicas de Ppz1 tales como la tolerancia al estrés salino y la progresión del ciclo celular (Posas et al., 1995; deNadal et al., 1998; Yenush et al., 2002). Más recientemente, se ha postulado que Hal3 puede también tener funciones independientes de Ppz1 (Ruiz et al., 2004).

La flavoproteína AtCoaC fue identificada por primera vez por la alta identidad de secuencia que mantiene su dominio central con el dominio central de la proteína

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halotolerante de levadura ScHal3 (Espinosa-Ruiz et al., 1999) . No obstante, AtHAL3 carece de una larga cola acídica que posee ScHal3 y que está implicada en la mejora a la tolerancia por estrés salino (Ferrando et al., 1995). Pero la similitud de secuencia del dominio central, junto con el hecho de que la proteína AtHAL3A complementa parcialmente el fenotipo de sensibilidad al estrés salino del mutante de levadura hal3, condujo en un principio a postular la idea de que las proteínas homólogas a HAL3 de levadura pueden tener un mecanismo similar de acción a ésta (Espinosa-Ruiz et al., 1999). Curiosamente, en Saccharomyces cerevisiae no se han caracterizado ninguno de los putativos enzimas que participan en la ruta biosintética de CoA. Recientemente el profesor Ariño J. y colaboradores (comunicación personal) han descubierto que el enzima que cumple la función PPCDC de levadura es una proteína heterotrimérica compuesta por tres proteinas relacionadas: Hal3, Vhs3 (Ruiz et al., 2004; YOR054c) e YKL088w (Rodriguez et al., 1996). Caracterizaciones previas demuestran que las proteínas Hal3 y Vhs3 en levadura actúan como subunidades reguladoras de la proteína Ppz1, como se ha comentado, con un destacable papel en la tolerancia a salinidad y en la regulación del crecimiento celular, aunque con también funciones independientes de las proteina fosfatasas Ppz. Ante ambas funciones descritas de Hal3 y Vhs3 la conclusión de Ariño y colaboradores es que ambas proteínas actúan como proteínas multifuncionales.

La sobreexpresión del gen AtHAL3A en la planta Arabidopsis conduce a una mejora en la tolerancia al estrés salino y al estrés osmótico. Además AtHAL3A y AtHAL3B se inducen por estrés salino, pero el mecanismo que explicaría la tolerancia a dicho estrés es desconocido (Espinosa-Ruiz et al., 1999). Posteriormente se observa que la sobreexpresión del ortólogo en tabaco, NtHAL3a, conlleva a un aumento en la tolerancia al estrés salino, osmótico y el producido por el litio, así como a un aumento de 4 ó 5 veces los niveles de prolina y 2 veces la concentración intracelular de arginina (Yonamine et al., 2004).

Expresión de los genes AtHAL3A y AtHAL3B según el estadío de desarrollo.

AtHAL3A tiene un papel predominante sobre AtHAL3B en todos los tejidos vegetativos. AtHAL3B sigue siempre una pauta similar pero con menores niveles de mRNA (Espinosa-Ruiz et al., 1999). De acuerdo con los niveles de expresión observados en bases de datos como el GENEVESTIGATOR (Laule et al., 2006) o en el trabajo de Espinosa-Ruiz y colaboradores (1999), se observa una expresión similar de ambos genes a lo largo de los distintos estadíos de desarrollo, pero destaca una mayor expresión de AtHAL3A en estadío de plántula y en silicuas. Este patrón es muy similar al que siguen otros genes de la ruta como PPAT (CoaD) y DPCK (CoaE).�

Localización de la expresión de AtHAL3A en semillas y otros órganos.

Los datos del programa GENEVESTIGATOR (Laule et al., 2006) y datos de hibridación in situ del artículo de Espinosa-Ruiz y colaboradores (1999), muestran un mayor nivel de transcrito durante la maduración de la semilla en el embrión y también durante el crecimiento vegetativo en tejidos floemáticos.

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Estructura de la proteína AtHAL3A

El análisis estructural por difracción de rayos-X de AtHAL3A revela que adopta una estructura trimérica compuesta de tres subunidades idénticas, en la que cada protómero forma un plegamiento Rossmann �/� (H/TXGH) con un grupo flavina (FMN) situado en la interfase entre dos protómeros adyacentes. Cada subunidad consta de seis cadenas paralelas de láminas � entre dos capas de hélices �. El sitio de unión del FMN contiene los motivos requeridos por las flavoproteínas que catalizan reacciones de deshidrogenación (Albert et al., 2000).

1.5.5 4´-Fosfopanteteína adenilato transferasa (CoaD, PPAT, At2g18250)

CoaD (PPAT) cataliza la transferencia reversible del grupo adenilato del ATP (AMP) a la 4´-fosfopanteteína para dar lugar a 3´-desfosfo-CoA y pirofosfato (PPi), y es el segundo punto de control del flujo de la ruta después del enzima CoaA (PANK). Estudios in vitro con el enzima recombinante de Arabidopsis demostraron que AtCoaD tiene especificidad por 4´-fosfopanteteína y no acepta otro sustrato, como 4´-fosfopantotenoilcisteína (Kupke et al., 2003).

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HsCoaE domain (DPCK, 358 till 564)

HXGH = ROSSMANN fold (ATP binding motif, stabilization pentacoordinate transition state)

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GGIGSGKST = Walker kinase motif type A (ATP binding)

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Figura 5. Alineamiento de la secuencia aminoacídica de PPAT en Arabidopsis thaliana con las ortólogas en Oryza sativa 1 y 2, Escherichia coli y con el dominio CoaD del enzima bifuncional PPAT/DPCK (CoaDE) de Homo sapiens (desde el aminoácido 358 hasta el 564). Se muestra el motivo HXGH de AtPPAT encargado de la formación del pliegue tipo Rossmann de PPAT. Aparece también el motivo GGIGSGKST o motivo quinasa de unión del ATP en el dominio CoaE del enzima de humanos.

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AtCoaD ha sido identificada por su elevada identidad de secuencia con el dominio CoaD del enzima CoA sintasa (CoaDE) de humanos. La figura 5 muestra el alineamiento de la secuencia proteica de AtCoaD con el dominio CoaD del enzima bifuncional de humano seguido de la región CoaE de éste (Kupke et al., 2003). Por el contrario, la similitud con el enzima correspondiente en E. coli es muy baja (figura 5). La región codificante (ORF; open-reading-frame) de CoaD se identificó en E. coli inmediatamente después del gen kdtA (ácido 3-deoxi-D-mano-2-octulosónico) por lo que inicialmente fue denominado kdtB (Izard y Geerlof, 1999).

Al igual que ocurría con mutantes en Drosofila hipomórficos para los genes dPANK y dPPCS, larvas mutantes en el enzima bifuncional PPAT/DPCK muestran elevados niveles de daño en el DNA durante el desarrollo y son hipersensibles a las radiaciones ionizantes, hecho que corroboraría en este otro organismo la esencialidad de estos genes (Bosveld et al., 2008).

Estructura del enzima PPAT

La purificación de CoaD en E. coli revela una estructura de homohexámero organizado en un dímero de trímeros asimétricos. Dentro de cada trímero, los 3 monómeros que lo componen son idénticos (figura 6).

La estructura tridimensional de PPAT relaciona al enzima con una superfamilia de nucleotidil transferasas �/� fosfodiesterasas entre las que se encuentran la clase I de aminoacil t-RNA sintetasas, con la que comparte residuos catalíticos (Izard y Geerlof, 1999). Esta familia se caracteriza por poseer un dominio de pliegue tipo Rossmann �/� (H/TXGH) involucrado en la unión de nucleótidos y en la estabilización del estado de transición pentacoordinado que se forma tras el ataque nucleofílico del � fosfato del ATP al grupo fosfato de la 4´-fosfopanteteína. Esta secuencia está conservada en muchas nucleotidiltransferasas de la superfamilia �/� de fosfodiesterasas (Izard, 2003) (figura 5).

Se ha comprobado en E. coli que el CoA se une al enzima de forma competitiva con ATP, 4´-fosfopanteteína (PhP) y dPCoA. Se trata de una regulación de la actividad del enzima por retroinhibición del CoA. Además los datos de su estructura cristalizada muestran que el PPAT se encuentra siempre asociado con 0,5 moles de CoA por cada mol de enzima (Jackowski y Rock, 1984; Vallari y Jackowski, 1988; Geerlof et al., 1999; Izard 2003; Miller et al., 2007). En cuanto a inhibición por otros tioésteres de CoA, PPAT de E. coli sólo es inhibida por acetil-CoA, pero con una afinidad 10 veces inferior al CoA (Miller et al., 2007).

En la reacción que cataliza en reverso, el enzima PPAT forma un complejo ternario con ambos sustratos (dPCoA y PPi). Las KM de PPi y del dPCoA en las proteínas

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purificadas en E. coli para la reacción reversa son de 0,22 mM y 7 µM respectivamente (Geerlof et al., 1999), o de 272 µM y 14,7 µM para la proteína PPAT de humanos (Aghajanian y Worrall, 2002). Tan sólo uno de los dos trímeros une dPCoA y 4´-fosfopanteteína, por lo que sólo la mitad de las subunidades del hexámero son reactivas (Izard y Geerlof, 1999). Aunque se puede observar ATP unido en las 6 subunidades, los datos sobre densidad electrónica indican que la unión solamente es completa en un solo protómero.

El grupo fosfopanteteína del CoA mimetiza la unión del sustrato 4´-fosfopanteteína (PhP) a uno de los trímeros (trímero a), y se inducen cambios conformacionales en el otro trímero (b) que obligan al CoA a unirse con una conformación distinta. Por el contrario, el grupo adenilato del CoA y del dPCoA se unen a sitios distintos, debido al impedimento estérico del grupo fosfato del extremo 3´ de la ribosa del CoA que no ocurre con el dPCoA (figura 6). Esta manera de unirse del CoA en el enzima PPAT resulta única (Izard y Geerlof, 1999; Izard 2003).

Modelo de regulación de PPAT

Estudios con el enzima co-cristalizado con los sustratos y a pH 5.0 demuestran que el sustrato 4´-fosfopanteteína (PhP) y el dPCoA se unen sólo a un trímero (trímero (a) de la figura 6, secciones C y A respectivamente). El ATP y el CoA muestran densidad de ligando en los 6 monómeros (figura 6, secciones B y D). El CoA muestra unión en los 6 monómeros pero con formas diferentes de unión en cada trímero. El grupo fosfopanteteína de la estructura del CoA se une en uno de los trímeros (trímero (a)) de modo similar a como se une el sustrato 4´-fosfopanteteína, o el dPCoA, (trímero (a) de la figura 6 D). En el otro trímero (b), el grupo adenosina del CoA ocupa un sitio novel de unión (figura 6 D).

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Figura 6. Estructura secundaria de PPAT en E. coli como dímero de trímeros asimétricos. Se muestra el trímero superior (a) y el inferior (b). A. Unión del dPCoA al trímero (a). B. Unión del ATP en ambos trímeros (las 6 subunidades). C. Unión del sustrato 4´-fosfopanteteína al trímero (a). D. El CoA, en concreto su grupo fosfopanteteína, se une en el mismo trímero que el sustrato 4´-fosfopanteteína en el mismo lugar aunque con orientaciones distintas. El grupo adenilato del CoA se une al trímero (b), a diferencia del grupo adenilato del dPCoA que se une al trímero (a), debido al impedimento estérico del grupo fosfato del extremo 3´ de la ribosa del CoA. Adaptado de Miller et al., 2007.

Estudios de marcaje radiactivo en E. coli del precursor �-alanina y su adición al medio de crecimiento demuestran que se acumulan en la célula pantotenato y 4´-fosfopanteteína (Jackowski y Rock, 1984; Rock et al. 2000), demostrando que ambos pasos catalizados por los enzimas PANK y PPAT son los puntos reguladores de la ruta. Asimismo, se ha demostrado que la regulación de PPAT es el segundo punto de control de la ruta, tras el del enzima PANK (Vallari y Jackowski, 1988; Rock et al., 2003).

El trabajo de Miller y colaboradores (2007) propone un modelo de regulación de PPAT que depende de la concentración intracelular del intermediario 4´-fosfopanteteína (PhP). Cuando los niveles del intermediario PhP son altos, dada su alta afinidad por el enzima PPAT y teniendo en cuenta la modesta cinética de inhibición del CoA sobre PPAT (Ki de 10-50 µM), probablemente la inhibición por CoA no resulte efectiva. Luego la regulación de PPAT por CoA resulta fisiológicamente relevante sólo cuando los niveles de CoA son altos y los del sustrato PhP bajos. Cuando los niveles del intermediario PhP son bajos, el CoA se une con alta afinidad a PPAT manteniéndolo en un estado inhibido (figura 7). Este efecto confiere la ventaja de que PPAT inhibido por CoA se puede reactivar fácilmente si aumentaran los niveles del sustrato 4´-fosfopanteteína debido por ejemplo a un aumento en la actividad del enzima PANK, o también, debido al aumento del compuesto fosfopanteteína y de 3´,5´-ADP (PAP, fosfoadenosina fosfato) por reciclado del CoA (Miller et al., 2007). Este modelo apunta al enzima PPAT como un regulador de apoyo al principal enzima regulador, PANK.

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Figura 7. Modelo de regulación de PPAT. La concentración intracelular de fosfopanteteína modula la distribución de los monómeros para que el CoA se una de forma más o menos afín al enzima. A). En condiciones de bajos niveles de CoA y bajos niveles de PhP el flujo biosintético no está inhibido ni en PANK ni en PPAT. B). Cuando los niveles de CoA son altos y los de PhP bajos, ambos enzimas están inhibidos por el CoA. C). Cuando los niveles de CoA y de PhP son altos (como en el caso de una cepa R106A cuyo enzima PANK es refractario a inhibición por CoA), la PhP se une con alta afinidad a PPAT y el flujo biosintético prosigue. Abreviaturas utilizadas en el esquema: Pan (pantotenato), PanK (pantotenato quinasa), PPan (fosfopantotenato), PhP (fosfopanteteína), PPAT (fosfopanteteína adenilato transferasa), dPCoA (defosfo-CoA), CoA (coenzima-A). Adaptado de Miller et al., 2007.

1.5.6 Desfosfo-Coenzima A quinasa, CoaE (At2g27490, DPCK)

AtCoaE está codificada por un gen único y cataliza la reacción de fosforilación en el extremo 3´-OH de la ribosa del dPCoA con ayuda del ATP, dando lugar finalmente al CoA, AMP y PPi. Mantiene una alta homología con el enzima bacteriano y poca homología con la parte CoaE del enzima bifuncional (CoaDE) de humanos.

DPCK o CoaE se identificó en E. coli como el gen yacE tras la búsqueda en BLAST utilizando el extremo Nt de la proteína CoaE de Corinebacterium ammoniagenes.

CoaE forma trímeros en solución con iones sulfato. Cada monómero de CoaE posee un motivo P-loop (phosphate-binding-loop o motivo Walker-kinase) constituido por la secuencia consenso de GxxxxGK(T/S), que es el sitio de unión del �-fosfato del ATP (figura 5).

1.6 Regulación de los niveles del CoA en la célula

Las células contienen una concentración determinada de niveles de CoA que

resulta esencial para activar muchos metabolitos que poseen grupos carboxilo o para

enzimas clave del metabolismo que necesitan al grupo prostético 4´-fosfopanteteína para

su actividad (como por ejemplo la proteína portadora de acilos, ACP). Muchos tioésteres

de acilo tienen un impacto metabólico y señalizador importante en la célula (Graham y

Larson, 2002a). Además de la propia regulación bioquímica de los enzimas implicados en

la síntesis del coenzima, existe un número significativo de enzimas encargados de reducir

los niveles de CoA bien por modificación del mismo, catalizando su degradación o

consumiéndolo durante la transferencia del grupo 4´-fosfopanteteína a otros enzimas que

lo utilizan como grupo prostético. Las células deben tamponar el exceso de CoA y

combinar estas actividades descritas con las de regular la propia síntesis del coenzima o

llevar a cabo la compartimentalización.

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1.6.1 Regulación de los genes implicados en la ruta de biosíntesis de CoA

Durante el desarrollo de la semilla de Arabidopsis, particularmente al final de esta

etapa, tiene lugar la síntesis de los ácidos grasos de reserva de la semilla, donde el CoA

tendrá un importante papel. En esta etapa se ha estudiado la expresión de genes

implicados en la síntesis de CoA (figura 8). En esta etapa, aumentan los niveles de CoA y

acetil-CoA en consonancia con el patrón de expresión que siguen los genes de la ruta

CoaC, CoaD y CoaE en estos estadíos de maduración de la semilla (Jonczyk et al.,

2008).

Figura 8. Niveles de transcrito en semillas para nueve genes que intervienen en la síntesis del CoA desde el 2-cetoisovalerato (�-KIVA). Son datos pertenecientes a la base de datos de arrays AtGeneExpress y específicamente para el array ATH1. El eje de las ordenadas presenta los valores de transcrito expresados en base de logaritmo de 2 y estimados como señales de intensidad del array y normalizados a valor 0 para el estadío 3 del array. El eje de las abscisas son los estadíos de la semilla desde 2 a 8 DAP (days-after-pollination), que se correlaciona con los estadíos de semilla en el array 3 a 10. Los * en los estadíos 3 y 4 indican que los valores de transcrito se han estimado de silículas. Se muestran dentro de los recuadros los genes estudiados en todos los pasos de la ruta desde el precursor �-KIVA. Adaptada de Jonczyk et al., 2008.

Los genes AtCoaC (PPCDC), AtCoaD (PPAT) y AtCoaE (DPCK) están inducidos

de 2 a 4 veces durante los estadíos 3 a 10 DAP (days-after-pollination) de esta etapa de

desarrollo de la semilla. En el caso de AtPanA1 (KPHMT1) la expresión tiene un máximo

en el estadío 6 y luego decrece. El patrón de expresión de la isoforma AtPanA2

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PPAT, CoaD

KPHMT2

PPCDC1 (HAL3A), CoaC

KPHMT1 PTS PPCS1/2

PANK1/2

DPCK, CoaE

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(KPHMT2) complementa al de AtPanA1 ya que en el estadío 7 se dispara cuando

decrece AtPanA1. Por el contrario, decrece la expresión en 2 ó 3 veces de los dos

primeros genes de la ruta de síntesis del CoA, AtCoaA (PANK 1 y 2) y AtCoaB (PPCS 1 y

2), en consonancia con el patrón que sigue AtPtS. Los genes de la biosíntesis de CoA se

pueden agrupar en dos grupos entre los estadíos 3 y 10 (DAP). Un conjunto que incluye

los tres últimos genes de la ruta de síntesis del CoA y el primer gen de la ruta del

pantotenato, en los que aumenta su expresión y que además coincide con un aumento en

los niveles de CoA y acetil-CoA, y otro conjunto que incluiría el último gen de la ruta de

síntesis del pantotenato y los dos genes del principio de la de síntesis CoA, en los que

decrece la expresión y coincide con un descenso en los niveles de pantotenato. Este

efecto metabólico con los dos grupos de genes de la misma ruta se explica por un

mecanismo de regulación de la ruta a nivel post-transcripcional (Jonczyk et al., 2008).

1.6.2 Localización y regulación del CoA por compartimentalización

Localización del CoA libre en la célula

El CoA se localiza de manera ubicua en el interior celular. En plantas, la

información de la secuencia de los enzimas implicados en su biosíntesis apunta a una

localización citosólica de la misma (Rubio et al., 2006; Tilton et al., 2006; Rubio et al.,

2008). La naturaleza bioquímica del CoA confiere a este metabolito impermeabilidad para

atravesar las membranas (Shibata et al., 1983). Por este motivo son necesarios

transportadores de CoA para los diferentes compartimentos subcelulares, que en plantas

aún no han sido identificados. Con excepción de una proteína transportadora del CoA al

interior de la matriz mitocondrial de manera dependiente de energía en patata (Neuburger

et al., 1984).

Regulación del pool de CoA por compartimentalización

El pool de CoA se mantiene separado entre los diferentes compartimentos

celulares y ejerce funciones distintas según la localización. Este es el caso de los aciles-

CoA de cadena larga, lo cuales no sólo se usan en la oxidación de los ácidos grasos del

peroxisoma, sino también en la síntesis de los lípidos que tiene lugar en el citosol y el

retículo endoplásmico. Mediante la compartimentalización de los aciles-CoA, la célula

sigue un mecanismo de control de la concentración de éstos que es rápido y que no

implica el doble gasto energético de hidrolizarlos y después resintetizarlos a partir de

ácidos grasos y CoA-SH. En el caso de mamíferos, los ácidos grasos se transportan al

interior mitocondrial mediante un mecanismo de transesterificación de sus grupos acilo

con el transporatdor L-carnitina. El grupo acil-carnitina se transporta de la membrana a la

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matriz mitocondrial y una vez dentro, una transfersasa se encarga de la activación del

grupo acilo con el CoASH de la mitocondria. La carnitina y la compartimentalización del

CoA, permite a la célula el transporte de los ácidos grasos a la mitocondria con

únicamente el consumo de una molécula de ATP (Ramsay y Zammit, 2004).

En el caso de plantas, como se comentará en el apartado 3.2.2.1.2, los ácidos

grasos entran al peroxisoma para iniciar la �-oxidación a través de un transportador

denominado ABC (ATP-Binding-Cassete), el cuál consume también una molécula de

ATP. Exceptuando el caso de este transporte a peroxisoma, en plantas se desconoce el

modo de transporte del CoA libre al interior de los demás organelos. El transporte del

CoA a la mitocondria permanece bastante desconocido, como hemos comentado, sólo

existe un trabajo sobre la existencia de una proteína transportadora del CoA al interior de

la matriz mitocondrial de manera dependiente de energía en patata (Neuburger et al.,

1984).

En peroxisomas existen varios modelos de transporte para importar los acil-CoAs

desde el citosol y donde está implicada la proteína transportadora de acilos al interior

peroxisomal denominada comatosa (CTS/PED1/PXA1) (revisado por Graham, 2008).

El acetil-CoA del peroxisoma, procedente de la degradación de los lípidos, entra

en el ciclo del glioxilato y a través de su conversión a citrato se transporta desde el

peroxisoma al citosol y de ahí a la mitocondria para poder entrar en el ciclo de Krebs

(revisado por Graham, 2008).

La necesidad de controlar la concentración de los tioésteres de acilo es imperante

dado que cumplen funciones biológicas clave como la regulación de la expresión génica,

están involucrados en tráfico de membranas o en la modulación de las actividades de

canales de iones, también en el catabolismo de lípidos, la síntesis de lípidos o en el

metabolismo energético en general…etc (Graham y Larson, 2002; Ramaswamy et al.,

2004). Proteínas como la proteína de unión de aciles-CoA de cadena larga del citosol

(ACBP) se encarga de tamponar los niveles estos compuestos y mantener su

concentración en el rango nanomolar adecuado (revisado por Leonardi et al., 2005a).

1.6.3 Regulación de los niveles del CoA por degradación

Enzimas como las acil-CoA tioesterasas catalizan la hidrólisis de los aciles-CoA a

ácidos grasos libres y CoASH, por lo que juegan un importante papel para mantener los

niveles de CoA libre óptimos necesarios para mantener la actividad �-oxidativa del

peroxisoma, entre otras actividades (revisado por Leonardi et al., 2005a). Algunas

enzimas hidrolasas rompen el enlace fosfoanhidro del CoA liberando el grupo 4´-

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fosfopanteteína y 3´-5-ADP (PAP; fosfoadenosinafosfato). En ratón existe una CoA-

difosfatasa de peroxisoma denominada nudix-hidrolasa-7 (NUDT7�) y su función es

controlar la homeostasis peroxisomal de CoASH/acil-CoA (Reilly et al., 2008).

Por otro lado, el CoA dona su grupo 4´-fosfopanteteína a la proteína portadora de

acilos (ACP) actuando de grupo prostético de ésta y activándola. A su vez, en plantas la

ACP actúa como cofactor de la sintetasa de ácidos grasos (FAS) del cloroplasto. La

activación con el grupo prostético 4´-fosfopanteteína permite a ambos enzimas formar

enlaces tioéster con grupos carboxílicos. También otras proteínas como la policétido

sintetasa no ribosómica utiliza 4´-fosfopanteteína como grupo prostético (revisado por

Leonardi et al., 2005a).

La 4´-fosfopanteteína también se puede degradar a pantotenato y cisteamina. Los

enzimas encargados de esta reacción se conocen como panteteinasas, también llamadas

vaninas en humanos (revisado por Leonardi et al., 2005a).

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2. Cultivos oleaginosos. Valor industrial

Los aceites producidos por las plantas son una de las formas energía de carbono

reducido más ricas y abundantes en la naturaleza. La mayoría de los lípidos vegetales

usados en alimentación se obtienen de las semillas y de los tejidos mesocárpicos de los

cultivos oleaginosos. Además, el 85% de las grasas comestibles y de la producción de

aceite del mundo proviene de los aceites vegetales.

Son cultivos oleaginosos especies como: el girasol, la colza, la soja o el

cacahuete, (tabla 1).

Principales cultivos oleaginosos en el mundo

2006/07 2007/08 2008/09

estimada predicción

Producción en millones de toneladas

soja 235.9 220.6 238.0

semilla algodón 44.6 44.1 42.4

colza 47.6 48.9 55.0

cacahuete 34.0 35.4 35.9

semilla girasol 30.2 28.5 31.8

ricino 10.1 11.1 11.8

pulpa de coco 5.0 5.2 5.4

total 407.4 393.8 420.3

Tabla 1. Producción de los principales cultivos oleaginosos en el mundo. Obtenida de F.A.O. (Food and Agriculture Organization)

Los seres humanos dependen en gran medida de los aceites vegetales tanto para

su uso en la dieta como para su explotación industrial. Por un lado, los lípidos vegetales

son componentes mayoritarios de las dietas humanas, aportando alrededor del 25% del

valor calórico de la dieta.

Por otro lado los aceites vegetales son derivados de hidrocarburos de alta utilidad

en la industria petroquímica. En la actualidad existe la necesidad de buscar alternativas a

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los polímeros derivados del petróleo y los aceites vegetales son sustitutos potenciales, ya

que se pueden obtener de ellos los denominados bioplásticos, de características iguales

a los polímeros derivados del petróleo pero de naturaleza biodegradable. De hecho, se

pueden obtener de los aceites vegetales: lubricantes, polímeros, pinturas, solventes,

cosméticos, agentes surfactantes…etc.

En el mismo sentido, dadas sus propiedades químicas, los aceites vegetales se

han convertido en una materia prima de importante atractivo para la industria del

biodiesel porque ofrece las ventajas de energía renovable y, actualmente, se ha

convertido en una alternativa a los combustibles fósiles (petróleo), muy apropiada para

afrontar el futuro energético de los países. Sin embargo, la principal limitación en la

industria del biodiesel es la producción limitada de los cultivos, de modo que uno de los

mayores desafíos biotecnológicos se centra en aumentar la producción de aceites de los

cultivos oleaginosos y mejorar el conocimiento sobre cómo las plantas sintetizan los

ácidos grasos y los triglicéridos (Durrett et al., 2008).

2.1 Arabidopsis como semilla oleaginosa

Arabidopsis thaliana resulta idónea para el estudio del metabolismo lipídico de la

planta ya que una parte mayoritaria de sus reservas de carbono son lípidos (40%),

seguido de proteínas (23%) y en muy baja cantidad, carbohidratos (figuras 9 y 10)

(revisado por Eastmond y Graham, 2001). Además, es una brasicácea y, por tanto, está

directamente relacionada con uno de los principales cultivos oleaginosos, Brassica napus

(colza).

Figura 9. Composición de las reservas en semillas maduras de cultivos oleaginosos incluido Arabidopsis mostrando también el órgano principal de reserva. Obtenido de Eastmond y Graham, 2001.

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Las plantas de semillas oleaginosas difieren en el tejido que actúa como fuente de

la reserva de los lípidos (figura 9). Se distingue entre el tejido del endospermo y entre

tejidos embrionarios como los cotiledones o el hipocotilo.

Arabidopsis tiene cómo órganos principales de reserva los cotiledones del

embrión, que acumulan el 59% del total de los ácidos grasos de la semilla. Le siguen el

tejido de la raíz y del hipocotilo, que representan un 27%, y un 14% corresponde al tejido

del endospermo y a la cubierta seminal (Penfield, 2004; Yonghua et al., 2006). Aunque

teniendo en cuenta que el peso de la semilla de Arabidopsis se distribuye en porcentaje

de la siguiente manera: 45% son los cotiledones, 21% la radícula y el hipocotilo y el 34%

el endospermo y la cubierta seminal, el porcentaje de lípidos en base al peso del tejido

convierte a los cotiledones -junto con la radícula y el hipocotilo- en tejidos con similar

porcentaje de aceite (con un 47% y un 46%, respectivamente). En cualquier caso, los

perfiles lipídicos del endospermo y de los cotiledones de la semilla de Arabidopsis tienen

diferencias en cuanto al tipo de ácido graso que predomina (Penfield et al., 2004;

Yonghua et al., 2006).

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3. El metabolismo de la semilla oleaginosa

3.1 Desarrollo y maduración de la semilla en A. thaliana

El desarrollo de la semilla en la planta Arabidopsis thaliana empieza con la doble fertilización del saco embrionario que dará lugar al zigoto y al endospermo. Por un lado una célula espermática (haploide) del grano de polen se fusiona con una de las dos células centrales (diploides) y dan lugar al tejido del endospermo (triploide). Por otro lado la otra célula espermática (haploide) se fusiona con la célula huevo (haploide) para dar lugar al zigoto o embrión (diploide). A partir de este momento comienza el proceso de desarrollo de la semilla, cuya duración total es de unos 20 días y que puede ser dividido en dos fases, una primera de embrio-morfogénesis y una segunda de maduración de la semilla (figura 10).

Figura 10. Esquema con las fases de desarrollo de la semilla de Arabidopsis desde 0 a 20 días después de la antesis: Consta de las etapas: E.M. (morfogénesis temprana), maduración temprana, maduración intermedia y maduración tardía. Se muestra esquema de la deposición de las reservas de lípidos, proteínas, almidón, sacarosa y estaquiosa y rafinosa. Adaptado de la revisión de Baud et al., 2008.

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3.1.1 Morfogénesis temprana del embrión o embrio-morfogénesis (0-7 días-después-de-la-polinización; DDP)

En esta fase el zigoto empieza a dividirse, dando lugar al embrión y al tejido suspensor. Tras una serie de divisiones celulares, el embrión va pasando por distintos estadíos de desarrollo y finalmente alcanza el estadío de torpedo, en el que ha adquirido ya la forma de la futura plántula.

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El endospermo se desarrolla en dos pasos. Un estado primero coenocítico en el cuál los núcleos están sin celularizar y un segundo estado en el que los núcleos se celularizan y adquieren un estado diferenciado. A día 3 después de la polinización, se hacen visibles los núcleos del endospermo en desarrollo y se acumulan por el embrión y por la periferia del saco embrionario.

Durante este periodo, el peso fresco de la semilla aumenta dramáticamente.

3.1.2 Fase de maduración (7-17 DDP)

Esta es una de las fases más importantes de la vida de una planta puesto que es en esta fase dónde se sintetizan las reservas energéticas y estructurales que van a determinar la supervivencia y el vigor de la futura planta.

Al final de esta fase, la semilla habrá adquirido la tolerancia a la desecación y la dormancia. Se distinguen tres estadíos: maduración temprana, maduración intermedia y maduración tardía.

3.1.2.1 Estadíos de maduración temprana y maduración intermedia (de 7 a 10 DDP y de 11 a 17 DDP respectivamente)

Durante la maduración temprana tiene lugar el crecimiento de las células del embrión y éste llega al desarrollo completo y alcanza su máximo volumen. En cambio, el endospermo reduce su volumen drásticamente hasta llegar a ser una sola capa de células. También se acumulan los pigmentos fotosintéticos y las semillas adquieren color verde.

Al final de la maduración temprana y principios de la intermedia, las reservas energéticas se empiezan a acumular en los tejidos destinados para ello. El embrión muestra ya una elevada cantidad de almidón al principio de este estadío y, en cambio, la síntesis de la fuente de nitrógeno (proteínas) y de la principal fuente de carbono en la especie Arabidopsis (lípidos) empieza en este momento.

Aporte de nutrientes desde el floema a tejidos filiales. Importe simplástico a la cubierta seminal e importe apoplástico al endospermo

Los nutrientes llegan por el floema de la planta y entran dentro de la semilla a través del funículo desde donde son descargados de manera simplástica al integumento más externo de la cubierta seminal. El integumento más externo hace de sumidero de los nutrientes. No existe una conexión vascular (simplástica) entre el tejido materno que envuelve a la semilla y los tejidos filiales. Posteriormente hay un transporte apoplástico entre el integumento más externo de la cubierta y el resto de integumentos, y entre éstos y el endospermo y, finalmente, al embrión. Los tejidos sumidero de nutrientes van cambiando, siendo los integumentos al principio de la embrio-morfogénesis y luego pasa a ser el endospermo durante los estadios más tardíos de desarrollo embrionario, o el embrión durante la maduración temprana.

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En semillas oleaginosas pequeñas como la de Arabidopsis, todo este transporte post-floemático es bastante desconocido (revisado por Baud et al., 2008). AtSUC5 es un transportador de sacarosa específico del endospermo y desempeña un papel importante en el trasporte apoplástico de sacarosa desde floema al tejido filial (Baud et al., 2005). Adicionalmente, existen proteínas transportadoras dependientes de energía proton-simportadoras implicadas en el transporte al apoplasto (Schmidt et al., 2007).

Acumulación de azúcares

La semilla de Arabidopsis contiene muy poca cantidad de esta fuente de carbono. Al principio de la fase de maduración se acumula almidón pero al final va desapareciendo gradualmente.

Por otro lado, la regulación y la interconexión entre las diferentes rutas de síntesis de proteínas y carbohidratos en esta fase permanecen todavía confusas.

Existen especulaciones sobre la conversión de carbohidratos a precursores de la síntesis de ácidos grasos (Baud et al., 2002; revisado por Baud et al., 2008). Durante la maduración temprana (entre los 7 y 12 DDP), los niveles de almidón decrecen, coincidiendo con el principio de la síntesis de los triglicéridos (TAGs) y proteínas, que tiene lugar más en la fase de maduración intermedia. De un modo más preciso, Baud y colaboradores (2002) han observado que la síntesis de los ácidos grasos ocurre antes de la degradación del almidón acumulado.

En cuanto a los azúcares solubles, glucosa y fructosa, ambos aumentan sus niveles durante la fase anterior de morfogénesis y van disminuyendo hacia la maduración tardía de la semilla. En cambio, la sacarosa se convierte en el azúcar mayoritario de la semilla de Arabidopsis, ya que se acumula en esta fase de maduración intermedia y dura hasta el estadío maduración tardía. Se postula que esta sacarosa puede servir como fuente fácil y rápida de energía para la germinación temprana (Baud et al., 2002; revisado por Baud et al., 2008).

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Síntesis de ácidos grasos y acumulación de lípidos durante la maduración

de la semilla

Sucrose

Triacylglycerol

Glycerol-3-phosphate

Fatty acids

Coenzyme A

Pantothenate

Acyl-CoA pool

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AcCoA

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PDAT, DAGAT

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Glycerol-3-phosphate

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Figura 11. Síntesis de ácidos grasos y TAGs a partir del acetil-CoA. Se esquematiza el proceso de síntesis de ácidos grasos en el plasto de la semilla, a través de la formación de malonil-CoA partiendo del acetil-CoA (procedente de la degradación de la glucosa). A continuación el complejo multienzimático de la ácido graso-sintetasa (FAS), compuesto, entre otros, por la proteína portadora de acilos ACP (Acyl-Carrier-Protein), utiliza la moléculas necesarias de malonil-CoA, una de acetil-CoA y la energía del cofactor NADPH para mediante varias reacciones de condensación sintetizar finalmente el ácido graso y liberar CoASH, CO2, H2O y NADP. En el citosol los ácidos grasos se activan a aciles-CoA. Allí, a partir de una serie de reacciones de la ruta denominada Kennedy y a partir de los precursores de los aciles-CoA y del esqueleto del glicerol-3-fosfato tiene lugar la síntesis de triglicéridos (TAGs) . Adaptada de Baud et al., 2007.

El proceso de síntesis de ácidos grasos tiene lugar en el plasto de la semilla o, en el caso de la planta adulta, en el cloroplasto. Este proceso parte de la molécula clave denominada malonil-CoA. Éste se sitetiza por el enzima acetil-CoA-carboxilasa y para ello es necesaria una molécula de acetil-CoA (procedente de la degradación de la glucosa). A continuación, el complejo multienzimático de la ácido graso-sintetasa (FAS), compuesto entre otros por la proteína portadora de acilos ACP (Acyl-Carrier-Protein), utiliza la moléculas necesarias de malonil-CoA, una de acetil-CoA y la energía del cofactor NADPH para mediante varias reacciones de condensación sintetizar finalmente el ácido graso y liberar CoASH, CO2, H2O y NADP. Se muestra en la figura 11 la conexión entre el coenzima A y en concreto del acetil-CoA (AcCoA) y la síntesis de los ácidos grasos. A continuación, en el citosol, de los ácidos grasos se obtienen sus derivados activados (los aciles-CoA). La síntesis de los triglicéridos (TAGs) tiene lugar

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entre el citosol y el retículo endoplásmico (R.E.) por una serie de reacciones de la ruta Kennedy y son requeridos dos precursores clave: los aciles-CoA y el glicerol-3-fosfato (figura 11). Los TAGs serán empaquetados dentro de los cuerpos lipídicos (también conocidos como liposomas). Tras el empaquetamiento se separan del R.E. y se distribuyen por el citosol hasta formar un organelo maduro.

En la fase de maduración de la semilla, la mayoría de los ácidos grasos de Arabidopsis se almacenan como triglicéridos (TAGs), el resto son diglicéridos (DAG) y lípidos de membrana (Baud et al., 2002; Quettier y Eastmond, 2008).

El almacenamiento de los ácidos grasos en la semilla concuerda con el aumento en peso seco de ésta. Hacia el final de la maduración de la semilla, los niveles de lípidos son altos aunque hacia día 20 después de la polinización hay un pequeño descenso. En relación a este pequeño descenso, ciertos autores, han observado que las rutas de movilización de lípidos están activadas ya durante el desarrollo de la semilla de Brassica napus (Baud et al., 2002; Chia-Tansy et al., 2005).

Hasta el comienzo de la fase de maduración, los ácidos grasos que abundan son los de síntesis: palmítico (16:0), esteárico (18:0) y linoleico (18:2). Después disminuyen los niveles de 16:0 y 18:0 y aumentan los de los ácidos grasos de reserva (oleico (18:1), linoleico (18:2) y linolénico (18:3)). También se acumulan el ácido eicosenoico (20:1) y el erúcico (22:1). Esta composición de los ácidos grasos de reserva, es la que permanece hasta el final de la maduración de la semilla (Baud et al., 2002).

La semilla de Arabidopsis resulta idónea como especie oleaginosa rica en ácidos grasos de cadena larga. La proporción de ácidos grasos predominantes en la semilla madura de ésta es: 30% de 18:2, 20% de 18:3 y 22% de 20:1 (Ohlrogge y Browse, 1995).

Acumulación de proteínas

La deposición de proteínas ocurre durante esta fase de maduración y sigue un patrón sigmoidal, en paralelo con la deposición de lípidos y el aumento en peso seco de la semilla. El nitrógeno de la planta materna llega por el floema a la cubierta de la semilla en la forma de asparagina y glutamina. En la cubierta seminal hay enzimas que interconvierten estos aminoácidos y cambian al entrar al tejido de reserva del embrión y/o endospermo. También el tipo de enzimas de la cubierta varía según la especie de que se trate, del estadío y de las condiciones ambientales, variando el tipo de aminoácido principal de reserva. La concentración de aminoácidos es alta durante la morfogénesis temprana y después declina progresivamente hacia el final la fase de maduración temprana.

Dada la complejidad del transporte de aminoácidos y el alto número de trasportadores putativos en A. thaliana, el conocimiento acerca de la provisión de aminoácidos en la semilla en maduración es todavía muy escaso. Hasta la fecha, se piensa que hay dos proteínas de la subfamilia AAP (amino-acid-permeases) involucradas

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en la provisión de aminoácidos a la semilla en desarrollo, AtAAP1 (At1g58360) y AtAAP8 (At1g10010) (Schmidt et al., 2007). Dentro de la semilla también se dan interconversiones de aminoácidos para almacenar los diferentes tipos necesarios. Cuando empieza la fase de maduración, la semilla de Arabidopsis contiene principalmente: serina, glutamato, glutamina, glicina y alanina. Posteriormente hay un ligero cambio en composición ya que se da un enriquecimiento en valina y leucina hacia día 11 DDP.

La cantidad de proteína total aumenta desde el día 10 hasta día 17 DP, y después los niveles disminuyen ligeramente. En esta misma fase se encuentran abundantemente RNAs mensajeros que codifican proteínas de reserva. Las proteínas de reserva mayoritarias encontradas en Arabidopsis son 12S globulina (cruciferina) y 2S albúmina (arabina) (Baud et al., 2002).

El peso fresco de la semilla sigue aumentando de manera gradual alcanzando un máximo 15 DDP.

3.1.2.2 Estadío de maduración tardía (de 17 hasta 24 DDP)

En esta fase termina la síntesis de los compuestos de reserva. El embrión se vuelve metabólicamente quiescente y tolerante a la desecación. El descenso en el peso fresco de la semilla es muy acusado. Únicamente hay síntesis de oligosacáridos como rafinosa, estaquiosa, sacarosa y trehalosa, a los que se les adjudica un papel osmorregulador. En embriones de Brassica napus (L.) se ha demostrado que un 10% de los TAGs almacenados en el embrión son metabolizados durante esta fase de maduración tardía (Chia -Tansy et al., 2005).

3.2 La germinación de la semilla y el establecimiento de la plántula

3.2.1 La germinación desde un punto de vista global

El proceso de germinación de la semilla empieza con la imbibición de ésta y termina con la emergencia de la radícula rompiendo la cubierta seminal a las 24 horas tras la imbibición. Clásicamente se describen tres fases en la germinación diferenciadas según la toma de agua. En una primera fase la semilla se imbibe y reinicia toda una serie de procesos metabólicos (fase I); en segundo lugar entra en un periodo de detención en la toma de agua (fase II), en este momento la semilla entra en un estado durmiente que sólo será roto para la emergencia radicular (cuando la semilla entre en un estado de alta actividad metabólica y transcriptómica conocido como after-ripening o de ruptura de la dormancia). En la última fase, se reinicia la toma de agua que acaba en la emergencia de la radícula (fase III).

De modo general, el proceso de la germinación abarca un amplio entramado de reacciones metabólicas así como rutas de señalización hormonales y regulación tanto

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transcripcional como post-transcripcional. Las hormonas ABA y GAs juegan un destacado papel en este proceso.

3.2.2 La germinación y establecimiento de Arabidopsis desde el punto de vista metabólico

Cuando empieza la germinación de la semilla de Arabidopsis, las reservas deben ser rápidamente convertidas en metabolitos solubles para que puedan ser transportados a todas las partes de la plántula donde está el tejido en división. Tras la germinación (24 horas tras la imbibición de la semilla), empieza la fase de crecimiento postgerminativo heterótrofo de la plántula que dura unos unos 2 días y en el que la planta usa las reservas. Esta etapa heterotrófica culmina con el establecimiento de la plántula al aparecer el primer par de hojas, y éstas conferirán la capacidad fotosintética a la planta comenzando así la fase de crecimiento fotoautótrofo (Eastmond y Graham, 2001).

En la fase de crecimiento heterótrofo la plántula aún no es capaz de sintetizar de novo sus propias fuentes de carbono de modo que, las reservas, principalmente lipídicas y protéicas, son catabolizadas para aportar a la célula la energía y los intermediarios necesarios para mantener el ritmo de crecimiento y la división celular. Esta movilización de las reservas es crucial en esta fase y tendrá lugar hasta que la plántula alcance el fotoautotrofismo.

3.2.2.1 La movilización de las reservas durante la germinación y el establecimiento de la plántula

La movilización de las reservas lipídicas comprende un conjunto de reacciones bioquímicas de diversas rutas metabólicas y que tienen lugar en distintos compartimentos celulares (figura 12).

En especies con semillas oleaginosas como Arabidopsis, la movilización de los lípidos es un proceso vital. Empieza con la lipolisis de los lípidos almacenados en los liposomas liberando ácidos grasos y glicerol. Los ácidos grasos liberados al citosol son transportados al glioxisoma donde son activados a aciles-CoA. Allí, los aciles-CoA entran en una espiral de oxidaciones denominada �-oxidación produciendo acetil-CoA como uno de los productos finales principales.

La mayoría del acetil-CoA producido va a ser transformado en azúcares por los procesos del ciclo del glioxilato y la ruta de gluconeogénesis, proporcionando a la semilla los esqueletos de carbono y la energía necesaria antes de que la plántula desarrolle la capacidad fotosintetizadora. También, el acetil-CoA procedente de la �-oxidación podrá entrar directamente en la ruta del ciclo de Krebs de la mitocondria, en este caso cuando prime en la célula la provisión de energía respecto a la síntesis de azúcares.

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Figura 12. Esquema de los procesos implicados en la movilización lipídica: (1) Lipolisis de los TAGs (triglicéridos), (2) �-oxidación de los derivados activados de los ácidos grasos (aciles-CoA) produciéndose como producto final acetil-CoA, ciclo del glioxilato con las actividades implicadas (3, citrato sintasa, 4, aconitasa, 5, isocitrato liasa, 6, malato sintasa, 7, malato deshidrogenasa). A) Destino gluconeogénico del succinato (8 y 9, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y via gluconeogénica; B) Destino respiratorio del succinato que entra en el ciclo de Krebs. Adaptado de Eastmond y Graham, 2001.

Destinos del acetil-CoA procedente de la �-oxidación: gluconeogénesis versus respiración de los lípidos

La �-oxidación convierte a los ácidos grasos en moléculas de acetil-CoA. El balance final del ciclo del glioxilato es que dos moléculas de acetil-CoA se condensan para formar succinato. El ciclo del glioxilato es una variante del ciclo de Krebs pero sin los dos pasos descarboxilativos de éste, y tiene lugar parte en el glioxisoma y otra parte en el citosol y en la mitocondria (figura 12). Dos enzimas únicas del ciclo del glioxilato, denominadas malato sintasa (MLS) e isocitrato liasa (ICL), son capaces de evitar los pasos descarboxilativos del ciclo de Krebs y convierten el isocitrato y una molécula de acetil-CoA en succinato y malato. El enzima isocitrato liasa sintetiza succinato y glioxilato a partir del isocitrato. El glioxilato se condensa con otra molécula de acetil-CoA mediante la malato sintasa generando malato y CoA-SH libre. El malato es oxidado por el enzima malato deshidrogenasa para formar oxalacetato y así completar el ciclo. El succinato queda liberado como producto neto del ciclo. En definitiva, el glioxilato, el cual da nombre al ciclo, permite a las células convertir dos unidades de acetil-CoA en compuestos de cuatro carbonos (como succinato). El succinato se puede usar para relleno anaplerótico del ciclo de Krebs o como precursor en el citosol para la síntesis de azúcares por la vía

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de la gluconeogénesis (revisado por Graham y Eastmond, 2002; Kunze et al., 2006; Graham, 2008).

Por otro lado, el citrato del glioxisoma puede exportarse a la mitocondria para seguir el proceso de respiración entrando para ello en el ciclo de Krebs (Pracharoenwattana et al., 2005; revisado por Graham, 2008). Uno u otro destino dependerá de las demandas de azúcar o energía en la célula.

El que los ácidos grasos sean respirados o convertidos a azúcares va a depender también de la especie de planta oleaginosa en cuestión ya que principalmente, unas especies almacenan los lípidos en los cotiledones del embrión formado y otras en el endospermo de la semilla (figura 9). De modo que si el tejido de reserva es tejido endospérmico, dado que éste senesce al germinar la semilla, los lípidos almacenados en el endospermo deberán ser solubilizados, y por tanto convertidos a azúcares, para poder ser transportadas al embrión, el cuál podrá de este modo utilizar dicha energía. La conversión de lipidos a azúcares tiene mucha importancia en este tejido.

Arabidopsis almacena los lípidos mayoritariamente en los cotiledones y por tanto en el embrión. Los cotiledones experimentarán transformaciones importantes para convertirse en tejido fotosintético. En este tejido embriónico el principal requerimiento es obtener energía procedente de la respiración de los lípidos para biosintetizar metabolitos necesarios para dar soporte al crecimiento y expansión celular, en lugar de convertir los lípidos a azúcares como ocurría con el tejido del endospermo (revisado por Eastmond y Graham, 2001).

Como se comentó en el apartado 2.1, un 14% del total de los lípidos de Arabidopsis se localizan en el tejido del endospermo y en la cubierta seminal (Yonghua et al., 2006) y esta fracción de lípidos del endospermo se utilizará durante el crecimiento post-germinativo por la vía de la gluconeogénesis. A día 3 tras la imbibición de la semilla, ya se habrán consumido los lípidos procedentes del endospermo, antes que los lípidos que aún permanecen en el embrión (Penfield et al., 2006).

3.2.2.1.1 Lipolisis

Este primer paso tiene lugar dentro de organelos especializados denominados liposomas. Las lipasas son enzimas encargadas de llevar a cabo la hidrólisis de los triglicéridos (TAGs), dando lugar a ácidos grasos y glicerol, y están asociadas a la membrana del liposoma. Poco se sabe acerca del mecanismo de la lipólisis de plantas o de su regulación. Recientemente, se ha demostrado que las lipasas desempeñan un papel crucial para llevar a cabo el crecimiento post germinativo de la plántula. Tras un rastreo genético de dependencia de sacarosa para el establecimiento de la plántula, se han identificado 6 nuevos loci de mutantes sugar-dependent (sdp). El mapeo posicional de sdp1 muestra que el gen SDP1 pertenece a una familia no ortodoxa de sugar-dependent-patatin-like-TAG-lipasas con capacidad para hidrolizar los TAGs. SDP1 es el primer miembro de esta familia caracterizado en plantas y que muestra un papel

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conservado en eucariotas crucial para iniciar la movilización de los lípidos. Semillas del mutante sdp1 germinan pero tienen afectada la movilización lipídica y, en consecuencia, el crecimiento post germinativo en estos mutantes está retrasado, aunque no impedido completamente (Eastmond, 2006).

3.2.2.1.2 Transporte al peroxisoma y activación de los ácidos grasos

Los ácidos grasos son transportados al interior del peroxisoma/glioxisoma, donde tendrán lugar los procesos de �-oxidación y el principio de la ruta del glioxilato. Los glioxisomas son organelos de estructura idéntica al peroxisoma pero metabólicamente diferentes ya que los glioxisomas contienen dos enzimas específicos del ciclo del glioxilato (malato sintasa e isocitrato liasa).

Por un lado, y dada la localización próxima entre los liposomas y los glioxisomas, se ha postulado que en algunos casos puede existir un transporte directo de los ácidos grasos del liposoma al glioxisoma por invaginación entre ambos organelos (Hayashi Y. et al., 2001).

Adicionalmente, se propone en la literatura que existe una activación de los ácidos grasos tanto dentro como fuera del peroxisoma. Se ha descrito en plantas un transportador de ácidos grasos de cadena larga denominado ABC (ATP- binding-cassette) que mantiene un 42% de identidad de secuencia con la proteína ALDP (Adreno-Leuko-Dystrophy-Portein) de mamíferos. Este ortólogo en Arabidopsis ha sido identificado a través de tres rastreos genéticos independientes en los que se mostraba una dependencia de fuente de sacarosa en el medio para alcanzar el establecimiento de la plántula. Se han descrito 3 alelos mutantes de este gen: pxa1 (peroxisomal-ATP-binding-cassete-transporter) (Zolman, et al., 2001), cts (comatose, denominación que responde a estado de coma o estado profundamente durmiente de los mutantes en dicho locus) (Footitt et al., 2002) o ped3 (peroxisoma deficient 3) (Hayashi M. et al., 2002). Los mutantes de pérdida de función cts producen semillas que tienen impedida la rotura de los TAGs a ácidos grasos y una dormancia acentuada. Este hecho pone de manifiesto el papel de la �-oxidación en la rotura de la dormancia (revisado por Graham, 2008). Además, los mutantes cts, una vez germinados no son capaces de establecerse fotosintéticamente, debido a que no entran ácidos grasos al peroxisoma para ser �-oxidados y, posteriormente, no pueden ser convertidos en azúcares por la gluconeogénesis. Este defecto en establecimiento puede ser rescatado cuando se añade sacarosa al medio de crecimiento. Estos hechos involucran directamente a CTS en el transporte de los ácidos grasos al interior del peroxisoma que una vez dentro, son activados a aciles-CoA por las dos únicas acil-CoA sintetasas (ACS) cuya localización es peroxisomal. Concretamente éstas están asociadas a la parte del lumen de la membrana interna del peroxisoma y catalizan la síntesis de aciles-CoA de cadena larga. Dichas proteínas están codificadas por los genes LACS6 y LACS7 (Fulda et al., 2002; Fulda et al., 2004). Las proteínas CTS y LACS actuan en cascada en la misma ruta y en ese orden (figura 13).

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Por otro lado, los ácidos grasos que no son transportados al peroxisoma deben ser convertidos a ésteres de acil-CoA en el citosol por otras ACS citosólicas (Shockey et al., 2002). De ahí que mutantes como cts o el doble lacs6lacs7 muestren niveles de aciles-CoA muy altos y además no muestren peroxisomas amorfos (como sería de esperar por una acumulación de estas especies en este organelo). El doble mutante de pérdida de función en los genes LACS6 y 7 (lacs6-1lacs7-1), muestra un defecto específico en la movilización de los lípidos y requiere sacarosa exógena para el establecimiento de la plántula (Fulda et al., 2004), al igual que ocurre con mutantes ped3/pxa1/cts.

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Figura 13. Rutas y procesos involucrados en la movilización de los lípidos que se han caracterizado funcionalmente mediante análisis genético en Arabidopsis thaliana. Se muestran los enzimas de la �-oxidación. También los enzimas implicados en los procesos del glioxilato, fotorrespiración, respiración del ciclo de Krebs y gluconeogénesis. En primer lugar, la toma de ácidos grasos al interior del peroxisoma está mediada por el transportador CTS. Dentro del peroxisoma los ácidos grasos de cadena larga son activados a aciles-CoA por los enzimas LACS6 y LACS7. A continuación tiene lugar la espiral �-oxidativa de los aciles-CoA mediada por los enzimas: ACX, MFP1, MFP2 y KAT. En el ciclo del glioxilato, una molécula de acetil-CoA entra en el ciclo del glioxilato y se condensa con el oxalacetato (OAA) para formar citrato a través del enzima citrato sintasa (CSY). Los ácidos orgánicos atraviesan la membrana del peroxisoma por difusión. El citrato sale del peroxisoma al citosol, donde es convertido en isocitrato por el enzima aconitasa citosólica (ACO) y tras acción de la isocitrato liasa (ICL), se forman como productos succinato y glioxilato. El glioxilato se combina con otra molécula de acetil-CoA para formar malato catalizado por otro enzima específico del ciclo, la malato sintasa (MLS). El malato sale al citosol donde se convierte primero en oxalacetato por una malato deshidrogenasa (MDH1). El enzima PCK (fosfoenolpiruvato carboxiquinasa) transforma el OAA en PEP para seguir la vía gluconeogénica. Adaptado de Graham, 2008.

3.2.2.1.3 �-oxidación de los ácidos grasos (saturados) en semillas

�-oxidación del peroxisoma

Definición y localización intracelular

La �-oxidación es la ruta principal de degradación de ácidos grasos en las células, siendo este proceso esencial para los seres vivos. Esta ruta catabólica, descubierta a principios del siglo XX por Franz Knoop, ha sido objeto de investigación en los últimos años por su implicación en múltiples procesos, no sólo de defensa en animales, hongos y plantas, del metabolismo de hormonas como el ácido jasmónico o las auxinas, sino también porque es el proceso metabólico principal de las semillas oleaginosas durante las etapas de germinación y crecimiento post-germinativo heterótrofo (revisado por Baker et al., 2006; Poirier et al., 2006; Graham, 2008).

En el balance final de la �-oxidación el acil-CoA sufre la rotura del extremo carboxilo terminal quedando finalmente un acil-CoA con dos unidades de carbono menos y una molécula de acetil-CoA, se forman también los cofactores FADH2 y NADH, y se consume una molécula de CoASH. En plantas, la �-oxidación ocurre específicamente en peroxisomas y continúa hasta que el ácido graso es completamente degradado. En plantas, se ha descrito un tipo de �-oxidación mitocondrial que intervendría en el catabolismo de aminoácidos para incorporar acetil-CoA en el ciclo de Krebs (Dieuaide et al., 1993; Masterson y Wood, 2001).

Componentes de la �-oxidación en plantas

La �-oxidación peroxisomal implica cuatro reacciones enzimáticas secuenciales (Cooper y Beevers, 1969; Gerhardt, 1992) realizadas por tres enzimas codificados por familias multigénicas.

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Dentro del núcleo de la �-oxidación (figuras 13 y 14), la primera reacción enzimática está catalizada por acil-CoA oxidasas (ACX) que oxidan los aciles-CoA a sus correspondientes 2-trans-enoil-CoA derivados. Esta actividad conlleva la formación paralela de flavina reducida (FADH2), la cual es reoxidada utilizando como aceptor de electrones O2 produciendo H2O2. En el siguiente paso, la degradación de los ácidos grasos saturados de cadena simple requiere las actividades: trans-2-enoil-CoA hidratasa y 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, que catalizan la hidratación de los 2-trans-enoil-CoA derivados a 3-hidroxiacil-CoA derivados y la subsiguiente oxidación a 3-cetoacil-CoA derivados, con la consiguiente formación de NADH. Ambas reacciones son catalizadas por una proteína multifuncional (MFP) que posee ambas actividades enzimáticas. En el paso final de la �-oxidación, el enzima 3-cetoacil-CoA tiolasa (KAT) cataliza la rotura del enlace tioéster del 3-cetoacil-CoA, liberando acetil-CoA, producto final de la ruta, y el correspondiente acil-CoA con dos unidades de carbono menos, el cuál es susceptible de una nueva ronda de �-oxidación.

Figura 14. Ruta central de la �-oxidación de ácidos grasos saturados en peroxisomas de plantas. La �-oxidación consta de cuatro reacciones secuenciales catalizadas por tres enzimas: ACXs, MFPs y KATs, las cuales están codificadas por varios genes en Arabidopsis. Adaptado de Baker et al., 2006.

3.2.2.1.4 Ciclo del glioxilato

3.2.2.1.4.1 Ciclo del glioxilato y gluconeogénesis

El acetil-CoA procedente de la �-oxidación de los lípidos es convertido en sacarosa a través del ciclo del glioxilato y la gluconeogénesis, permitiendo a las células vegetales utilizar ácidos grasos como fuente única de carbono (figura 12).

Acil-CoA sintetasas, ACS

Ácido graso

Acetil-CoA + acil-CoA (-�0�

Acil-CoA oxidasas, ACX

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Una molécula de acetil-CoA entra en el ciclo del glioxilato y se condensa con el oxalacetato para formar citrato a través del enzima citrato sintasa (CSY). El citrato sale del peroxisoma al citosol, donde se isomeriza a isocitrato por el enzima aconitasa citosólica (ACO) y tras acción secuencial de un enzima especifico del ciclo del glioxilato, la isocitrato liasa (ICL) del glioxisoma, el isocitrato es escindido en succinato y glioxilato (intermediario que da nombre a este ciclo). El glioxilato se condensa con otra molécula de acetil-CoA para formar malato, paso catalizado por otro enzima específico del ciclo, la malato sintasa (MLS). El malato sale al citosol, donde se oxida primero en oxalacetato por una malato dehidrogenasa (MDH1) (figura 13).

Este oxalacetato (OAA) puede transformarse en fosfoenolpiruvato (PEP) por la PEP carboxiquinasa (PCK1). El PEP, finalmente mediante reacciones inversas a la glicólisis, se convierte en fructosa 1,6-bifosfato. Esta conversión del oxalacetato citosólico en azúcares se denomina gluconeogénesis (figuras 12 y 13). Los carbohidratos solubles formados irán a formar parte de los componentes de la pared celular o se convierten en sacarosa, que podrá ser transportada a los tejidos de la planta que estén en crecimiento y desarrollo (revisado por Eastmond y Graham, 2001).

El gen PCK1 se expresa en embrión pero en más alta cantidad en endospermo. Líneas de RNA de antisentido con reducción de actividad en PCK1 muestran un requerimiento absoluto del enzima en la gluconeogénesis endospérmica para que la plántula lleve a cabo el establecimiento. Además, las líneas muestran menor producción de azúcares gluconeogénicos y una mayor respiración mitocondrial del acetil-CoA (Rylott et al., 2003). Mutantes de T-DNA en los genes PCK-1 y PCK-2 demuestran el papel clave de la actividad PCK para exportar azúcares desde el endospermo al embrión durante el crecimiento post-germinativo, mostrando una reducción del hipocotilo en la oscuridad. La eliminación del endospermo en semillas del ecotipo silvestre conducía a una reducción del hipocotilo en condiciones de oscuridad. Las reservas del endospermo tienen un papel central en la escotomorfogénesis. Cuando el endospermo era eliminado en mutantes pck1-1 o en pck2-1, no había una reducción adicional del hipocotilo en oscuridad, corroborando la hipótesis de que los azúcares gluconeogénicos del endospermo son los responsables de la escotomorfogénesis (Penfiend et al., 2004). Este fenotipo puede ser también rescatado añadiendo sacarosa al medio de cultivo.

En general, mutantes de Arabidopsis que tienen impedida la actividad de los enzimas del ciclo del glioxilato ICL y MLS, o de la gluconeogénesis, como PCK1, muestran un defecto en el alargamiento del hipocotilo en la oscuridad. Este fenotipo puede ser también rescatado añadiendo sacarosa al medio de cultivo, al igual que ocurría con mutantes afectados en la �-oxidación.

3.2.2.1.4.2 Ciclo del glioxilato y gluconeogénesis mediante la ruta de fotorrespiración

Mutantes de pérdida de función en el gen de copia única del ciclo del glioxilato mls-1 muestran también una menor tasa de establecimiento en ausencia de sacarosa y el

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fenotipo de alargamiento de hipocotilo dependiente de sacarosa en la oscuridad, al igual que los mutantes icl. En cambio, tienen aún menos impedido que los mutantes icl el establecimiento de plántula en ausencia de sacarosa ya que, aún con la pérdida de actividad del enzima MLS, el acetil-CoA se puede todavía usar en la ruta de gluconeogénesis porque el glioxilato sintetizado por el enzima ICL puede ser metabolizado por una ruta alternativa fotorrespiratoria tras su conversión en glicina, de modo que mutantes mls aún serían capaces de realizar gluconeogénesis (Cornah et al, 2004) (figuras 13 y 15).

Figura 15. Destinos alternativos del glioxilato en el peroxisoma. Destacando la ruta de

fotorrespiración del glioxilato que permite llevar a cabo la gluconeogénesis en ausencia del enzima MLS del

ciclo del glioxilato. Esta fotorrespiración comienza por el glioxilato, que se transforma en glicina, y tras una

serie de reacciones entre la mitocondria, el peroxisoma y finalmente en el cloroplasto y el citosol, donde se

sintetiza sacarosa. Abreviaturas: PC (Photorespiratory cycle), GC (Glyoxylate cycle), CC (Calvin cycle), OAA

(oxalacetate), OH-Pyr (Hydroxypiruvate), 3PGA (3-Phosphglycerate), RuBP (Ribulose-1,5-bisphosphate).

Obtenido de Cornah et al., 2004.

3.2.2.1.5 Respiración de los lípidos

El acetil-CoA producido en la �-oxidación puede pasar directamente al ciclo de Krebs de la mitocondria sin necesidad del funcionamiento del ciclo del glioxilato (figuras 11 y 12 ), (Eastmond et al., 2000; Pracharoenwattana et al., 2005; Pracharoenwattana et al., 2007).

Mutantes de pérdida de función en el gen de copia única ICL del ciclo del glioxilato (icl-1/icl-2), tienen impedido el funcionamiento del ciclo del glioxilato y la gluconeogénesis, por lo que muestran un defecto en el alargamiento del hipocotilo cuando el aporte externo de sacarosa no es apropiado. Estos mutantes son capaces de movilizar los TAGs, a pesar de tener bloqueado el ciclo del glioxilato, por lo que aportan la primera demostración de que los ácidos grasos también pueden ser respirados. Además, se demuestra también que el ciclo del glioxilato no es esencial ni en germinación ni durante

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el crecimiento post-germinativo. También en ausencia de sacarosa muestran cierta incapacidad para establecer plántula, pero no es el fenotipo drástico observado en mutantes afectados en la �-oxidación (Eastmond et al., 2000; Cornah et al., 2004).

Se postula que en plantas el acetil-CoA se exporta fuera del peroxisoma en forma de citrato, el cual atraviesa la membrana del peroxisoma. Del citosol se transporta a la mitocondria, donde será respirado por la vía del ciclo de Krebs. El citrato se sintetiza a través del enzima citrato sintasa del peroxisoma (CSY) a partir del oxalacetato y una molécula de acetil-CoA procedente de la �-oxidación lipídica. Existen tres genes que codifican la CSY pero sólo dos de ellos tienen un papel activo durante la germinación y el establecimiento. El doble mutante csy2-1csy3-1 muestra el fenotipo más extremo en mutantes del ciclo del glioxilato y de la �-oxidación ya que son incapaces de movilizar los lipidos, al contrario de lo que ocurría en mutantes icl, y además afecta a la respiración de los ácidos grasos, ya que el acetil-CoA no puede ser transportado a la mitocondria. Posiblemente, el que el acetil-CoA no pueda seguir siendo metabolizado bloquea la �-oxidación de los lípidos y el metabolismo de los TAGs. En consecuencia, las semillas csy2-1csy3-1 se mantienen durmientes hasta que se elimine la cubierta seminal y este fenotipo no es rescatado si sólo se añade sacarosa al medio. Se argumenta que este defecto se debe a la falta de energía respiratoria en el doble mutante para iniciar el proceso de germinación. Sin embargo, otro mutante con fenotipo durmiente, como se comentó en su apartado, es cts (Footitt et al., 2002), y en este caso la provisión de sacarosa tampoco era suficiente para inducir la germinación. Ambos mutantes contribuyen a reforzar la idea de que en germinación la �-oxidación juega un papel adicional al de proveer energía o esqueletos carbonados a la célula. Es decir, se postula que existe un papel señalizador de los lípidos en el control de la germinación aunque se desconoce todavía si es debido a la síntesis de una molécula señalizadora, o a su eliminación, a través de la �-oxidación. Tampoco el doble mutante llega a desarrollarse a planta adulta, indicando de nuevo el papel esencial de la �-oxidación en este estadío (Pracharoenwattana et al., 2005).

3.2.2.2 Papel de la �-oxidación de los lípidos en el desarrollo embrionario, en la germinación y en el establecimiento de la plántula

El correcto catabolismo de los lípidos es esencial para que la plántula pueda germinar y llevar a cabo el crecimiento post germinativo hasta su establecimiento. Este proceso incluye, como hemos descrito en los apartados anteriores, la hidrólisis de los ácidos grasos, su transporte y/o activación, la �-oxidación y la vía respiratoria para obtener energía, o el ciclo del glioxilato y la gluconeogénesis para obtener esqueletos carbonados. Se han llevado a cabo abordajes genéticos y bioquímicos en Arabidopsis que han permitido la identificación y la caracterización de los genes involucrados en casi todos estos procesos. Los mutantes de pérdida de función para los enzimas principales en estos procesos muestran fenotipos, con mayor o menor fuerza, similares y han resultado muy útiles para asignar a cada uno de estos procesos su papel en el metabolismo temprano de la plántula. En la tabla 3 se presenta una lista de los mutantes disponibles hasta el momento para los distintos pasos de este proceso.

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Tabla 3. Listado de algunos de los mutantes afectados en los distintos procesos implicados en la movilización de los lípidos. Se presentan mutantes en genes implicados en la lipólisis (sdp1), en genes que actúan en los procesos del glioxisoma (desde cts hasta csy, incluyendo mutantes afectados en enzimas específicos del glioxilato, como mls o icl), o mutantes afectados en la gluconeogénesis (como pck1). Se muestra también en las dos últimas columnas el principal fenotipo observado en cada mutante. Adaptado de Graham, 2008.

En primer lugar, el mutante sdp1, de pérdida de actividad en una TAG lipasa, aunque no tiene afectada la germinación, muestra un retraso para establecer plántula que es rescatado cuando se adiciona sacarosa al medio de cultivo. Medidas de TAGs en el mutante crecido en medio con sacarosa mostraban acumulación de los TAGs, apuntando a incapadidad en catabolizarlos. Además, los niveles de aciles-CoA de cadena larga eran

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significativamente muy bajos, con lo que se demostraba el impedimento en la hidrólisis de los lípidos (Eastmond, 2006; Quettier y Eastmond, 2008).

En segundo lugar, los ácidos grasos hidrolizados son transportados al interior del peroxisoma por medio del transportador CTS (ABC; ATP-binding-cassette). Mutantes de pérdida de función en dicho transportador, cts/ped3/pxa1, producen semillas que tienen impedida la rotura de los TAGs a ácidos grasos y una dormancia acentuada, poniendo en evidencia el papel de la �-oxidación en la rotura de la dormancia para la germinación. Este fenotipo no es rescatado por adición de sacarosa al medio de cultivo y sólo si se elimina el impedimento fisiológico de la cubierta seminal, germinan. Este mismo fenotipo muestra el doble mutante en el enzima encargado de transportar fuera del peroxisoma para su respiración el acetil-CoA producido en la �-oxidación, el doble mutante csy2-1csy3-1. Éste tiene bloqueada la �-oxidación, demostrándose su papel en germinación adicional al de proveer energía o esqueletos carbonados. Adicionalmente y al igual que ocurría con sdp1, en el mutante cts/ped3/pxa1 sin la presencia de sacarosa en el medio de crecimiento que compense el bloqueo en la movilización de los lípidos, el establecimiento de la plántula no tiene lugar y se detiene el crecimiento post-germinativo. En este caso, el mutante acumula aciles-CoA en alta cantidad (Zolman et al., 2001; Footitt et al., 2002; Hayashi et al., 2002; revisado por Graham, 2008).

Una vez entran los ácidos grasos de cadena larga al peroxisoma, son activados por las acil-CoA sintetasas (ACS) de cadena larga 6 y 7 (LACS6 Y LACS7) ubicadas en el lúmen peroxisomal (Fulda et al., 2004). El doble mutante de pérdida de función en LACS, lacs6-1lacs7-1, muestra un defecto específico en la movilización de los lípidos y requiere sacarosa exógena para el establecimiento de la plántula y acumula también acil-CoAs (Fulda et al., 2004).

Dentro de la espiral de la �-oxidación, se han caracterizado mutantes de pérdida de función en las seis acil-CoA oxidasas (ACX) (Adham et al., 2005; Eastmond et al., 2000; Pinfield-Wells et al., 2005; Rylott et al., 2003). Dada la redundancia funcional existente entre ellas, en los mutantes simples para estas enzimas no hay ningún efecto en germinación ni en establecimiento de la plántula así como en el flujo de utilización de los lípidos. Sin embargo, el doble mutante acx3-1acx4-1 muestra letalidad embrionaria durante la primera fase de la embriogénesis. Esto se explica por una completa inhibicion de la actividad acil-CoA oxidasa de aciles-CoA de cadena corta (Rylott et al., 2003). El fenotipo de letalidad embrionaria implica que la �-oxidación tiene también un papel fundamental durante el desarrollo del embrión. De hecho, recientemente se ha demostrado que en embriones de Brassica napus un 10% de los lípidos almacenados son �-oxidados durante el desarrollo embrionario (Chia-Tansy et al., 2005). Se postula que el que la letalidad sea tan temprana en el doble acx3-1acx4-1 se debe a acumulación de aciles CoA de cadena corta que producen un efecto tóxico, o bien a que disminuyan los niveles de CoA por esterificación con estos aciles, o bien porque disminuye la biosíntesis de ácidos grasos o de moléculas señalizadoras derivadas de éstos (Rylott et al., 2003; revisado por Graham 2008).

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El doble mutante acx1-1acx2-1 (Adham et al., 2005; Pinfield-Wells et al., 2005) es capaz de germinar pero, en ausencia de fuente de carbono en el medio, de nuevo muestra incapacidad para alcanzar el establecimiento de la plántula debido a un bloqueo en la �-oxidación de los lípidos. Como consecuencia, este mutante acumula aciles-CoA de cadena larga dentro del peroxisoma, dando lugar a peroxisomas amorfos. Este doble mutante, al igual que el mutante cts, muestra una dormancia acentuada independiente de la presencia de sacarosa en el medio y que sólo puede ser rota por tratamientos con frio o de rotura de la cubierta seminal, y apunta de nuevo a un papel de la b-oxidación adicional al de la provisión de azúcares en los procesos de rotura de dormancia y germinación (Pinfield-Wells et al., 2005).

Existen dos isoformas de la proteína multifuncional MFP, una de ellas se ha descrito como AIM1/MFP1 (abnormal inflorescence meristem). AIM1 se expresa predominantemente en silicuas y flores, y el mutante aim1 muestra un meristemo floral anormal y desorganizado y da lugar a una severa infertilidad (Richmond et al., 1999). La otra isoforma, MFP2, se expresa predominantemente durante la germinación. El mutante mfp2 en cambio muestra defecto en la movilización de los lípidos, ya que requiere sacarosa exógena para alcanzar el establecimiento de la plántula. También acumula aciles-CoA de cadena larga dentro del peroxisoma, dando lugar a peroxisomas de mayor tamaño (Rylott et al., 2006). Así mismo, el doble mutante mfp2-1aim1 muestra letalidad embrionaria en los primeros estadios de desarrollo, al igual que ocurre con el doble acx3acx4.

Este mismo fenotipo de incapacidad para establecer plántula en ausencia de sacarosa y morfogía de peroxisoma amorfa se observa en el mutante para el último paso de la ruta, ped1/kat2 (peroxisome deficient) (Hayashi H. et al., 1998; Germain et al., 2001; Rylott et al., 2001). El consumo de los ácidos grasos está casi totalmente bloqueado en este mutante.

Se postula que alterar los niveles de aciles-CoA debe jugar un papel importante en la regulación de diversos procesos celulares, entre los que se incluyen el tamaño de los peroxisomas y la movilización de los lípidos. En cualquier caso faltan más estudios para establecer hasta qué punto el bloquear la �-oxidación resulta en un bloqueo en la movilización de los lípidos desde el liposoma, y si es consecuencia directa de este hecho el aumento en los niveles de aciles-CoA. Existe una evidencia de una lipasa de la especie Ricinus communis regulada negativamente in vitro por la mezcla de CoA y oleoil-CoA, lo cual apunta a un posible papel regulador de los aciles-CoA sobre la lipasa de Arabidopsis SDP1 (Hills et al., 1989; Quettier y Eastmond, 2008).

Recientemente también se ha observado que un mutante de pérdida de función en los dos genes que codifican la malato deshidrogenasa del peroxisoma (PMDH), pmdh1pmdh2, tiene severamente afectada la �-oxidación y el establecimiento de la plántula también depende de la adición de azúcares exógenos. Sin embargo, el ciclo del glioxilato está intacto, dado que el mutante es capaz de realizar las actividades del ciclo del glioxilato y de la gluconeogénes (Pracharoenwattana et al., 2007).

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4. Regulación de la expresión génica en la movilización lipídica

4.1 Regulación a nivel de la transcripción de genes implicados en movilización lipídica durante la germinación y el crecimiento post-germinativo

Tras la imbibición de la semilla, se inducen de manera coordinada muchos de los genes involucrados en la movilización lipídica, lo que se refleja en el nivel de proteína y en las actividades de estos enzimas. Los genes ACX1, ACX2, ACX3 y ACX4 de la familia de las acil-CoA oxidasas, el gen MFP2 que codifica la proteína multifuncional y el gen KAT2 que codifica la tiolasa, implicados todos en la �-oxidación, muestran mayores niveles de RNAm durante la etapa de germinación. El incremento en los niveles de transcrito culmina con el máximo a los 2 días tras la imbibición de la semilla, coincidiendo con la etapa de crecimiento heterótrofo, y después empiezan a declinar (Rylott et al, 2001). Este mismo perfil de inducción muestran coordinadamente los enzimas MLS e ICL del ciclo del glioxilato y el enzima de la gluconeogénesis, PCK1.

La regulación sobre ambos procesos (�-oxidación y gluconeogénesis) opera dominantemente a nivel de la transcripción (revisado por Graham 2008).

4.2 Ayuno de carbohidratos. Efecto de la sacarosa en los procesos de movilización de los lípidos

Además de su función metabólica, los azúcares solubles desempeñan un papel importante en la regulación de muchos genes relacionados con procesos fisiológicos como la aclimatación al estrés, y procesos de desarrollo entre los que se incluyen: la fotosíntesis, la asimilación de nitrato, asimilación de las reservas o en el almacenamiento y movilización de éstas (Martin et al., 2002).

Células de pepino privadas de carbohidratos, muestran una inducción de genes clave del ciclo del glioxilato, como son MLS e ICL, y del mismo modo se reprimen bajo condiciones de alta concentración de azúcares (Graham et al., 1994). Sin embargo, en plántulas de Arabidopsis la adición de sacarosa al medio no muestra un efecto sobre la transcripción de los genes de la �-oxidación o del glioxilato (Rylott et al., 2001).

No obstante, se ha comprobado que la adición de sacarosa al medio de crecimiento, retrasa significativamente el ritmo de degradación de los lípidos en plántulas jóvenes de Arabidopsis (Eastmond et al., 2000). Igualmente, la glucosa exógena retarda la movilización de los lípidos en semillas de Arabidopsis en germinación. Además, el efecto inhibitorio de la glucosa sobre la movilización ocurre sólo en la ventana de tiempo de 3 días tras la imbibición de la semilla; a partir de este tiempo algún cambio metabólico cambia la sensibilidad a la inhibición (To et al., 2002). Adicionalmente, este efecto además es promovido si se reduce la disponibilidad de nitrato en el medio. En concreto el

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cociente sacarosa/nitrógeno tiene efecto regulador en la movilización de las reservas (Martin et al., 2002).

4.3 Señalización de la sacarosa en el metabolismo

Azúcares como la glucosa o la sacarosa tienen un papel importante en la regulación transcripcional o post-transcripcional de muchas vías metabólicas y de señalización (Smeekens et al., 2000; Martin et al., 2002). Los azúcares inducen genes implicados en la asimilación de nitratos, como son los que codifican la nitrato reductasa, NTR1 y NTR2, o genes del sistema de alta afinidad de toma de nitrato. A su vez reprimen otros genes del metabolismo del nitrógeno, como es el que codifica la asparagina sintetasa dependiente de glutamina, ASN1. En el mismo sentido, los niveles de prolina varían en respuesta a los niveles de azúcares en la célula (Hayashi et al., 2000). Esta respuesta está mediada por la regulación transcripcional de los genes P5CS1 y P5CS2 ,que codifican el enzima delta1-pirrolina-5-carboxilasa sintetasa, implicada en la síntesis de prolina, y de prolina deshidrogenasa (ProDH), encargada de la degradación de la prolina.

Reprimen también muchos genes de los procesos de fotosíntesis. Así, se ha comprobado que el enzima hexoquinasa detecta los azúcares de hexosa en las plantas y genera una señal que disminuye la transcripción de genes nucleares codificadores de la fotosíntesis y del ciclo del glioxilato (Oswald et al., 2001).

Los efectos en el transcriptoma en respuesta a diversos tratamientos de azúcares son masivos. Se dispone en la bibliografía de un alto número de elementos-CIS identificados en promotores de respuesta a azúcares. Se han identificado factores de transcripción como MYB75/PAP1 que regula la síntesis de antocianinas, u otros involucrados en ambas funciones, la señalización por la hormona ABA y por azúcares durante la germinación y que son: HSI2, HSL1, HSL2, ABI4, ABI5 y ABI8. También el factor de transcripción EIN3 está regulado por glucosa y por etileno. Asímismo, el factor BZIP11 está reprimido en presencia de sacarosa y se ha observado que puede modular la expresión de cientos de genes involucrados en rutas bioquímicas o en la transducción de la señal. BZIP11 regula la síntesis de aminoácidos en respuesta a azúcares a través de la regulación de la expresión de, entre otros, los enzimas asparagina sintetasa1 (ASN1) o prolina deshidrogenasa2 (ProDH2) (Hanson et al., 2008).

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II. Objetivos

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El análisis fisiológico de pérdida de función con T-DNA en genes de la ruta de síntesis del CoA no había sido realizado anteriormente. El uso de estos mutantes nos ha permitido abordar dos objetivos principales: demostrar la esencialidad de la síntesis del CoA en plantas y analizar los efectos de alterar los niveles de este cofactor en la fisiología y en el metabolismo de la planta, así como sus posibles aplicaciones biotecnológicas.

Concretamente, los aspectos fundamentales que se abordan en este trabajo son los siguientes:

1. Aislamiento y caracterización de mutantes de T-DNA en los dos genes del paso de biosíntesis que cataliza el enzima 4´-fosfopantotenoil-cisteína descarboxilasa, denominados AtHAL3A y AtHAL3B. Análisis fenotípico de mutantes heretozigotos para uno de los genes y homozigotos para el otro gen: mutantes aaBb y Aabb, así como de los mutantes homozigotos simples hal3a-1 y hal3b. Estudio de la respuesta de estos mutantes en el proceso de establecimiento de plántula. Estudio de la influencia de una fuente de carbono exógena en el proceso de establecimiento. Análisis de los perfiles de ácidos grasos y de aciles-CoA en dichos mutantes. Fenotipos durante el desarrollo vegetativo y reproductivo. Respuesta al estrés salino de estos mutantes en presencia y en ausencia de sacarosa en el medio.

2. Aislamiento y caracterización de un mutante de T-DNA del paso de biosíntesis que cataliza el enzima fosfopanteteína adenilato transferasa, (PPAT). Generación y caracterización de líneas de sobreexpresión (OE) de dicho gen (35S:PPAT). Estudio de la respuesta de mutantes ppat-1 en el proceso de establecimiento de la plántula en medio suplementado con sacarosa y sin suplementar. Estudio de la influencia de una fuente de carbono exógena en el proceso de establecimiento. Análisis de los perfiles de ácidos grasos y de aciles-CoA en ppat-1. Efecto de sobreexpresar dicho gen sobre los niveles de CoA y de aciles-CoA. Efecto de la sobreexpresión del gen PPAT en el crecimiento de la planta, en la respuesta al estrés salino/osmótico y en los niveles de ácidos grasos de la semilla. Análisis del mecanismo de regulación bioquímica del enzima PPAT recombinante.

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III. Resultados

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“An Arabidopsis mutant impaired in coenzyme A biosynthesis is sugar dependent for seedling establishment ”

Rubio S, Larson TR, Gonzalez-Guzman M, Alejandro S, Graham IA, Serrano R, Rodriguez PL=�

Plant Physiol., 2006 Mar

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An Arabidopsis Mutant Impaired in Coenzyme ABiosynthesis Is Sugar Dependent forSeedling Establishment1

Silvia Rubio, Tony R. Larson, Miguel Gonzalez-Guzman, Santiago Alejandro, Ian A. Graham,Ramon Serrano, and Pedro L. Rodriguez*

Instituto de Biologıa Molecular y Celular de Plantas, Universidad Politecnica de Valencia-ConsejoSuperior de Investigaciones Cientıficas, E–46022 Valencia, Spain (S.R., M.G.-G., S.A., R.S., P.L.R.);and Centre for Novel Agricultural Products, Department of Biology, University of York,York YO10 5YW, United Kingdom (T.R.L., I.A.G.)

Once the plant coenzyme A (CoA) biosynthetic pathway has been elucidated by comparative genomics, it is feasible to analyzethe physiological relevance of CoA biosynthesis in plant life. To this end, we have identified and characterized Arabidopsis(Arabidopsis thaliana) T-DNA knockout mutants of two CoA biosynthetic genes, HAL3A and HAL3B. The HAL3A gene encodesa 4#-phosphopantothenoyl-cysteine decarboxilase that generates 4#-phosphopantetheine. A second gene, HAL3B, whose geneproduct is 86% identical to that of HAL3A, is present in the Arabidopsis genome. HAL3A appears to have a predominant roleover HAL3B according to their respective mRNA expression levels. The hal3a-1, hal3a-2, and hal3b mutants were viable andshowed a similar growth rate as that in wild-type plants; in contrast, a hal3a-1 hal3b double mutant was embryo lethal.Unexpectedly, seedlings that were null for HAL3A and heterozygous for HAL3B (aaBb genotype) displayed a sucrose (Suc)-dependent phenotype for seedling establishment, which is in common with mutants defective in b-oxidation. This phenotypewas genetically complemented in aaBB siblings of the progeny and chemically complemented by pantethine. In contrast,seedling establishment of Aabb plants was not Suc dependent, proving a predominant role of HAL3A over HAL3B at this stage.Total fatty acid and acyl-CoA measurements of 5-d-old aaBb seedlings in medium lacking Suc revealed stalled storage lipidcatabolism and impaired CoA biosynthesis; in particular, acetyl-CoA levels were reduced by approximately 80%. Takentogether, these results provide in vivo evidence for the function of HAL3A and HAL3B, and they point out the critical role ofCoA biosynthesis during early postgerminative growth.

CoA is a cofactor for a multitude of enzymaticreactions, including the oxidation of fatty acids, carbo-hydrates, and amino acids, as well as many syntheticreactions (Begley et al., 2001). CoA is synthesized in fivesteps from pantothenate, and recently all the biosyn-thetic enzymes have been cloned in both prokaryotesand higher eukaryotes (Begley et al., 2001; Daughertyet al., 2002; Kupke et al., 2003; Leonardi et al., 2005).Indeed, both in humans and plants, the completebiosynthetic pathway from pantothenate to CoA hasbeen reconstituted in vitro using recombinant enzymes(Daugherty et al., 2002; Kupke et al., 2003). The univer-sal pathway for biosynthesis of CoA frompantothenateis initiated by phosphorylation of this precursor to

generate 4#-phosphopantothenate, which is catalyzedby pantothenate kinase (PK). Then, the addition of Cysto 4#-phosphopantothenate gives rise to 4#-phospho-N-pantothenoyl-cysteine (PPC), which is catalyzedby PPC synthetase. In the next step, PPC is decarboxyl-ated to 4#-phosphopantetheine by PPC decarboxylase(PPCDC). Finally, 4#-phosphopantetheine is convertedto CoA by the sequential action of the enzymes4#-phosphopantetheine adenylyltransferase anddephospho-CoA kinase. In humans, the two latteractivities are encoded in a single bifunctional enzyme(Daugherty et al., 2002). In Escherichia coli, both theaddition of Cys to 4#-phosphopantothenate and thesubsequent decarboxylation of PPC are catalyzed bythe bifunctional enzyme Dfp (mnemonic for DNA andflavoprotein; Kupke et al., 2000; Strauss et al., 2001;Kupke, 2002).

In plants, every step of CoA biosynthesis frompantothenate is catalyzed by single monofunctionalenzymes, and the pathway has been reconstitutedin vitro by combining the recombinant enzymesPK (AtCoaA, At1g60440), PPC synthetase (AtCoaB,At1g12350), PPCDC (HAL3A, AtCoaC, and At3g18030),4#-phosphopantetheine adenylyltransferase (AtCoaD,At2g18250), and dephospho-CoA kinase (AtCoaE,At2g27490). However, many aspects of the path-way are not well understood and, to our knowledge,

1 This work was supported by the Ministerio de Educacion yCiencia (grant nos. BIO2002–03090 and BIO2005–01760, and fellow-ship to M.G.-G.), Fondo Europeo de Desarrollo Regional, andConsejo Superior de Investigaciones Cientıficas (fellowship to S.R.).

* Corresponding author; e-mail [email protected]; fax34963877859.

The author responsible for distribution of materials integral to thefindings presented in this article in accordance with the policydescribed in the Instructions for Authors (www.plantphysiol.org) is:Pedro L. Rodriguez ([email protected]).

Article, publication date, and citation information can be found atwww.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.105.072066.

830 Plant Physiology, March 2006, Vol. 140, pp. 830–843, www.plantphysiol.org � 2006 American Society of Plant Biologists

the physiological consequences for plant life of im-pairing CoA biosynthesis have not been addressed bygenetic analysis. In particular, the subcellular locationof the Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) CoA biosyn-thetic enzymes has not been studied in detail. It isknown that the last enzyme of the pantothenate bio-synthesis pathway (pantothenate synthetase) is foundin the cytosol (Ottenhof et al., 2004), whereas PKactivity appears to be predominantly localized in thechloroplast in spinach (Spinacia oleracea; Falk andGuerra, 1993), with some activity observed in cytosol.However, the five Arabidopsis members of the PKfamily (At1g60440, At4g32180, At2g17320, At2g17340,and At4g35360) as well as AtCoaC, AtCoaD, andAtCoaE do not show chloroplast-targeting sequencesaccording to prediction programs such as ChloroP orPSORT. In any case, CoA itself is found in all cellularcompartments and this multicompartmentation im-plies that there must be transporters present for shut-tling intermediates. However, to our knowledge,currently only one transport activity for import ofCoA into mitochondria has been reported in potato(Solanum tuberosum), although the corresponding genehas not been cloned (Neuburger et al., 1984).As CoA plays an essential role in metabolism, null

mutations in CoA biosynthetic genes are presumed tobe lethal, unless there is some degree of genetic re-dundancy in the organism. For instance, in both yeast(Saccharomyces cerevisiae) and fly (Drosophila mela-nogaster), each with only one PK gene, the null mutantis nonviable (Winzeler et al., 1999; Afshar et al., 2001).To identify plant mutants impaired in CoA biosynthe-sis, we took advantage of the fact that some steps ofthis pathway are catalyzed by more than one geneproduct in Arabidopsis (Kupke et al., 2003). Plant mu-tants partially impaired in CoA biosynthesis offer thepossibility to genetically test the function of CoA inplant biology. For instance, in oilseed plants the use ofstorage lipids during early seedling establishment is akey process for plant survival that is CoA dependent(Graham and Eastmond, 2002). Additionally, as CoAbiosynthesis appears to be a sensitive step in plantsunder salt stress (Espinosa-Ruiz et al., 1999; Yonamineet al., 2004), an improved knowledge of this pathwaymight help our understanding of how plants cope withabiotic stresses. Finally, as the CoA biosynthetic path-way is evolutionarily conserved, its study in plantsmight have clinical relevance, as defects in this path-way lead to a human neurodegenerative disease(Zhou et al., 2001).The plant CoA biosynthetic pathway has been re-

cently defined in plants (Kupke et al., 2003), and thebiochemistry of one of the biosynthetic enzymes,HAL3A (AtCoaC, PPCDC), has been studied in detail(Albert et al., 2000; Kupke et al., 2001; Hernandez-Acosta et al., 2002; Steinbacher et al., 2003). HAL3A is aflavoprotein that catalyzes the decarboxylation of PPCto 4#-phosphopantetheine (Kupke et al., 2001; Hernandez-Acosta et al., 2002), and overexpression of this en-zyme leads to improved plant tolerance to salt and

osmotic stress (Espinosa-Ruiz et al., 1999; Yonamineet al., 2004). Two highly homologous genes, HAL3A(At3g18030) and HAL3B (At1g48605), are present inthe Arabidopsis genome. Expression of HAL3A andHAL3B mRNAs was previously analyzed in seedsand different organs of adult plants (root, shoot, leaf,flower, and silique), as well as in 12-d-old seedlings(Espinosa-Ruiz et al., 1999). As a general result, tran-script level of HAL3B mRNA was found to be lowerthan HAL3A mRNA. Therefore, according to theirrelative transcript levels, HAL3A appears to play apredominant role over HAL3B. For instance, HAL3BmRNA was expressed to very low level in seeds,whereas strong expression was observed for HAL3AmRNA. During embryogenesis, in situ hybridizationof HAL3A mRNA revealed that the transcript wasmainly detected in the cotyledons and hypocotyl ofmature seeds, and to a lower level in the seed coatouter integument (Espinosa-Ruiz et al., 1999). Finally,according to northern-blot analysis, HAL3B mRNAwas expressed 3- to 4-fold less than HAL3A mRNA in12-d-old seedlings (Espinosa-Ruiz et al., 1999).

Even though the function of HAL3B has not beenexperimentally addressed (Leonardi et al., 2005), tak-ing into account the high sequence similarity betweenboth genes, we hypothesized that HAL3B might par-tially play a redundant role to HAL3A. Keeping inmind the crucial role of CoA biosynthesis for plant life,a certain degree of genetic redundancy would allowthe identification of viable hal3a and hal3b mutants.Thus, T-DNA-disrupted alleles of HAL3A and HAL3Bwere identified in Arabidopsis T-DNA collections, andthe corresponding homozygous mutants were isolatedand found to be viable. Indeed, the single hal3a andhal3bmutants showed similar phenotypes to wild-typeplants; however, a hal3a hal3b double mutant wasembryo lethal, proving the expected crucial role forCoA biosynthesis. Unexpectedly, a Suc-dependent seed-ling establishment phenotype was found for hal3aplants that were heterozygous for the T-DNA-disruptedhal3b allele (aaBb individuals), which were unable tosurpass the heterotrophic growth phase that occurs upongermination.

RESULTS

Isolation of T-DNA Insertional Mutations in the

Arabidopsis HAL3A and HAL3B Genes

Two T-DNA-disrupted alleles of HAL3Awere iden-tified from the T-DNA collection of the Max-PlanckInstitute (Cologne, Germany) through PCR-basedscreening of Arabidopsis plants containing randomT-DNA insertions (Rios et al., 2002; Fig. 1A). The firstallele, hal3a-1, is a T-DNA insertion in the intron of thegene, and it is localized 454 nucleotides downstreamfrom the ATG start codon (Fig. 1A). The second one,hal3a-2, is a T-DNA insertion in the first exon of thegene, and it is localized 290 nucleotides downstreamfrom the ATG start codon. No HAL3A transcript was

Coenzyme A Biosynthesis in Seedling Establishment

Plant Physiol. Vol. 140, 2006 831

detected in seedlings of either mutant (Fig. 1B). In thecase of HAL3B, no T-DNA-disrupted allele could berecovered from the Max-Planck collection. Moreover,only one T-DNA line from the currently availablecollections leads to disruption of the transcription unit(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress), corre-sponding to donor stock number SALK_045607 (Fig.1A). This hal3b allele is a T-DNA insertion in the intronof the gene, and it is localized 320 nucleotides down-stream from the ATG start codon (Fig. 1A).

Reverse transcription (RT)-PCR analysis was per-formed both for HAL3A and HAL3B mRNA expres-sion in 5-d-old seedlings from wild-type, hal3a-1, andhal3b mutants (Fig. 1C). The expression of HAL3B wasfound to be lower than HAL3A in wild type (Fig. 1C),which confirms that HAL3A is the predominant iso-form of HAL3 present during seedling establishment(Espinosa-Ruiz et al., 1999). Indeed, 5-d-old seedlingsshowed a 4-fold higher expression level for HAL3Acompared to HAL3B, as measured by RT-quantitative-PCR analyses (data not shown). Expression of HAL3Aand HAL3B was abolished in the hal3a-1 and hal3b

mutants, respectively (Fig. 1C). RT-quantitative-PCRanalyses of HAL3A in hal3b or HAL3B in hal3a-1 re-vealed a similar expression level to the one observed inwild type for each gene (data not shown).

hal3a-1 hal3b Double Mutant Is Embryo Lethal

Transgenic Arabidopsis plants (two lines) that expressanantisense full-lengthcDNAofHAL3Awere reported toshow a delayed growth rate and impaired osmotic stresstolerance compared to wild-type plants (Espinosa-Ruizet al., 1999). In contrast, the null mutant hal3a-1 failed toshow those phenotypes, as growth rate (Fig. 2A), saltsensitivity (see later Fig. 4C), and osmotic stress toler-ance (data not shown) were quite comparable to wild-type plants. Similar results to those of hal3a-1 wereobtained for the allelic hal3a-2mutant (data not shown).Whereas a decrease in HAL3A transcript amount wasmeasured in the two antisense lines constructed byEspinosa-Ruiz et al. (1999), HAL3B expression was notinvestigated.Antisense expression of full-lengthHAL3AcDNA might lead to a decreased HAL3B transcript

Figure 1. Molecular characterization ofhal3a and hal3b mutants. A, Scheme of theHAL3A and HAL3B genes and localization ofthe respective T-DNA insertions in the differ-ent alleles. The numbering begins at the ATGtranslation start codon. The T-DNA left border(LB) primers that were used to localize theT-DNA insertion are indicated. B, Northern-blot analysis of wild-type, hal3a-1, hal3a-2,and hal3bmRNAs probed with a cDNA probespecific for HAL3A transcript. C, RT-PCR anal-ysis of wild-type, hal3a-1, and hal3b mRNAsprepared from 5-d-old seedlings. Primers spe-cific for HAL3A, HAL3B, and TUB transcriptswere used.

Rubio et al.

832 Plant Physiol. Vol. 140, 2006

amount because of the high sequence identity betweenboth genes at the nucleotide level. This explanationmight reconcile the discrepancy between our results forhal3a-1 and hal3a-2 mutants, and the antisense ap-proach of Espinosa-Ruiz et al. (1999).

No visible phenotype for the single hal3a or hal3bmutant was observed under our experimental condi-tions (Figs. 2, 3, and 4). As the predicted HAL3A andHAL3B gene products show 90% amino acid similarity,we reasoned that some functional redundancy might

Figure 2. A, Growth rate of wild-type, hal3a-1, hal3b, Aabb, and aaBb plants. Values are averages6 SD (n5 20). B, The hal3a-1hal3b double mutant is embryo lethal. Nomarski image of chemically cleared seed progeny from aaBb plants showing a viableembryo at the torpedo stage and an aborted embryo arrested at the early/midglobular stage. C, Percentage of aborted embryosper silique. Siliques of wild-type, hal3a-1, hal3b, Aabb, and aaBb plants were examined under a Nikon SMZ800 binocular glass.A representative silique from aaBb individuals is shown. Values are averages 6 SD (n 5 20). Double asterisks (**) indicate P ,

0.03 (Student’s t test) with respect to wild type (wt).



exist between both genes. To establish whetherHAL3Afunction is partially redundant with HAL3B, we triedto generate a double mutant by crossing hal3a-1 andhal3b homozygous mutants in both directions. Wecould not recover double-homozygous mutants inspite of genotyping more than 200 plants of the F2progeny. However, it was possible to identify hal3a-1plants that were heterozygous for the T-DNA-disruptedhal3b allele (aaBb genotype). Chemically cleared prepa-rations from young fruits of aaBb plants showed thatembryogenesis was arrested in approximately one quar-ter of the seeds, which degenerated into brown abortedseeds during maturation (Fig. 2, B and C). Indeed, noaabb double mutant was obtained in the progeny of self-fertilized aaBb plants, and the ratio of heterozygousHAL3B/hal3b to homozygousHAL3B/HAL3B plants wasclose to 2:1 (188:95, x2 5 0.012, P . 0.9). This finding

suggests that viable embryos of the aaBb seed progenymust represent either the aaBB or aaBb genotype, where-as the aborted embryo must correspond to a putativeaabb double mutant (Fig. 2B). The aabb embryo was ar-rested at the early/midglobular stage (Fig. 2B), and thenumber of aborted embryos per silique was in agree-ment with the expected lethality of the aabb genotype(Fig. 2C). These results indicate that homozygous hal3bembryos are not viable in the hal3a-1 background. Ad-ditionally, the fact that one or two wild-type copies ofHAL3B (in a hal3a-1 background) support the growth ofviable embryos reflects a partial functional redundancybetween HAL3A and HAL3B genes.

During the analysis of the F2 progeny describedabove, we also identified hal3b plants that were heter-ozygous for the T-DNA-disrupted hal3a-1 allele (Aabbgenotype). Siliques of these plants also revealed

Figure 3. Suc-dependent phenotype of aaBbseedlings. Genetic and chemical complementa-tion. A, Seedling establishment of the seed prog-eny from wild-type, hal3a-1, hal3b, Aabb, andaaBb plants in medium supplemented with 1%Suc (1Suc), lacking Suc (2Suc), lacking Suc andsupplemented with 50 mg/mL of pantethine(2Suc 1 pantethine), pantothenate (2Suc 1

pantothenate), or b-Ala (2Suc 1 b-Ala). Valuesare averages 6 SD for three independent experi-ments (200 seeds each). Triple asterisks (***)indicate P , 0.01 (Student’s t test) with respectto aaBb 1 Suc. B, Segregating phenotype of theseed progeny from aaBb plants in medium lack-ing Suc. Representative aaBB and aaBb seedlingswere removed from the medium at 7 d aftersowing and they were photographed under aNikon SMZ800 binocular glass. Bar 5 2 mm. C,Root growth at 7 d after sowing from wild-type,hal3a-1, hal3b, Aabb, and aaBb individuals inmedium lacking Suc (gray bars) or lacking Suc butsupplemented with 50 mg/mL of pantethine(black bars), pantothenate (cross-hatched bar),or b-Ala (stippled bar). Root growth in mediumwith 1% Suc was not statistically different for theseedlings. Values are averages 6 SD for twoindependent experiments (40 seedlings each).Triple asterisks (***) indicate P , 0.01 (Student’st test) with respect to aaBb in medium lackingSuc. Representative aaBb seedlings were re-moved from medium lacking Suc (2Suc) orlacking Suc but supplemented with 50 mg/mLpantethine (2Suc1 Pant) and rearranged on agarplates (right). Photograph was taken at 5 d aftersowing. Bar 5 2 mm. wt, Wild type.

Rubio et al.


approximately one quarter of aborted embryos (Fig.2C), likewise indicating that hal3a-1 embryos are notviable in the hal3b homozygous background. Growthrate of Aabb plants was quite similar to wild type,whereas aaBb plants showed a slight delay with re-spect to wild type (Fig. 2A).

aaBb Plants Require Exogenous Suc forSeedling Establishment

According to the main reserve compound, Arabi-dopsis qualifies as an oilseed plant, and mutantsseverely impaired in the ability to catabolize storagelipid require an exogenous supply of Suc for seedlingestablishment (Hayashi et al., 1998, 2002; Germainet al., 2001; Zolman et al., 2001; Footitt et al., 2002;Fulda et al., 2004). We reasoned that mutants impaired

in CoA biosynthesis might have compromised fattyacid b-oxidation, leading to a requirement for Sucsupplementation in the heterotrophic growth phase ofthe plant. Therefore, we analyzed seedling establish-ment of the different mutant backgrounds describedabove on media supplemented with or lacking exog-enous Suc (Fig. 3A). Wild-type seeds germinated andgrew normally, regardless of the presence or absenceof Suc in the growth medium. Similar behavior wasobserved for seeds of hal3a-1 and hal3b single mutants(Fig. 3A). In contrast, seedling establishment of theprogeny of aaBb plants was notably impaired in theabsence of Suc (Fig. 3A), whereas germination was notseverely compromised under the conditions used.

Figure 3B shows that approximately two thirds ofthe progeny were represented by stunted individualswith a very short root, whereas one third of the

Figure 4. Reduced seed production and enhancedsalt sensitivity of aaBb plants. A, Seed production ofwild type, hal3a-1, hal3b, Aabb, and aaBb plants.Values are averages 6 SD (n 5 20). Triple asterisks(***) indicate P , 0.01 (Student’s t test) with respectto wild type. B, Salt hypersensitivity of aaBb seed-lings. Seedlings grown in medium containing 1%Suc were transferred to medium supplemented with125 mM NaCl and lacking (2Suc) or containing 1%Suc (1Suc). The photograph was taken after 7 d inmedium containing NaCl. C, Percentage of seedlingsshowing bleaching when transferred to mediumsupplemented with 125 mM NaCl and lacking Suc.Values are averages 6 SD for three independentexperiments (40 seedlings each). Triple asterisks(***) indicate P , 0.01 (Student’s t test) with respectto wild type (wt).



seedlings were similar to wild-type plants (188:95, x250.012, P . 0.9). Stunted individuals became senescentafter 2 weeks in the absence of Suc, but they could berescued to normal growth by transfer to a mediumsupplemented with Suc. Genotyping of these individ-uals revealed they had an aaBb genotype, whereas thoseseedlings that did not require Suc for postgerminativegrowth had an aaBB genotype. Thus, a single copy ofthe HAL3B gene (in a hal3a-1 background) was not ableto support postgerminative growth in medium lackingSuc. These results also show genetic complementationof the Suc-dependent phenotype of aaBb seedlings byan additional copy of the HAL3B gene (right section ofFig. 3B, compare aaBb and aaBB siblings).

In contrast to the phenotype reported above for aaBb,the progeny of Aabb plants did not show a segregatingphenotype in medium lacking Suc (Fig. 3A). Genotyp-ing of this progeny revealed no double hal3a-1 hal3bmutant but hal3b individuals that had either one or twowild-type copies of the HAL3A gene. This result indi-cates that a single copy of HAL3A, in a hal3b back-ground, is enough to support postgerminative growthin medium lacking Suc. Thus, whereas aaBb seedlingswere Suc dependent, this was not the case for Aabbgenotype. This observation can be explained by the factthat HAL3A expression in seedlings is higher thanHAL3B (Espinosa-Ruiz et al. 1999; Fig. 1C). Addition-ally, this finding confirms that HAL3A function is par-ticularly crucial for seedling establishment.

The Suc-Dependent Phenotype of aaBb Seedlings Is

Complemented by Pantethine

HAL3A catalyzes the decarboxylation of 4#-phos-phopantothenoyl-cysteine to 4#-phosphopantetheine,and therefore, this step of the CoA biosynthetic path-way must be severely impaired in aaBb individuals.The 4#-phosphopantetheine compound is not com-mercially available and additionally, phosphorylatedprecursors of CoA or CoA itself are not able to effi-ciently cross the plasma membrane (Shibata et al.,1983). However, we could obtain pantethine, which isthe dimer resulting from the oxidation of the thiolgroup of pantetheine and subsequent formation of adisulfide bond. Thus, we were interested in examiningwhether supplementation of the media with pante-thine might complement the Suc-dependent seedlingestablishment phenotype of the aaBb mutant. Figure3A shows that seedling establishment in mediumlacking Suc was recovered in aaBb upon pantethinesupplementation, which was also reflected by mea-surements of root growth (Fig. 3C). In contrast, sup-plementation of the medium with other CoA precursorssuch as pantothenate or b-Ala, which are upstream ofHAL3A function, was not able to complement the Suc-dependent phenotype of aaBb seedlings (Fig. 3, A andC). Pantethine complementation of the Suc-dependentphenotype indicates that impaired CoA biosynthesis isresponsible for the observed phenotype in the aaBbmutant.

Seed Production and Salt Tolerance Are Severely

Impaired in aaBb Plants

During photoautotrophic growth both Aabb and aaBbplants did not show obvious vegetative phenotypes,suggesting that a single gene copy of either HAL3A orHAL3B provides enough CoA for this growth phase.However, reproductive growth was particularly im-paired in aaBb plants, where less inflorescence stemswere present, although inflorescence and floral devel-opment were comparable to those of wild-type plants(data not shown). As a result, seed production wasseverely impaired in aaBb plants and to a lesser extent inAabb plants, resulting in a reduction of approximately70% compared to wild type (Fig. 4A).

Finally, as overexpression of HAL3A improves planttolerance to salt stress (Espinosa-Ruiz et al., 1999;Yonamine et al., 2004), we decided to test salt sensi-tivity of the different mutant backgrounds. To this end,7-d-old seedlings grown in a medium containing 1%Sucwere transferred to amedium lacking Suc and sup-plemented with 125 mM NaCl. Compared to wild-typeplants, aaBb individuals were hypersensitive to saltstress, as they bleached after 7 d in medium supple-mented with NaCl (Fig. 4B). However, a similar saltsensitivity as that in wild-type plants was observedafter transfer to medium supplemented with 125 mM

NaCl and 1% Suc (Fig. 4B). Salt sensitivity of hal3a-1,hal3b, and Aabbmutants was quite similar to wild typeboth in the presence (data not shown) or absence ofexogenous Suc (Fig. 4C).

Fatty Acid and Acyl-CoA Profiling

Dry seed from wild-type, aaBB, Aabb, and aaBbplants all had total fatty acid yields between 20 to 23nmol seed21 (30% w/w), as determined by gas chro-matography-flame ionization detector analysis (Fig.5A), with a similar molar percent distribution for indi-vidual fatty acids (Fig. 5B). Therefore, although seedyield per plant was lower for aaBb plants, normal oildeposition within individual seeds occurred duringseed development. Dry seed of an aaBb plant contains,respectively, two thirds and one third of aaBb and aaBBseeds, therefore only a relative comparison with dataobtained for aaBb seedlings can be made (see below).

In addition, total content of fatty acids was mea-sured for wild type, hal3a-1, and hal3b in 5 d afterimbibition (DAI) seedlings that were grown in me-dium either supplemented with or lacking Suc. Totalcontent of fatty acids for aaBb and Aabb genotypes inmedium supplemented with Suc could not be deter-mined because their seed progeny consists of a segre-gating population. However, we could select (andmeasure total fatty acid content in) aaBb seedlings inmedium lacking Suc by the stunted phenotype de-scribed above. In germinated seedlings of this line,some lipid catabolism took place. However, althoughtotal lipid levels decreased in 5-DAI aaBb seedlingsgerminated in the absence of Suc relative to dry seeds

Rubio et al.


(Fig. 5A), the fatty acid profile of these seedlings in-dicated incomplete storage lipid catabolism (Fig. 5B).Notably, the level of the storage triacylglycerol-specificfatty acid, eicosenoic acid (20:1n9), decreased only ap-proximately 50% in aaBb seedlings, whereas a 95%reduction was observed in the other lines (Fig. 5B). The

accumulation of 20:1n9 in aaBb suggests that storagetriacylglycerol-derived fatty acid catabolismwas stalled,in contrast to the sharp decay observed in wild typeand the other genetic backgrounds (Fig. 5B, mol per-centage). Additionally, the photosynthetic membrane-specific hexadecatrienoic acid (16:3n3) did not increase,

Figure 5. Altered fatty acid profile in aaBb seedlings. Dry seeds or seedlings grown on medium in the presence or absence of 1%Suc were extracted at 5 DAI for fatty acid profiling. Total fatty acids (A) and profile data (B) are shown. Data in B are expressedboth as nmol/seedling as well as mol percentage (nmol fatty acid/total nmol fatty acids). Data in B refer to seedlings that wereobtained in the absence of Suc (2Suc). Total fatty acid content of aaBb and Aabb genotypes in medium supplemented with Succould not be determined because their seed progeny consists of a segregating population. Dry seeds of an aaBb plant containapproximately two thirds and one third of aaBb and aaBB seeds, respectively. For profile data, an average value for dry seeds fromall lines is shown as these were very similar. Values are averages 6 SD for five separate determinations, expressed on a perseed(ling) basis. Triple asterisks (***) indicate P , 0.01 (Student’s t test) when compared to data from aaBb and wild type (wt).



as would be expected in established seedlings (Fig.5B). Therefore, this result reflects that fatty acids arenot properly mobilized from the lipid body to reachthe chloroplast in aaBb mutant. In contrast, the otherlines all had fatty acid profiles that indicated theirstorage lipids were almost completely catabolized by 5DAI, with the balance of lipids made up of membrane-specific fatty acids expected in actively growing tissue.

Measurement of the total acyl-CoA pool was ob-tained as described by Larson and Graham (2001).Total acyl-CoA content was quite similar in wild type,hal3a-1, and hal3b seedlings grown in medium supple-mented with Suc (Fig. 6A). In medium lacking Suc,total acyl-CoA content was reduced in hal3a-1, hal3b,and aaBb seedlings to 65%, 79%, and 44% of wild-typelevels (540, 657, 364, and 828 fmol/seedling, respec-tively). The reduction in total acyl-CoA content re-ported for hal3a-1 and hal3b did not lead to a visiblephenotype, whereas the more than 50% reductionmeasured in aaBb led to a severe phenotype for seed-ling establishment (see Fig. 3, A and B). Particularlynoticeable in this line was the low level of acetyl-CoA(2:0), approximately 20% of wild type (Fig. 6B, fmol/seedling), and the accumulation of 4:0, 6:0, and 20:1CoA with respect to wild type (Fig. 6B, mol percent-age). A low CoA supply in aaBb appears to limitb-oxidation and hence acetyl-CoA production as, forinstance, the thiolysis step requires the input of a newCoA molecule for every 2-carbon cleavage.

DISCUSSION

Comparative genomics in both prokaryotic and eu-karyotic organisms has been fruitful in the discoveryof genes of universal metabolic pathways. In particu-lar, elucidation of the human and plant genes involvedin the CoA biosynthetic pathway has greatly benefitedfrom this approach (Daugherty et al., 2002; Kupkeet al., 2003). A step forward in plant physiology shouldbe the analysis of reduction-of-function mutants im-paired in CoA biosynthesis. In this work we providean initial effort in that direction, by reporting the iden-tification and characterization of plant knockout mu-tants impaired in CoA biosynthesis.

Two allelic Arabidopsis mutants with a lesion in theHAL3A (AtCoaC1, PPCDC) gene, hal3a-1 and hal3a-2,did not reveal major phenotypical differences com-pared to wild-type plants. The Arabidopsis genomeencodes a second gene,HAL3B (AtCoaC2), whose geneproduct shows 86% amino acid sequence identity tothat of HAL3A. Therefore, we suspected the corre-sponding gene products might be able to complementeach other. A reverse genetics approach was used toisolate a knockout mutant for HAL3B. As it happenedwith hal3a-1, the hal3b mutant behaved quite similarlyto wild-type plants. Analysis of the progeny of hal3a-1/1hal3b/1 plants failed to identify a hal3a-1 hal3b doublemutant, however we could identify aaBb and Aabbindividuals. The percentage of aborted embryos in

siliques of these plants was in agreement with theexpected nonviability of hal3a-1 hal3b double mutants.Moreover, the results of the x2 test in the progeny of aaBbplants was in agreement with the 2:1 ratio (HAL3Bheterozygous to homozygous) expected if aabb em-bryos were lethal. The aabb embryos were arrested tothe early/midglobular stage (Fig. 2B), which repre-sents an early step of embryogenesis (36–48 h afterflowering). It can be speculated that once the residualCoA present in the aabb zygote is titrated below acertain threshold by early cell divisions, further de-velopment is arrested. Additionally, this result showsthat embryogenesis arrest in aabb occurs before thesynthesis of fatty acids and lipid deposition take place(Baud et al., 2002), revealing a crucial role for CoA atearly stages of embryo development. Moreover, denovo CoA biosynthesis by the embryo is required forembryogenesis, as either aaBb or Aabb mother plantsdo not support growth of aabb embryos. A maternaleffect on the seed by CoA supply is unlikely, as thiscompound as well as CoA precursors are phosphory-lated and therefore do not efficiently cross plasmamembrane. Pantothenate is the most advanced CoAprecursor taken up by cells (Begley et al., 2001). Indeed,whereas exogenous pantothenate complements mu-tants lacking de novo pantothenate biosynthesis, ex-ogenous CoA does not complement mutants impairedin CoA biosynthesis (Begley et al., 2001; Leonardi et al.,2005).

The progeny of aaBb mother plants showed a seg-regating phenotype with respect to seedling establish-ment in medium lacking Suc, which was not presentin the progeny of Aabb plants. Thus, root elongation,expansion, and greening of the cotyledons, as well asproduction of true leaves from the apical meristem,were severely impaired in hal3a-1 individuals thatwere heterozygous for HAL3B (Fig. 3B). An additionalwild-type copy of HAL3B in aaBB siblings of the prog-eny restored normal growth (Fig. 3B), which providesgenetic complementation of the phenotype and provesthat the phenotype is due to impaired HAL3 function.Additionally, chemical complementation of the phe-notype was obtained by supplementation of the mediawith pantethine (Fig. 3C), which is a direct precursorof the CoA metabolite synthesized by HAL3A. Takentogether, these results indicate that impaired HAL3function is responsible for the Suc-dependent seedlingestablishment phenotype and that adequate CoA bio-synthesis is required for seedling establishment. Ad-ditionally, these results provide in vivo evidence onHAL3B function, and they confirm that HAL3A ispredominant over HAL3B at this stage.

The Suc-dependent phenotype during postgermi-native growth of aaBb is similar to that of variousmutants affected in fatty acid breakdown and subse-quent utilization of the resulting acetyl-CoA units.These include the pxa1/ped3/ctsmutant, which shows alesion in a peroxisomal ATP-binding cassette trans-porter involved in uptake of fatty acids into the perox-isome (Zolman et al., 2001; Footitt et al., 2002; Hayashi

Rubio et al.


et al., 2002) and a long-chain acyl-CoA synthetase(LACS) lacs6-1 lacs7-1 double mutant affected in per-oxisomal LACS responsible for activation of fatty acidsto fatty acyl-CoAs, i.e. the substrates for b-oxidation(Fulda et al., 2004). Disruption of b-oxidation itself also

results in a Suc-dependent seedling establishmentphenotype as demonstrated by the acx1 acx2 doublemutant disrupted in the first step of the pathway(Adham et al., 2005; Pinfield-Wells et al., 2005) and theped1/kat2mutant, which is deficient in the last thiolytic

Figure 6. Altered acyl-CoA profile in aaBb seedlings. Seedlings grown on medium in the presence or absence of 1% Suc wereextracted at 5 DAI for acyl-CoA profiling. Total fatty acids (A) and profile data (B) are shown. Data in B are expressed both as fmol/seedling as well as mol percentage (fmol acyl-CoA/total fmol acyl-CoAs). Data in B are from seedlings grown in the absence ofSuc (2Suc). Values are averages 6 SD for five separate determinations, expressed on a per seedling basis. Double (**) and triple(***) asterisks indicate P , 0.03 or P , 0.01 (Student’s t test), respectively, when compared data from aaBb and wild type (wt).



cleavage step (Hayashi et al., 1998; Germain et al.,2001). Finally, mutations in different enzymatic stepsof the peroxisomal glyoxylate cycle, which plays a cen-tral role in the conversion of acetyl units derived fromb-oxidation to sugars, also gives rise to sugar-dependentseedling establishment phenotypes of varying degreesof severity (Eastmond et al., 2000; Eastmond andGraham, 2001; Cornah et al., 2004). The icl and mlsmutants are devoid of the corresponding isocitratelyase and malate synthase glyoxylate cycle enzymes,but despite this, they exhibit a relatively weak sugar-dependent seedling establishment phenotype bestcharacterized by impaired hypocotyl elongation indark-grown seedlings (Eastmond et al., 2000; Cornahet al., 2004). These weak phenotypes are put down dueto the fact that in the absence of isocitrate lyase activity,acetyl units from b-oxidation can still be respired(Eastmond et al., 2000), and in the absence of malatesynthase, acetyl-CoA can still be used by the seedlingfor gluconeogenesis, because the glyoxylate from iso-citrate lyase can be metabolized by an alternative path-way (Cornah et al., 2004). In contrast to icl and mlsmutant seedlings, the csy2 csy3 double mutant, whichlacks the major peroxisomal citrate synthase isoformsinvolved in storage reserve mobilization, remains dor-mant until the seed coat is removed and is then de-pendent on exogenous sugar for seedling establishment(Pracharoenwattana et al., 2005). This increased dor-mancy phenotype is also exhibited by the cts, kat2,and acx1 acx2 mutants (Pinfield-Wells et al., 2005;Pracharoenwattana et al., 2005). The severity of thecsy2 csy3 double-mutant phenotype is thought to be dueto the fact that export of acetyl units from the peroxi-some in Arabidopsis is absolutely dependent on theirconversion to citrate.

The severity of the hal3 aaBb sugar-dependent seed-ling establishment phenotype (Fig. 3) is much closer tothose mutants that are completely blocked in fatty acidbreakdown (due either to disruption of a componentof the pathway or export of product from the perox-isome) than to the mls and icl mutants, which are stillable to utilize acetyl-CoA derived from fatty acid break-down. Malate synthase and citrate synthase both useacetyl-CoA derived from the last step of b-oxidationand recycle CoA, thus maintaining the peroxisomalpool. This pool of CoAwill almost certainly need to in-crease to meet demand with the onset of storage lipidmobilization during postgerminative seedling growth.The hal3 aaBbmutant appears to be unable to respond tothis increased demand resulting in an inability to breakdown and utilize storage lipid derived fatty acids,which leads to a sugar-dependent seedling establish-ment phenotype.

The Suc rescue of seedling establishment in the hal3aaBbmutant demonstrates that these seedlings are ableto utilize sugars as a respiratory carbon source. In thepresence of Suc the mitochondrial CoA pool musttherefore be adequate to support the production ofacetyl-CoA required for the TCA cycle. It is possiblethat exogenous sugar feeding, as well as providing a

utilizable carbon source, could also alleviate the lim-itation in peroxisomal CoA brought about throughincreased demand, since sugars are known to delayand in some cases inhibit breakdown of storage lipidderived fatty acids (Eastmond et al., 2000; Martin et al.,2002). Furthermore, sugars such as Suc and Glc canalso have regulatory roles, acting in many cases toeither increase or decrease the activity of various met-abolic pathways at the transcriptional and posttrans-criptional level (Smeekens, 2000). It is possible that Succould lead to a sufficient up-regulation of the CoAbiosynthetic pathway to alleviate the seedling estab-lishment phenotype of the hal3 aaBbmutant. In fact Sucfeeding actually increases the total acyl-CoA pool inboth wild type and the hal3a-1 and hal3b mutants,which suggests that increased levels of CoA are avail-able in the presence of Suc (Fig. 6).

Increases in the total acyl-CoA pool are also seen inthe various mutants disrupted in fatty acid breakdown(Germain et al., 2001; Footitt et al., 2002; Rylott et al.,2003; Fulda et al., 2004; Pinfield-Wells et al., 2005). Incontrast, the aaBb seedling total acyl-CoA pool mea-sured in this study was lower than that measured forthe wild type on a per seedling basis. This suggeststhat the observed retention of storage lipid specificfatty acids in this line could at least partly be due to adecreased CoA supply to cytosolic and peroxisomalacyl-CoA synthetases, which are required to activatefatty acids to acyl-CoA esters for subsequent b-oxida-tion. Alternately, a bottleneck in peroxisomal b-oxida-tion arising as a consequence of a limiting supply ofCoA provision for the last thiolytic step in the pathwaycould result in feedback inhibition of storage lipidbreakdown as previously proposed (Graham et al.,2002). Indeed, the accumulation of C4, C6, and C20:xacyl-CoAs (on a mole percentage) in the aaBb linesuggests a bottleneck operated over the entire range ofacyl-CoA chain lengths that are generated during thecyclic 2C cleavage of long-chain fatty acids. That C16:0and C18:x CoAs do not accumulate despite the factthat these are the predominant fatty acids in storagelipids most likely reflects an impairment in the acyl-ation of fatty acids (because of a reduced supply ofCoA) together with compromised de novo fatty acidsynthesis.

In conclusion, the data presented in this work pro-vide strong evidence that HAL3B plays the samecatalytic role as HAL3A in CoA biosynthesis. Despitethe fact that HAL3B is expressed at significantly lowerlevels thanHAL3A (Espinosa-Ruiz et al., 1999; Fig. 1C),it can compensate for the lack ofHAL3A during embryodevelopment and the vegetative growth of the plant.HAL3B mRNA is detected (at lower level than HAL3AmRNA) in root, flower, and silique, whereas it is hardlydetectable in shoot, leaf, and seed (Espinosa-Ruiz et al.,1999). Therefore, at specific stages (reproductive growth,salt stress, and seedling establishment), presumably dueto increased demand for CoA, two rather than one copyof the HAL3B gene are required to compensate for thelack of HAL3A. Thus, aaBB seedlings, still containing

Rubio et al.


65% of wild-type levels of total acyl-CoAs, did not showa Suc-dependent phenotype for seedling establishment.Instead, further reduction (up to 44%) in aaBb seedlingscorrelated with a dependence on exogenous Suc forseedling establishment. As free CoA is only 10% to 15%of total CoAs in tissueswith active fatty acidmetabolism(Jackowski and Rock, 1986; Tahiliani and Beinlich, 1991),the reduced content of total acyl-CoAs likely reflectsimpaired CoA synthesis in the aaBbmutant. In addition,we clearly show that acetyl-CoA levels are compro-mised in the aaBb line with respect to hal3a-1, hal3b, orwild-type plants (approximately 80% reduction withrespect to wild type), and that this correlates with com-promised fatty acid breakdown. The fact that Suc rescuesseedling establishment in the aaBb line demonstrates thatthe main cause of this phenotype is a compromisedreserve mobilization, rather than other pleiotrophic ef-fects of CoA deficiency. It will be interesting to establishwhether the salt hypersensitivity observed in aaBb seed-lings (Fig. 4C) correlates with similar metabolic defectsor whether it is due to other roles of CoA. However, thelow fresh weight of these seedlings and their growtharrest in the absence of Suc also suggest that the retentionof storage lipid may have been a consequence of detri-mental pleiotrophic effects of CoA deficiency (i.e. im-paired amino acid biosynthesis) on cell developmentand expansion.Finally, the Suc-dependent phenotype of aaBb seed-

lings was complemented upon media supplementa-tion with pantethine. Reduction and phosphorylationof this compound by the cell metabolism must haveoccurred to generate 4#-phosphopantetheine, which isthe CoA precursor generated by HAL3A enzyme. Thisresult suggests that it might be possible to therapeu-tically deliver pantethine or an alternative intermedi-ary compound to bypass certain enzymatic defects inCoA biosynthesis. In the case of PK-associated neuro-degeneration, the only human illness currently asso-ciated to a defect in CoA biosynthesis (Zhou et al.,2001), pantethine supplementation might not be effec-tive, as presumably PK activity is required to generate4#-phosphopantetheine from pantethine. However, fora different illness associated to a defect in other stepsof the CoA pathway (CoaB or CoaC), treatment withpantethine might prove to be useful. In general, thisresult serves to illustrate that a defect in the CoA bio-synthesis pathway might be complemented by non-phosphorylated downstream intermediates, provideda functional PK is present.

MATERIALS AND METHODS

Plant Material and Growth Conditions

Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) plants were routinely grown under

greenhouse conditions in pots containing a 1:3 vermiculite-soil mixture. For

in vitro culture, seeds were surface sterilized by treatment with 70% ethanol

for 20 min, followed by commercial bleach (2.5% sodium hypochlorite)

containing 0.05% Triton X-100 for 10 min, and, finally, four washes with

sterile distilled water. Stratification of the seeds was conducted in the dark at

4�C for 4 d. Then (0 DAI), seeds were sowed on Murashige and Skoog plates

(Murashige and Skoog, 1962) composed of Murashige and Skoog basal salts,

0.1% 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid, 1% agar, and pH adjusted to 5.7

with potassium hydroxide before autoclaving. When stated, 1% Suc was in-

cluded in the media. Plates were sealed and incubated in a controlled environ-

ment growth chamber at 22�C under a 16-h light, 8-h dark photoperiod at 80 to

100 mE m22 s21.

Mutant Isolation by PCR Screening

An Arabidopsis insertion mutant collection of 90,000 lines (Columbia

background) that carry the T-DNA of vector pPCV6NFHyg was screened as

described by Rios et al. (2002). The PCR screen was performed with the

T-DNA left border primers HOOK1 and FISH1 (Rios et al., 2002) and the

following HAL3A primers: 5#-CCAACGGTTTTAGCAGGTCGACTCTTAC

and 5#-CAGAGTGGAGCTAGTAGTGCAAATGGTC. Finally, two plants cor-

responding to donor stock numbers 13332 and 32247 were found to contain

independent single T-DNA insertions in the HAL3A gene, and they were,

respectively, named hal3a-1 and hal3a-2. To identify individuals homozygous

for the T-DNA insertion, genomic DNA was obtained from hygromicin-

resistant seedlings and submitted to PCR genotyping using the above-

described primers.

A line (Columbia background) containing a single T-DNA insertion in

HAL3B was identified from the SALK T-DNA collection (http://signal.salk.

edu/cgi-bin/tdnaexpress), corresponding to donor stock number SALK_045607.

To identify individuals homozygous for the T-DNA insertion, genomic DNAwas

obtained from kanamycin-resistant (25 mg/mL) seedlings and submitted to PCR

genotyping using the following HAL3B primers: 5#-TGTGACTGGGTCA-

TAGTCTTACTGAACAC and 5#-TACTCGAGTCGTTGTGCCACATAAAACC.

As T-DNA left border primer of the pROK2 vector, we used the following one:

5#-GCCGATTTCGGAACCACCATC.

The T-DNA taggedmutant lines were backcrossed once with the wild type,

verified by DNA gel-blot hybridization and also by segregation analysis of the

encoded antibiotic resistance gene (for the SALK line, the partially silenced

selectable marker was scored under a 25 mg/mL kanamycin concentration).

Cytological Techniques

Green and mature siliques were fixed in an ethanol/acetic acid mixture

and then cleared using the following solution: chloral hydrate/glycerol/water

8:1:2 (w/v/v) according to the protocol of Weigel and Glazebrook (2002).

Seeds, usually cleared for 12 to 16 h, were examined with an Eclipse E600

microscope (Nikon) equipped with Nomarski optics.

Seedling Establishment, Complementation, and Salt

Tolerance Assays

Seedling establishment of the different genetic backgrounds was scored as

the percentage of seeds that developed green expanded cotyledons and the

first pair of true leaves. Complementation of the Suc-dependent phenotype of

aaBb individuals was assayed supplementing the medium with 50 mg/mL of

bis[N-pantothenylamidoethyl] disulfide (pantethine, Sigma P2125). Salt tol-

erance assays were performed by transferring 7-d-old seedlings grown in

medium containing Suc to a medium supplemented with 125 mM NaCl and

lacking or containing 1% Suc. Previous assays for testing salt resistance of

35S:AtHAL3A transgenic lines were done by testing plant growth in Murashige

and Skoog medium supplemented with 3% Suc and 100 mM NaCl (Espinosa-

Ruiz et al., 1999). In tobacco (Nicotiana tabacum), salt resistance assays were

performed in calli derived of Bright Yellow 2 cells that were transformedwith a

35S:NtHAL3A construct (Yonamine et al., 2004).

RNA Analyses

Seedlings were collected and frozen in liquid nitrogen. Total RNA was

extracted using a Qiagen RNeasy plant mini kit, separated on formaldehyde-

agarose gels, and blotted to a nylon membrane. Blots were hybridized with

random-priming 32P-labeled probes. A specific cDNA probe for HAL3A was

prepared as described previously (Espinosa-Ruiz et al., 1999). RNA samples

for RT-PCR analysis were treated with DNase (RNase free) and, after precip-

itation in ethanol, they were dissolved to a final concentration of 1 mg/mL. One

microgram of the RNA solution obtained was reverse transcribed using 0.1 mg

oligo(dT)15 primer andMoloney meurine leukemia virus reverse transcriptase



(Roche), to finally obtain a 20-mL cDNA solution. PCR reactions were

performed on 1-mL cDNA template using the following primers: primers

HAL3A, 5#-ATG GAG AAT GGG AAAAGAGAC and 5#-AAGATTATCACA

AAGCCCACC; primersHAL3B, 5#-GATTCAGATAGAGAAGAAGATGA and

5#-CATGCTCTTACTATACATGTC; primers TUB, 5#-CCTGATAACTTCGTCT-

TTGG and 5#-GTGAACTCCATCTCGTCCAT.

Fatty Acid and Acyl-CoA Profiling

Lipids from 50 dry seeds were extracted and transmethylated to their fatty

acid methyl esters (FAMEs) together with tripentadecanoin as an internal

standard using a one-step procedure (Browse et al., 1986). FAMEs were

dissolved in hexane, and 2-mL aliquots injected for gas chromatography-flame

ionization detector analysis using aBPX70 60m 3 0.25mm i.d. 3 0.25mmfilm

thickness capillary column (SGE) and a CE instruments GC8000 Top GC

(Thermoquest). Injectionwasmade into ahydrogen carrier gas streamat 1.3mL

min21 (average linear velocity 35 cm s21) at a 30:1 split ratio. Temperature was

ramped as follows: 110�C isothermal 1 min; 7.5�C min21 to 260�C; cool down

70�C min21 to 110�C; total analysis time 23 min. FAMEs were identified by

comparison to a 37 FAMEmix (Supelco). Ten seedlings (approximately 10 mg)

were extracted for quantitative acyl-CoA analysis by HPLC with fluorescence

detection of acyl etheno CoA derivatives (Larson and Graham, 2001). The lipid

portion of the acyl-CoA extracts were used for fatty acid determinations as

described above.

Sequence data from this article can be found in the GenBank/EMBL data

libraries under accession numbers AF166262 and U80192.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank the Max-Planck Institute (Cologne, Germany) for providing

access to its Arabidopsis T-DNA collection, Joseph Ecker and the Salk

Institute Genomic Analysis Laboratory for providing the sequence-indexed

Arabidopsis T-DNA insertion mutants, and Arabidopsis Biological Resource

Center (Ohio State University, Columbus)/Nottingham Arabidopsis Stock

Centre for distributing these seeds. We thank Stuart Graham (University of

York, UK) for extensive technical assistance in the acyl-CoA analyses.

Received September 27, 2005; revised December 19, 2005; accepted December

20, 2005; published January 13, 2006.

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“The coenzyme A biosynthetic enzyme phosphopantetheine adenylyltransferase plays a crucial role in plant growth, salt/osmotic stress resistance, and seed lipid storage”

Rubio S, Whitehead L, Larson TR, Graham IA, Rodriguez PL.

Plant Physiol., 2008 Sep

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The Coenzyme A Biosynthetic EnzymePhosphopantetheine Adenylyltransferase Plays a CrucialRole in Plant Growth, Salt/Osmotic Stress Resistance, andSeed Lipid Storage1[W]

Silvia Rubio, Lynne Whitehead, Tony R. Larson, Ian A. Graham, and Pedro L. Rodriguez*

Instituto de Biologıa Molecular y Celular de Plantas, Universidad Politecnica de Valencia/Consejo Superior deInvestigaciones Cientıficas, ES–46022 Valencia, Spain (S.R., P.L.R.); and Centre for Novel Agricultural Products,Department of Biology, University of York, York YO10 5YW, United Kingdom (L.W., T.R.L., I.A.G.)

Coenzyme A (CoA) is an essential cofactor in the metabolism of both prokaryotic and eukaryotic organisms and a universal five-step pathway is utilized to synthesize CoA from pantothenate. Null mutations in two of the five steps of this pathway led toembryo lethality and therefore viable reduction-of-function mutations are required to further study its role in plant biology. Inthis article, we have characterized a viable Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) T-DNA mutant affected in the penultimate step ofthe CoA biosynthesis pathway, which is catalyzed by the enzyme phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT). This ppat-1knockdown mutation showed an approximately 90% reduction in PPAT transcript levels and was severely impaired in plantgrowth and seed production. The sum of CoA and acetyl-CoA levels was severely reduced (60%–80%) in ppat-1 seedlingscompared to wild type, and catabolism of storage lipids during seedling establishment was delayed. Conversely, PPAToverexpressing lines showed, on average, approximately 1.6-fold higher levels of CoA 1 acetyl-CoA levels, as well as enhancedvegetative and reproductive growth and salt/osmotic stress resistance. Interestingly, dry seeds of overexpressing lines containedbetween 35% to 50% more fatty acids than wild type, which suggests that CoA biosynthesis plays a crucial role in storage oilaccumulation. Finally, biochemical analysis of the recombinant PPAT enzyme revealed an inhibitory effect of CoA on PPATactivity. Taken together, these results suggest that the reaction catalyzed by PPAT is a regulatory step in the CoA biosyntheticpathway that plays a key role for plant growth, stress resistance, and seed lipid storage.

Coenzyme A (CoA) is an essential cofactor in nu-merous biosynthetic, degradative, and energy-yieldingmetabolic pathways (Begley et al., 2001). The synthesisof CoA, starting from pantothenate as a precursor,occurs in five steps and the corresponding biosyntheticenzymes have been cloned in both prokaryotes andhigher eukaryotes (Begley et al., 2001; Daugherty et al.,2002; Kupke et al., 2003; Leonardi et al., 2005). Theuniversal pathway for biosynthesis of CoA from panto-thenate is initiated by phosphorylation of this precursorto generate 4#-phosphopantothenate, which is catalyzedby pantothenate kinase (PANK; CoaA). In unicellularorganisms and animal systems, the rate of CoA biosyn-thesis appears to be regulated by feedback inhibition of

PANK. Recently, two plant PANKs, namely, AtPANK1and AtPANK2, have been characterized in Arabidopsis(Arabidopsis thaliana) and, as a result, a pank1-1pank2-1double mutant was found to be embryo lethal (Tiltonet al., 2006). The second step of CoA biosynthesis involvesthe addition of Cys to 4#-phosphopantothenate mediatedby 4#-phospho-N-pantothenoyl-Cys synthetase (PPCS;CoaB). In the next step, 4#-phospho-N-pantothenoyl-Cys decarboxylase (PPCDC; CoaC) catalyzes the gener-ation of 4#-phosphopantetheine. Two Arabidopsis genes,AtHAL3A and AtHAL3B, encode essential PPCDC en-zymes, and combined inactivation of both genes abortedembryogenesis at the early globular stage (Rubio et al.,2006). The penultimate step in the CoA biosynthetic path-way is catalyzed by the enzyme 4#-phosphopantetheineadenylyltransferase (PPAT; CoaD), which catalyzes thereversible adenylation of 4#-phosphopantetheine toform 3#-dephospho-CoA (dPCoA) and pyrophosphate(PPi; see Fig. 5A). Finally, dephospho-CoA kinase(DPCK; CoaE) catalyzes the last step of the CoA bio-synthetic pathway, which involves the phosphoryla-tion of the 3#-hydroxy group of the Rib sugar moietyfrom dPCoA to form CoA and ADP.

Considering the central role of CoA in plant metab-olism, the analysis of mutants impaired in CoA bio-synthesis has received limited attention (Rubio et al.,2006; Tilton et al., 2006). Recently, we reported that

1 This work was supported by Ministerio de Educacion y Cienciaand Fondo Europeo de Desarrollo Regional (grant nos. BIO2002–03090 and BIO2005–01760) and by Consejo Superior de Investiga-ciones Cientıficas (fellowship to S.R.).

* Corresponding author; e-mail [email protected] author responsible for distribution of materials integral to the

findings presented in this article in accordance with the policydescribed in the Instructions for Authors (www.plantphysiol.org) is:Pedro L. Rodriguez ([email protected]).

[W] The online version of this article contains Web-only data.www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.108.124057

546 Plant Physiology, September 2008, Vol. 148, pp. 546–556, www.plantphysiol.org � 2008 American Society of Plant Biologists

a hal3a-1hal3b-1 double mutant was embryo lethal,whereas seedlings that were null for HAL3A andheterozygous for HAL3B (aaBb hal3 mutant) displayeda Suc-dependent phenotype for seedling establish-ment (Rubio et al., 2006). In this article, we havefocused on the next step of CoA biosynthesis, which iscatalyzed by the enzyme PPAT. Studies in Escherichiacoli and mammals of the intermediates in CoA bio-synthesis have shown that, in addition to control ofthe synthesis at the level of PANK, further modulationof flux through the pathway occurs at PPAT as bothpantothenate and 4#-phosphopantetheine can accu-mulate in the cell under limiting conditions for CoAbiosynthesis (Jackowski and Rock, 1984; Rock et al.,2000). In humans, both PPAT and DPCK activity areencoded in a single gene that gives rise to a bifunc-tional enzyme named CoA synthase (Daugherty et al.,2002). In contrast, plants have separate monofunc-tional enzymes encoded by distinct genes (Kupkeet al., 2003). The Arabidopsis PPAT gene product

was identified by its strong homology to the humancounterpart in CoA synthase and its biochemical ac-tivity has been confirmed in vitro (Kupke et al., 2003).In this article, we have performed analyses of gain-of-function and reduction-of-function mutants in PPAT,providing evidence on its role in plant growth, osmoticstress resistance, and lipid metabolism.

RESULTS

Isolation and Characterization of a T-DNA InsertionMutation in the Arabidopsis PPAT Gene

A T-DNA disrupted allele of PPAT was identified atthe SALK collection (http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress), corresponding to donor stock numberSALK_093728 and designated ppat-1 (Fig. 1A). TheT-DNA insertion in ppat-1 is localized to the secondintron, 652 nucleotides downstream of the ATG startcodon. Three additional T-DNA lines localized in thevicinity of the PPAT transcription unit were identified,but they did not affect significantly PPAT gene expres-sion (data not shown). The ppat-1 mutant showed anapproximately 90% reduction in the expression ofPPAT compared to wild type (Fig. 1B). Quantitativereal-time-PCR (qRT-PCR) analysis consistently de-tected residual approximately 10% expression, whichsuggests that splicing of the intron where the T-DNAwas inserted occurred to some extent.

An impairment in vegetative growth was observedfor ppat-1 seedlings both in medium lacking or sup-plemented with 1% Suc (Fig. 2, A and B); nevertheless,the phenotype was not so severe as those of aaBb hal3seedlings in medium lacking Suc (Rubio et al., 2006;Fig. 2C), and, in contrast to aaBb hal3 progeny, seedlingestablishment was not compromised in ppat-1 (Fig.2D). The ppat-1 mutant was viable, but the percentageof survival after transferring seedlings germinated inMurashige and Skoog plates to soil was below 30%(data not shown). Subsequent growth in soil and seedproduction of ppat-1 plants was severely reduced com-pared to wild-type plants (Fig. 2, E and F; see Fig. 3D).In general, reproductive growth was impaired in ppat-1plants because fewer inflorescence stems were presentper plant (see Fig. 3D). To verify that the observedphenotypes were a consequence of impaired PPATexpression, we generated complementation lines forppat-1. To this end, the PPAT cDNA was placed underthe control of the 35S promoter and introduced intoppat-1 via Agrobacterium tumefaciens. Primary transform-ants (T1) were selected for hygromycin resistance and aT3 population homozygous for the transgene was ob-tained. Introduction of the wild-type PPAT allele com-plemented the above-described phenotypes (Fig. 2; seeFig. 3D), which proved that a reduction-of-functionmutation in PPAT was responsible for these pheno-types. qRT-PCR analysis showed that the introductionof PPAT under the control of a 35S promoter led tohigher expression levels than those obtained from the

Figure 1. Molecular characterization of the ppat-1 mutant. A, Schemeof the PPAT gene and localization of T-DNA insertion. The numberingbegins at the ATG translation start codon. The T-DNA left border primer(LBb1) that was used to localize the T-DNA insertion as well as primersused for qRT-PCR analysis (FCoaD, RCoaD) are indicated. Black boxesrepresent exons. B, qRT-PCR analysis of PPAT expression in mRNAsprepared from 10-d-old seedlings (whole tissue) of wild type, ppat-1,Comp line, and PPAT OE lines. Data are averages 6 SD from threeindependent experiments. Expression of b-actin-8 was used to normal-ize data.

CoA and PPAT Role in Growth, Stress, and Lipid Storage


native promoter (Fig. 1B). Indeed, some significantdifferences on root growth, seed production (Fig. 2),and fatty acid (FA) content (see Fig. 6A) were found inthe complementation lines as compared to wild type.

Overexpression of PPAT Leads to Enhanced Growthand Salt/Osmotic Stress Resistance

Plants that overexpress the gene encoding theAtHAL3A PPCDC showed improved growth undersalt and osmotic stress (Espinosa-Ruiz et al., 1999).Overexpression of tobacco (Nicotiana tabacum) HAL3also enhanced salt and osmotic stress tolerance in cul-tured tobacco cells (Yonamine et al., 2004). Althoughthese works did not prove that CoA levels wereaffected by the overexpression of HAL3, their resultssuggested that regulation of CoA levels must play animportant role in the integration of plant growth and

stress resistance. To test this hypothesis, we generatedPPAT overexpressing (OE) lines in wild-type back-ground. Three lines homozygous for the selectionmarker at the T3 generation were selected and usedfor further analyses. qRT-PCR analysis showed thatPPAT expression in OE lines was between 45- and90-fold higher than in wild type (Fig. 1B).

The combined amount of free CoA and acetyl-CoA(AcCoA) was determined using the spectrophoto-metric enzyme cycling assay described originally byAllred and Guy (1969; Fig. 3A). OE lines showed, onaverage, 1.6-fold higher levels of free CoA 1 AcCoAthan wild type (Fig. 3A). In contrast, the ppat-1 mutantshowed a reduction of either approximately 60% orapproximately 80% compared to wild type in medium1Suc or 2Suc, respectively (Fig. 3A). Whereas leafgrowth was reduced in ppat-1 plants compared to wildtype (Fig. 2E), OE lines showed increased leaf growth

Figure 2. Growth phenotype of ppat-1 mutant and genetic complementation. A, Growth of wild type, ppat-1, and Comp line inmedium supplemented with 1% Suc (1Suc) or lacking Suc (2Suc). B, Quantification of root growth in 5-d-old seedlings. Valuesare averages 6 SD (n 5 100). C and D, Seedling (7-d-old) growth and establishment of wild-type, ppat-1, and aaBb plants. Scalebar 5 1 cm. Values in D are averages 6 SD for three independent experiments (200 seeds each). E, Growth in soil of wild type,ppat-1, and Comp line, and quantification of leaf area in 21-d-old plants. Values are averages 6 SD (n 5 20). F, Seed production.Values are averages 6 SD (n 5 20). *, P , 0.05 (Student’s t test) with respect to wild type.

Rubio et al.


(Fig. 3, B and C). These results suggest that manipu-lation of CoA levels through modulation of PPATexpression correlates with plant growth. Growth rate,as estimated from the number of rosette leaves perplant in a time course, was not significantly altered inOE lines (Supplemental Fig. S1), although floral stemproduction was, on average, 2 d faster in OE linescompared to wild type (18 6 1 d in OE lines; 20 6 1 din wild type). Additionally, reproductive growth (Fig.3D) and seed production (Supplemental Fig. S2) weresignificantly higher in OE lines than wild type. Seed-lings from OE lines grown in medium lacking Sucshowed both higher fresh weight and root growth thanwild type (Fig. 3, E and F). These differences wereattenuated when plants were grown in medium sup-plemented with Suc (Fig. 3, E and F).

To test salt and osmotic stress sensitivity of OE lines,we transferred 7-d-old seedlings grown in medium

containing 1% Suc to medium supplemented eitherwith NaCl or mannitol, both in the absence or presenceof Suc (Fig. 4). Compared to wild-type plants, OE linesshowed higher fresh weight and primary root growthunder salt and osmotic stress conditions (Fig. 4, B andC). Taking into account that, in the absence of stress,the OE lines also showed higher growth than wildtype, the enhanced resistance to salt and osmoticstress-induced growth inhibition might be, at leastpartially, a consequence of the enhanced vigor ob-served in these lines. Indeed, the ppat-1 mutantshowed both reduced growth and severe sensitivityto salt/osmotic stress (Supplemental Fig. S3). Underthese conditions of low water availability, a dramaticreduction both in the number and length of secondaryroots was observed in wild-type plants (Fig. 4D; Sup-plemental Fig. S3). OE lines suffered a less severereduction and overall root biomass was notably higher

Figure 3. Phenotype of PPAT OE lines. A, Thesum of CoA and AcCoA levels was deter-mined in 12-d-old seedlings (whole tissue)from wild type, ppat-1, and PPAT OE linesgrown in medium supplemented with 1% Suc(1Suc) or lacking Suc (2Suc). Values areaverages 6 SE from two independent experi-ments. Values from OE lines represent pooleddata from three independent lines. B and C,Increased leaf growth in PPAT OE lines com-pared to wild-type plants. Quantification ofleaf area and photograph of plants grown insoil for 2 weeks. Values are averages 6 SE (n 5

20). D, Enhanced reproductive growth of OElines as compared to wild-type plants. E,Growth of wild-type and OE lines in medium1Suc or 2Suc after 12 d. F, Quantification ofboth root growth and fresh weight for wild-type and OE lines in medium 1Suc or 2Suc.A representative OE line is shown in D, E, andF. *, P , 0.01 (Student’s t test) with respect towild type.



than in wild-type plants (Fig. 4D; Supplemental Fig.S3). A partial explanation of the improved growthunder osmotic stress observed in OE lines might be anenhanced accumulation of compatible osmolytes, suchas Pro. Indeed, osmotic adjustment due to increasedPro deposition plays an important role in the mainte-nance of root elongation at low water potentials(Voetberg and Sharp, 1991). Figure 4E shows that OElines contained approximately 2-fold higher levels ofPro than wild type in medium lacking exogenous

supplementation of Suc. Additionally, Figure 4Eshows that wild type was more dependent than OElines on exogenous supplementation of Suc to increasePro levels under salt stress.

Enzymatic Characterization of PPAT

The activity of Arabidopsis PPAT has been previ-ously assayed by adding different combinations ofrecombinant enzymes to a reaction mixture containing

Figure 4. Enhanced resistance toboth salt and osmotic stress in OElines as compared to wild type.Seedlings grown in medium con-taining 1% Suc were transferred tomedium supplemented with 75 mM

NaCl (Na1), 125 mM NaCl (Na2),150 mM mannitol (M1), or 250 mM

mannitol (M2), in the presence orabsence of exogenous Suc. Controlseedlings (C) were transferred tomedium lacking NaCl or mannitolto measure growth in the absence ofstress. A representative OE line fromthree independent lines is shown. A,Representative photograph takenafter 11 d. Scale bars 5 4 cm. B,Quantification of fresh weight (FW)after 11 d. Data from control seed-lings correspond to 50% of truevalues. C, Quantification of primaryroot growth after 7 d. D, Quantifi-cation of secondary root growthafter 11 d. Values are averages 6

SE for two independent experiments(30 seedlings each). E, Determina-tion of Pro content in wild-type andOE lines after treatment with 125mM NaCl for 48 h.

Rubio et al.


pantothenate, ATP, Mg21, Cys, and dithiothreitol(DTT; Kupke et al., 2003). For instance, a mixture ofCoaA, CoaB, CoaC, and PPAT was able to catalyze thesynthesis of dPCoA. When CoaC was omitted from theassay, dPCoA was not generated, which indicates thatPPAT does not accept 4#-phosphopantothenoyl-Cys asa substrate (produced by the combined action of CoaAand CoaB). However, steady-state kinetics and bio-chemical regulation have not been investigated for theindividual PPAT enzyme. PPAT catalyzes the revers-ible transfer of an adenylyl group from Mg21-ATP to4#-phosphopantetheine to form dPCoA and PPi (Fig.5A). Therefore, it is possible to assay PPAT activity inthe reverse direction using hexokinase and Glc-6-Pdehydrogenase to couple ATP production to NADPreduction (Geerlof et al., 1999). Thus, using recombi-nant maltose binding protein (MBP)-PPAT (Fig. 5B),the initial rate of the reverse reaction was measuredat varying concentrations of the commercial sub-strate dPCoA (Fig. 5C). The kinetic parameters forthe reverse reaction were found to be KM (dPCoA) 5 37 62.1 mM, Kcat 5 3.4 6 0.2 s21, and Vmax 5 0.34 6 0.02 mmolmin21 mg21 protein.

The CoA metabolic intermediate 4#-phosphopante-theine is present in significant amounts both in E. coliand mammals, which suggests that PPAT catalyzes arate-limiting step in the pathway (Jackowski and Rock,1984; Rock et al., 2000). Such enzymes are oftensubjected to feedback regulation by end products ofthe pathway. Therefore, we have examined the effectof CoA and AcCoA on PPAT activity (Fig. 5D).Whereas AcCoA had almost no effect on PPAT activityup to 40 mM, CoA had an IC50 5 38.6 6 1.9 mM, which isclose to the Km for dPCoA.

FA and Acyl-CoA Measurements

The FA content in dry seed from wild type, ppat-1,complemented (Comp), and OE lines was analyzed(Fig. 6A). FA content per seed in ppat-1 appeared lowerthan in wild type, although it was not statisticallysignificant (P , 0.15). Therefore, although seed yieldper plant was lower for ppat-1 plants, normal oil de-position within individual seeds occurred during seeddevelopment. A statistically significant increase intotal FA content was measured both in the Comp (P ,0.026) and OE (P , 0.012) lines. Individual profiling ofthe major FAs from Arabidopsis dry seeds showedthat the OE lines contained between 35% to 50% moreFAs, namely, oleic, linoleic, linolenic, and eicosenoicacid, than wild-type seeds (Supplemental Fig. S4).Measurement of the total acyl-CoA pool was per-formed at 5 d after imbibition (DAI) both in mediumlacking or supplemented with Suc as described byLarson and Graham (2001). In agreement with previ-ous results (Rubio et al., 2006), Suc supplementationled to stimulation of acyl-CoA biosynthesis comparedto medium lacking Suc (Fig. 6B). Total acyl-CoA levelsin ppat-1 were approximately 68% and 50% of wild-type levels at 5 DAI in medium 1Suc and 2Suc,respectively. In contrast, PPAT OE lines containedapproximately1.4 and 1.3-fold higher levels of acyl-CoAs than wild type in medium 1Suc and 2Suc,respectively. These changes broadly mimicked thoseobserved for CoA and AcCoA levels in older plants inthese lines (Fig. 3), indicating a relationship betweenfree CoA availability and the size of the acyl-CoA pool.

A time course analysis of the FA content from thedifferent genetic backgrounds at 0, 2, and 5 DAI in

Figure 5. Biochemical characterization ofPPAT enzyme in the reverse reaction. A,Scheme of the reversible reaction catalyzedby PPAT. B, Recombinant MBP-PPAT fusionprotein in E. coli crude extract (1) and afterpurification by affinity chromatography (2).The apparent molecular mass of the protein isindicated. C, Enzyme kinetics of recombinantMBP-PPAT. The enzyme (40 nM) was assayedas described in ‘‘Materials and Methods’’ andthe reduction rate of NADP to NADPH wasmonitored by measuring A340 wavelength.Regression analysis of the data (R2 5 0.99)was performed using Microsoft Excel softwareto calculate the initial velocity (V0) of thereaction at different substrate concentrations.D, Inhibition of PPAT activity by CoA (D) andAcCoA (n). Values are averages 6 SD for twoindependent experiments. Regression analysisof the data was performed using Graph Pad4.0 software.



medium supplemented with Suc was performed (Fig.6C). Suc supplementation leads to slower consump-tion of the reserve lipids (Eastmond et al., 2000; Martinet al., 2002), and this delay was notably increased bothin ppat-1 and OE lines at 2 DAI, where FA consump-tion was stalled (Fig. 6C). In particular, the level of thestorage triacylglycerol-specific FA, eicosenoic acid(20:1n9), decreased approximately 40% in wild-typeseedlings at 2 DAI, whereas almost no reduction wasobserved in the ppat-1 mutant and OE lines (Fig. 6D).The accumulation of 20:1n9 in ppat-1 and OE linessuggests that early FA catabolism was stalled underthese germination conditions in contrast to the sharpcatabolism observed in wild type. However, 20:1n9had been mostly consumed at 5 DAI, which suggeststhat only early use of reserve lipids was compromisedin these lines. In medium lacking exogenous Suc,

faster consumption of FAs was observed in the differ-ent genotypes (Fig. 6, E and F). The severe impairmentof FA catabolism at 2 DAI reported above for ppat-1and OE lines was not observed in medium lackingexogenous Suc; however, delayed consumption of20:1n9 was found in ppat-1 compared to wild type.Thus, the level of eicosenoic acid decreased approxi-mately 60% in wild-type seedlings at 2 DAI, whereasapproximately 40% reduction was observed in theppat-1 mutant (Fig. 6D).

DISCUSSION

A universal five-step pathway is followed both bybacteria and eukaryotic organisms to synthesize CoAfrom pantothenate. In plants, double null mutations

Figure 6. Measurements of FAs and acyl-CoAs. A, Total FA content in dry seeds of the indicated genotypes. B, Acyl-CoA contentin seedlings grown 11% Suc or 2Suc at 5 DAI. C and E, Total FA content at 0, 2, and 5 DAI from seedlings grown 11% Suc or2Suc, respectively. D and F, Eicosenoic acid content at 0, 2, and 5 DAI from seedlings grown 1Suc or 2Suc, respectively. Valuesare averages 6 SD for five separate determinations, expressed on a per-seed/seedling basis. *, P , 0.03 (Student’s t test) whencompared with data from each genotype and wild type in the same growth conditions.

Rubio et al.


that lead to a complete blockade of either the first orthird step of the CoA biosynthetic pathway (i.e. PANKand PPCDC activities) have been reported to be em-bryo lethal (Rubio et al., 2006; Tilton et al., 2006).Although these works have established the essentialnature of this pathway, either the embryo-lethal phe-notype or the genetic segregation of the aaBb mutantmade further study of the pathway difficult. Addi-tionally, mutants affected in the enzymes that catalyzethe three remaining steps of the pathway have notbeen described.

In this article, we took advantage of a viablereduction-of-function mutation and gain-of-functionlines that affect the penultimate step of the CoAbiosynthetic pathway to study its impact on plantgrowth, stress response, and lipid metabolism. Theresults show that PPAT plays an important role indetermining CoA levels. Additionally, we showed thatPPAT function correlated with plant growth and stressresistance and enhancement of CoA biosynthesisthrough overexpression of PPAT led to plants withhigher vigor and stress resistance than wild-typeplants. In contrast, the ppat-1 mutant hereby studiedshowed a remarkable impairment in growth, whichwas apparent both in the absence or presence ofexogenous Suc. However, the remaining expressionof PPAT was sufficient for seedling establishment,although further vegetative and reproductive growth,as well seed yield, were severely impaired comparedto wild-type plants. These phenotypes are likely areflection of the key role played by CoA in a multitudeof enzymatic reactions, such as the oxidation of FAs,carbohydrates, and amino acids, as well as manybiosynthetic reactions (Begley et al., 2001). Growthdefects of ppat-1 were complemented upon introduc-tion of a wild-type PPAT copy under the control of the35S promoter. Most morphological features from com-plemented lines were similar to wild type, althoughsignificant differences were found for root growth,seed production, and FA content, somehow resem-bling a weak OE line.

Overexpression of PPAT led to enhanced vegetativegrowth compared to wild type. Thus, during pho-toautotrophic growth in soil, both vegetative andreproductive growth was higher in OE lines than inwild-type plants (Fig. 3). Similarly, both root growthand fresh weight were higher in seedlings from OElines grown in vitro in the absence of Suc. Increasedroot biomass is usually associated with enhanceddrought tolerance (Park et al., 2005; Verslues et al.,2006). OE lines, which showed higher root growththan wild type under nonstressed conditions, alsoshowed higher primary and secondary root growththan wild-type plants under stress conditions. As aresult, better integration of plant growth with envi-ronmental stress was found in these OE lines. Thus,water stress avoidance through increased root biomasscan explain the better performance under stress ofthe OE lines. Additionally, stress tolerance might beachieved through both compatible solute accumulation

and different metabolic changes that avoid cellulardamage caused by water loss. Interestingly, uponosmotic stress, 2-fold higher levels of Pro were syn-thesized in OE lines than wild type in medium lackingexogenous Suc (Fig. 4E). Exogenous Suc stimulated2-fold the synthesis of Pro in wild type, whereas OElines were less dependent than wild type on exoge-nous supplementation of Suc to synthesize Pro. Thisfact is clearly advantageous to cope with water stressas carbon reduction and phloem transport are im-paired under these conditions (Wardlaw, 1967; Tullyet al., 1979). Pro is mainly synthesized through a Glu-derived pathway and therefore the carbon skeletonbackbone is derived from the citric acid cycle. PPATOE lines have higher levels of CoA and AcCoA thanwild type, which might enhance the synthesis of thedifferent intermediates of the citric acid cycle.

PPAT catalyzes a secondary regulatory step in CoAbiosynthesis after the PANK master regulatory point(Jackowski and Rock, 1984; Rock et al., 2000, 2003).Enhancing flux of the CoA biosynthetic pathway in E.coli through introduction of a PANK version that isrefractory to inhibition by CoA led to higher accumu-lation of 4#-phosphopantetheine (the substrate of PPAT)than CoA, which illustrates that PPAT is a second sitefor regulation of CoA biosynthesis after PANK (Rocket al., 2003). In mammals, 4#-phosphopantetheine ac-cumulates as the second most abundant metabolite ofthe CoA pathway after pantothenate, which suggeststhat both PPAT and PANK catalyze rate-limiting stepsin CoA biosynthesis (Rock et al., 2000). Transient over-expression of PANK1b abolished the accumulation ofpantothenate and resulted in at least a 10-fold increaseof intracellular CoA levels, although also a 3-fold ac-cumulation of 4#-phosphopantetheine was measured(Rock et al., 2000). Arabidopsis PPAT OE lines con-tained increased levels of CoA species (Figs. 3A and6E), which indicates that PPAT limits CoA productionin plants to some extent. Unfortunately, PPAT activitycould not be demonstrated directly in Arabidopsisseedlings or leaves either in crude plant extracts orafter partial purification through Sephadex G-25 gelfiltration and ammonium sulfate precipitation (data notshown). The presumably low abundance of PPAT,together with background contaminants (PPAT is usu-ally assayed by following ATP or PPi production) mightexplain the failure to detect PPAT activity in plantextracts. For instance, the activity of a plant enzymeinvolved in pantothenate biosynthesis could only bedetected in purified mitochondria at specific activitiesof 0.5 nmol/min mg protein (Ottenhof et al., 2004). Incontrast, we could easily measure PPAT activity usingrecombinant protein and provide steady-state kineticparameters of the enzyme (Fig. 5). The Kcat for PPAT (3.4s21) was comparable to that reported for E. coli PPAT(3.3 s21) and the bifunctional pig liver enzyme (7.7 s21),whereas the Km of Arabidopsis PPAT for dPCoA (37mM) was notably higher than in bacterial and mamma-lian enzymes (7 and 11 mM, respectively; Geerlof et al.,1999; Aghajanian and Worrall, 2002).



Finally, an inhibitory effect of CoA (IC50 5 38 mM) onPPAT activity was found. It is difficult to preciselyestimate the concentration of free CoA in differentplant tissues at different developmental stages toevaluate the physiological relevance of this CoA effecton PPAT activity (Tumaney et al., 2004). In spinach(Spinacia oleracea) leaves, the extraplastid AcCoA con-centration (likely dominated by the cytosolic pool) is ofthe order of 40 to 65 mM (Tumaney et al., 2004). AcCoAis present in large excess over free CoA in seeds, but inspinach leaves or green silique walls both CoA speciesare in the same order of magnitude (Gibon et al., 2002;Tumaney et al., 2004). In addition, the IC50 of CoA onPPAT activity is quite close to the Km for the substratedPCoA. Therefore, it seems reasonable that CoA hasan inhibitory effect on PPAT activity under physiolog-ical conditions that might act as a negative feedbackregulatory mechanism. CoA is indeed tightly bound tothe purified E. coli enzyme (Geerlof et al., 1999), andthe crystal structure of E. coli PPAT complexed withdPCoA, 4#-phosphopantetheine, or CoA has beensolved (Izard and Geerlof, 1999; Izard, 2002, 2003).Analysis of the PPAT:CoA structure reveals that CoAbinds to the active site in a distinct way to dPCoA and4#-phosphopantetheine (Izard, 2003). As a result, CoAis not a substrate for PPAT and its binding to PPATsuggests negative feedback regulation on PPAT activ-ity as has been already established for PANK (Rocket al., 2003).

The ppat-1 mutation had a modest effect on the ac-cumulation of total FAs per seed, whereas overexpres-sion of PPAT resulted in a 35% to 50% increase of someFAs with respect to wild type (Supplemental Fig. S4).Impairment of CoA biosynthesis in the aaBb hal3 mu-tant also had no major impact on the accumulation ofFAs per seed (Rubio et al., 2006). However, both ppat-1and aaBb hal3 mutants show a reduced seed yield perplant and therefore FA yield per plant was reducedmore than 50% in both cases. These results suggest thatthe residual expression of PPAT and HAL3B throughoutplant life provided sufficient CoA supply to get normaloil deposition per individual seed at the expense ofreduced FA yield per plant. Although seedling estab-lishment was not prevented in ppat-1, as reported foraaBb hal3 (Rubio et al., 2006), severe impairment forearly seedling growth was observed when compared towild-type seedlings (Fig. 2C). Early lipid catabolismwas stalled in ppat-1 when the medium was supple-mented with exogenous Suc; however, in mediumlacking exogenous Suc, the ppat-1 mutant did notshow such dramatic phenotype, although the use ofeicosenoic acid was slower than in wild type (Fig. 6).The delay in FA consumption in ppat-1 might be attrib-uted to impairment of b-oxidation due to diminishedCoA biosynthesis. In contrast, the unexpected delay inFA consumption observed in the OE line suggests thatenhanced CoA biosynthesis may lead to either moreefficient use of exogenous Suc as an energy source and/or increased sensitivity to sugar signaling related inhi-bition of storage lipid catabolism.

Finally, the enhanced seed production of Arabidop-sis PPAT OE lines, together with the higher accumu-lation of FAs per seed, suggest that boosting CoAbiosynthesis might be an approach to engineer cropseeds with higher oil yield. Improved production ofvegetal oils both for feeding and biodiesel use are ofobvious interest. Additionally, the enhanced vegeta-tive and reproductive growth as well as the concom-itant improvement in osmotic stress resistance of PPATOE lines might also serve to engineer crops withhigher biomass production and to offer long-termsustainable solutions to agricultural land use.

MATERIALS AND METHODS

Plant Material and Growth Conditions

Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) plants were routinely grown under

greenhouse conditions in pots containing 1:3 vermiculite:soil. For in vitro

culture, seeds were surface sterilized by treatment with 70% ethanol for 20

min, followed by commercial bleach (2.5% sodium hypochlorite) containing

0.05% Triton X-100 for 10 min, and, finally, four washes with sterile distilled

water. Seeds were sowed on Murashige and Skoog (1962) plates composed of

Murashige and Skoog basal salts, 0.1% MES acid, 1% agar, and pH adjusted to

5.7 with KOH before autoclaving. When stated, 1% Suc was included in

the medium. Stratification of the seeds was conducted in the dark at 4�C for

3 d. After stratification (50 DAI), plates were transferred to a controlled-

environment growth chamber at 22�C under a 16-h-light/8-h-dark photope-

riod at 80 to 100 mE m22 s21.

Mutant Isolation

A line (Columbia background) containing a single T-DNA insertion in

PPAT (At2g18250) was identified from the SALK T-DNA collection (Alonso

et al., 2003) corresponding to donor stock number SALK_093728. To identify

individuals homozygous for the T-DNA insertion, genomic DNA was

obtained from kanamycin-resistant (50 mg/mL) seedlings and submitted to

PCR genotyping using the following primers: 5#-GGGAGTCTGTGATGG-

CCCAAT and 5#-CTTGACATAGGTCTCCACATTA. As T-DNA left border

primer of the pROK2 vector, we used the following: 5#-GCCGATTTCGGA-

ACCACCATC. The T-DNA-tagged mutant line was backcrossed once with

the wild type, verified by DNA gel-blot hybridization and also by segregation

analysis of the encoded antibiotic resistance gene.

Generation of Comp and OE Lines

The coding sequence of At2g18250 cDNA (obtained from the Arabidopsis

Biological Resource Center [ABRC]; clone U61663) was PCR amplified using

the following pair primers: FCoaD, 5#-GGATCCATGGCAGCTCCGGAAG-

ATTC and RCoaD, 5#-GGATCCTCATGATGCTTTTTCTTCTG. The PCR prod-

uct was cloned into the pCR8/GW/TOPO entry vector (Invitrogen) and

recombined by LR reaction into the pMDC32 destination vector (Curtis

and Grossniklaus, 2003). The pMDC32-35S:PPAT construct was transferred to

Agrobacterium tumefaciens C58C1 (pGV2260; Deblaere et al., 1985) by electro-

poration and used to transform ppat-1 mutant (Comp lines) and wild-type

plants (OE lines). Seeds of transformed plants were harvested and plated on

hygromycin (20 mg/mL) selection medium to identify T1 transgenic plants. T3

progeny that were homozygous for the selection marker were used for further

studies.

Seedling Establishment and Stress Assays

Seedling establishment of the different genetic backgrounds was scored as

the percentage of seeds that developed green expanded cotyledons and the

first pair of true leaves. Salt and osmotic stress tolerance assays were per-

formed by transferring 7-d-old seedlings grown in medium containing Suc to

medium supplemented with 75 mM NaCl, 125 mM NaCl, 150 mM mannitol, or

Rubio et al.


250 mM mannitol, respectively. Seedlings were grown vertically for 7 to 11 d

and periodically the plates were scanned on a flatbed scanner to produce

image files suitable for quantitative analysis using the National Institutes of

Health Image software (ImageJ; version 1.37).

Determination of Pro Content

Pro content was determined by HPLC/mass spectrometry (MS) in plant

extracts prepared in 80% ethanol from seedlings that were either mock- or 125

mM NaCl-treated for 48 h. Free amino acids in extracts were derivatized to

their isobutylchloroformate derivatives as described by Husek (1991) and

analyzed by liquid chromatography-MS as their MS2 fragments.

RNA Analyses

Whole-plant tissue was collected and frozen in liquid nitrogen. Total RNA

was extracted using a Qiagen RNeasy plant mini kit and 1 mg of the RNA

solution obtained was reverse transcribed using 0.1 mg oligo(dT)15 primer and

Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Roche) to finally obtain

a 40-mL cDNA solution. qRT-PCR amplifications and measurements were

performed using an ABI PRISM 7000 sequence detection system (Perkin-

Elmer Applied Biosystems). The sequences of the primers used for PCR

amplifications were as follows: for PPAT, forward 5#-GGGAGTCTGT-

GATGGCCCAAT and reverse 5#-CTTGACATAGGTCTCCACATTA; and for

b-actin-8 (At1g49420), forward 5#-AGTGGTCGTACAACCGGTATTGT and

reverse 5#-GAGGATAGCATGTGGAAGTGAGAA.

qRT-PCR amplifications were monitored using Eva-Green fluorescent stain

(Biotium). Relative quantification of gene expression data was carried out

using the 22DDCT or comparative CT method (Livak and Schmittgen 2001).

Expression levels were normalized using the CT values obtained for the

b-actin-8 gene. The presence of a single PCR product was further verified

by dissociation analysis in all amplifications. All quantifications were made

in triplicate on RNA samples.

PPAT Enzyme Assay

PPAT activity was assayed in the reverse direction using hexokinase and

Glc-6-P dehydrogenase to couple ATP production to NADP reduction

(Geerlof et al., 1999). The assay mixture contained 0.1 mM dPCoA, 2 mM

PPi, 2 mM MgCl2, 1 mM NADP1, 5 mM Glc, 1 mM DTT, 4 units of hexokinase,

and 1 unit of Glc-6-P dehydrogenase in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.

Recombinant PPAT was obtained as a fusion protein with MBP. To this end,

the coding sequence of PPAT was excised from the pCR8/GW/TOPO entry

vector using BamHI digestion and cloned into pMalc2. Expression of recom-

binant MBP-PPAT was induced with 1 mM isopropylthio-b-galactoside in

Escherichia coli DH5a cells and the fusion protein was purified by amylose

affinity chromatography according to the manufacturer’s instructions (New

England Biolabs).

Enzyme assays were carried out at 25�C and the increase in A340 was

monitored. One unit of activity corresponds to the formation of 1 mmol of

product/min using an extinction coefficient for NADPH of 6,220 M21 cm21.

Rates were corrected for background reduction of NADP.

Determination of AcCoA and CoA

AcCoA and CoA were determined basically as described in Gibon et al.

(2002) with minor modifications. Tissue samples (100–200 mg fresh weight)

were powdered using mortar and pestle and extracted with (100–200 mL) of

16% TCA. After centrifugation, the supernatant was brought to pH 6 to 7 by

the addition of 2 M Tris base. The sum of CoA and AcCoA was determined

using the spectrophotometric enzyme cycling assay described originally by

Allred and Guy (1969). Aliquots of 20 mL of extract were disposed into a

microplate and 150 mL of 100 mM Tris/HCl, pH 7.4, containing 0.25 mmol DTT

and 12.5 mmol malate were added and incubated for 10 min. Next, 80 mL of a

mixture containing 0.25 mmol DTT, 0.2 mmol NAD1, 0.6 mmol acetyl phos-

phate, 2.5 units phosphotransacetylase, 1.25 units citrate synthase, and 3 units

malate dehydrogenase in 100 mM Tris/HCl, pH 7.4, were added, the reaction

mixture was incubated at 25�C for 20 min, and absorbance was read at 340 nm.

Calibration curves using CoA and AcCoA standards (ranging from 0.5–10

pmol) were included with every set of determinations.

FA and Acyl-CoA Profiling

Lipids from 20 dry seeds per replica were extracted and transmethylated to

their FA methyl esters (FAMEs) together with tripentadecanoin as an internal

standard using a one-step procedure (Browse et al., 1986). FAMEs were

dissolved in hexane and 2-mL aliquots injected for gas chromatography-flame

ionization detector analysis using a BPX70 60 m 3 0.25 mm i.d. 3 0.25 mm film

thickness capillary column (SGE) and a CE Instruments GC8000 Top GC

(Thermoquest). Injection was made into a hydrogen carrier gas stream at 1.3

mL min21 (average linear velocity 35 cm s21) at a 30:1 split ratio. Temperature

was ramped as follows: 110�C isothermal 1 min; 7.5�C min21 to 260�C; cool

down 70�C min21 to 110�C; total analysis time, 23 min. FAMEs were identified

by comparison to a 37 FAME mix (Supelco). One hundred seedlings per

replica (approximately 3 mg for 0 DAI, 20 mg for 2 DAI, and 30 mg for 5 DAI

seedlings) were extracted for quantitative acyl-CoA analysis by HPLC with

fluorescence detection of acyl etheno-CoA derivatives (Larson and Graham,

2001; with modifications described by Larson et al., 2002). The lipid portion of

the acyl-CoA extracts was used for FA determinations as described above.

Supplemental Data

The following materials are available in the online version of this article.

Supplemental Figure S1. Growth rate in soil of wild type, ppat-1, Comp,

and OE lines.

Supplemental Figure S2. Higher seed production from OE lines com-

pared to wild type.

Supplemental Figure S3. Reduced stress tolerance of ppat-1 mutant and

higher generation of secondary roots in OE lines as compared to wild

type.

Supplemental Figure S4. Content of major FAs from Columbia wild type,

ppat-1, Comp, and OE lines.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Joseph Ecker and the Salk Institute Genomic Analysis Labora-

tory for providing the sequence-indexed Arabidopsis T-DNA insertion

mutants, and ABRC/Nottingham Arabidopsis Stock Centre for distributing

these seeds as well as the PPAT cDNA clone U61663. We thank Valeria Gazda

for extensive technical assistance in the acyl-CoA analyses.

Received June 5, 2008; accepted July 7, 2008; published July 11, 2008.

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Figure S1. Growth rate in soil of wild type (wt), ppat-1, complemented(Comp) and overexpressing lines (OE). A time-course experiment wasperformed to measure the number of rosette leaves per plant at 2, 5, 10,12 and 15 days after transferring to soil 5-day-old seedlings from theindicated genotypes. Values are averages ± SD (n=20). A representativeOE line is shown.

0

3

6

9

12

15

0 2 4 6 8 10 12 14 16

wtppat-1OEComp

Num

ber o

f ros

ette

leav

es/ p

lant

days

02468

10121416

wtOE

seed

s pe

r pla

nt (x

10-

3 )

Figure S2. Higher seed production from OE lines compared to wild type. Values areaverages ± SD from two independent experiments (n=20). Values from OE linesrepresent pooled data from three independent lines.

Figure S3. Reduced stress tolerance of ppat-1 mutant and highergeneration of secondary roots in OE lines as compared to wild type.Seedlings grown in medium containing 1% sucrose were transferredto medium supplemented with 125 mM NaCl or 250 mM mannitol, inthe presence or absence of exogenous sucrose. Control seedlings(C) were transferred to medium lacking NaCl or mannitol to measuregrowth in the absence of stress. Representative photograph takenafter 11 days. Scale bars correspond to 4 cm. A representative OEline from three independent lines is shown.

__ __ ____ ___ ____ ________ ___ ___ ________

125 mM NaCl 250 mM mannitolcontrol

- Suc

+ Suc

wt ppat OE lines wt ppat-1 OE lines wt ppat-1 OE lines

FA (n

mol

per

see

d)8

6

4

2

016:0 18:0 18:1 18:2 18:3 20:1

Col dry-seed

ppat-1 dry-seed

Comp dry-seed

OE dry-seed

Figure S4. Content of major FAs from Col wild type, ppat-1,complemented (Comp) and overexpressing lines (OE). Values areaverages ± SD for 5 separate determinations, expressed on a perseed basis. Contents of oleic (18:1), linoleic (18:2), linolenic (18:3)and eicosenoic acid (20:1) were between 35-50% higher in OE linesthan in wt.

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IV. Discusión

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El papel del CoA en el metabolismo primario y secundario de los sistemas vivos es absolutamente relevante (Begley et al., 2001; revisado por Leonardi et al., 2005a; Kaneshisa et al., 2006). Además, trabajos previos a esta memoria con mutantes en los genes de la ruta de síntesis del CoA en organismos procariotas o eucariotas como mamíferos o mosca, demostraban la esencialidad de la función de los genes de la ruta (Spitzer y Weiss, 1985; Begley et al., 2001; Zhou et al., 2001; Aghajanian et al., 2002; revisado por Leonardi et al., 2005; Kuo et al., 2005; Bosveld et al, 2008).

Aprovechando la información genética en las bases de datos y la genómica comparativa, la técnica de genética reversa nos permitió estudiar el papel fisiológico en la planta modelo Arabidopsis thaliana de genes de la ruta de biosíntesis del CoA.

En esta memoria se han utilizado mutantes de T-DNA de pérdida de función en el gen de Arabidopsis AtHAL3A (mutantes homozigotos hal3a-1 y hal3a-2), mutantes homozigotos en el gen AtHAL3B (hal3b), mutante heterozigoto para AtHAL3A y homozigoto para AtHAL3B (Aabb), mutante homozigoto para el gen AtHAL3A y heterozigoto para el gen AtHAL3B (aaBb) y el doble mutante para ambos genes aabb (Rubio et al., 2006). Se ha abordado la caracterización fenotípica de dichos mutantes, estudiando el papel de estos genes en la biosíntesis del CoA, y se aporta la primera evidencia genética acerca del papel esencial de este cofactor en la planta. Posteriormente, Tilton y colaboradores (2006) confirmaron con mutantes de pérdida de función de los genes PANK1 y PANK2 (doble mutante pank-1pank-2) la esencialidad de la síntesis del cofactor para la planta.

Se presentan también en esta memoria las consecuencias fenotípicas y metabólicas de la pérdida y sobreexpresión del gen que codifica el segundo enzima regulador en la ruta, PPAT, mediante el aislamiento de mutantes de T-DNA de pérdida de función (ppat-1) y de líneas de sobreexpresión del gen (35S:AtPPAT) (Rubio et al., 2008).

1.1 Aislamiento y caracterización de mutantes de inserción de T-DNA en los dos genes del paso que cataliza el enzima 4´-fosfopantotenoil-cisteína descarboxilasa, denominados AtHAL3A y AtHAL3B

En nuestro trabajo, se asilan primero mutantes de T-DNA homozigotos sencillos en las dos isoformas del gen AtHAL3A y del gen AtHAL3B (hal3a-1, hal3a-2 y hal3b). Los datos por qRT-PCR de expresión de los mRNAs de los correspondientes genes en plántulas de 5 días del silvestre y de los mutantes hal3a-1 y hal3b, indicaban que HAL3A es la isoforma predominante sobre HAL3B. Estos datos se correlacionan con los observados para niveles de transcrito en la base de datos del GENEVESTIGATOR o en el trabajo de Espinosa-Ruiz y colaboradores (1999), según el cual HAL3A tiene un papel predominante sobre HAL3B en todos los estadíos, y especialmente en estadío de plántula y silícua.

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1.2 Búsqueda del doble mutante aabb

Los mutantes sencillos hal3a-1 y hal3b no mostraban fenotipo de menor desarrollo comparados con el ecotipo silvestre. Dado que AtHAL3A y AtHAL3B comparten un 86% de homología de secuencia, la redundancia funcional entre ambos explicaría la falta de fenotipo. Decidimos por tanto generar el doble mutante aabb. Para ello, cruzamos el mutante hal3a-1 con el mutante hal3b. La búsqueda en la progenie F2 del doble mutante homozigoto para ambos genes (mutante aabb) resultó negativa. En dicha progenie, en cambio, sí se aislaron individuos homozigotos para el gen AtHAL3A y heterozigotos para el gen AtHAL3B (aaBb) y también individuos con el genotipo recíproco (individuos Aabb). Se comprobaría que en las silícuas F3 de ambos tipos de mutantes existía un 25% de abortos embrionarios que correspondían al doble mutante aabb.

Dicha letalidad ocurría en el estadío preglobular de desarrollo del embrión. En esta etapa, denominada de morfogénesis embrionaria, previa a la etapa de maduración de la semilla, tienen lugar alto número de divisiones celulares. Una titulación del CoA, probablemente es la causa de que los niveles iniciales de CoA, procedentes del tejido del embrión formado, disminuyan. Además, más de un 4% de los enzimas utilizan este cofactor, por tanto, resulta lógico que en el mutante aabb el crecimiento celular se detenga provocando el aborto embrionario. En definitiva, la letalidad embrionaria del mutante aabb revela un papel crucial del CoA durante la etapa temprana del desarrollo embrionario (Rubio et al., 2006).

Esta letalidad implica que una única copia de HAL3A (individuos Aabb), o de HAL3B (aaBb), en las plantas maternas, no soporta el desarrollo embrionario de individuos progenie aabb. Dicho de otro modo, es necesaria la biosíntesis de CoA de novo en el embrión para que la embriogénesis tenga lugar. Dado que la naturaleza bioquímica del CoA impide que el cofactor atraviese las membranas celulares (Shibata et al., 1983), el aporte embrionario de CoA desde el endospermo o la cubierta seminal parece improbable. Adicionalmente, mutantes de Arabidopsis de pérdida de función en el enzima PANK (doble mutante pank1-1pank2-1) resultaban embrio-letales, de nuevo demostrando la esencialidad del cofactor en este proceso (Tilton et al. 2006).

Por otro lado, la semilla de Arabidopsis se considera oleaginosa, ya que una parte mayoritaria del total de sus reservas son lípidos. A este dato se debe sumar la importancia de la correcta movilización de las reservas ya durante la etapa de desarrollo embrionario (revisado por Graham, 2008). Se ha observado también que en embriones de Brasica napus, un 10% de los lípidos son �-oxidados durante el desarrollo del embrión (Chia-Tansy et al., 2005). Partiendo de estas premisas, y dado que el CoA se utiliza en gran parte durante la �-oxidación de las reservas lipídicas, postulamos la idea de que fenotipos en mutantes de Arabidopsis afectados en la movilización lipídica podrían correlacionarse con los que se observaran en mutantes afectados en la biosíntesis del CoA.

Así, el doble mutante de pérdida de función en el enzima acil-CoA oxidasa de aciles de cadena corta (acx3-1acx4-1), que actúa dentro de la espiral de la �-oxidación, muestra

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letalidad embrionaria durante la primera fase de la embriogénesis. Esta letalidad embrionaria de acx3-1acx4-1 se puede explicar porque disminuyan los niveles de CoA por esterificación con los aciles. Este hecho, estaría en consonancia con que en el mutante aabb los menores niveles de CoA impidan una actividad metabólica adecuada en el embrión. También, en acx3-1acx4-1, puede que el secuestro del CoA por esterificación con los aciles-CoA de cadena corta afecte a la biosíntesis de ácidos grasos o de moléculas señalizadoras derivadas de éstos (Rylott et al., 2003; revisado por Graham 2008).

1.3 Mutantes aaBb requieren fuente de sacarosa exógena en el medio de crecimiento para el establecimiento de la plántula

En placas de medio de crecimiento carente de sacarosa, la progenie de individuos aaBb mostraba un fenotipo segregante de 2/3 de los individuos con genotipo aaBb con incapacidad para establecer plántula, frente a 1/3 de individuos aaBB que sí alcanzaban el fotoautotrofismo. El fenotipo de las plántulas aaBb en medio sin sacarosa consistía en incapacidad para elongar la radícula, para la adquisición del color verde de los cotiledones y una detención del crecimiento post-germinativo temprano, antes de la aparición del primer par de hojas (hacia los 5 días tras la imbibición de la semilla).

Este fenotipo no se observaba en la progenie de individuos de genotipo Aabb ya que la isoforma HAL3A tiene un papel predominante sobre HAL3B a lo largo de todos los estadíos de desarrollo de la planta. Además, en estadío de plántula y silícua, HAL3A muestra los mayores niveles de transcrito. Una copia única de HAL3A es suficiente para que la plántula alcance el fotoautotrofismo cuando en el medio de crecimiento no hay sacarosa, siendo la función de HAL3A particularmente crucial para el establecimiento de la plántula. En cambio, una copia única de HAL3B no es suficiente para soportar el establecimiento de la plántula en medio sin sacarosa pero el tener ambas copias del gen HAL3B rescata el fenotipo. Luego se aporta una evidencia in vivo para la función de HAL3B. Añadir al medio fosfopantetina, precursor reducido del producto de la reacción enzimática que catalizan HAL3A y 3B, (fosfopanteteína), rescataba también el fenotipo de dependencia de sacarosa en aaBb, indicando que una biosíntesis del CoA comprometida es la responsable de dicho fenotipo. También se deduce de estos resultados que la síntesis del CoA, por tanto, es necesaria para el establecimiento de la plántula.

Este fenotipo de dependencia de sacarosa para establecer plántula, coincide con el observado en mutantes que tienen comprometida la movilización de las reservas. Hipotetizamos de nuevo que mutantes que tuvieran afectada la síntesis del CoA podrían mostrar fenotipos similares a aquellos mutantes con la �-oxidación comprometida y en general, con la movilización lipídica afectada.

Se ha observado este fenotipo de dependencia de sacarosa para alcanzar el fotoautotrofismo en mutantes que tienen impedida la lipólisis de los ácidos grasos como el mutante en la TAG lipasa, sdp1 (Quettier y Eastmond, 2008). También de aquellos mutantes que tienen un defecto en el transporte de los ácidos grasos al peroxisoma,

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como ocurre con el mutante de pérdida de función en el transportador ABC, cts/ped3/pxa1 (Zolman et al., 2001; Footitt et al., 2002; Hayashi et al., 2002). También cuando está afectada la activación de los ácidos grasos a aciles-CoA dentro del peroxisoma, como es el caso del doble mutante en la acil-CoA sintetasa de cadena larga, lacs6-1lacs7-1 (Fulda et al., 2004), o bien en los mutantes que tienen impedido alguno de los pasos de la espiral de la �-oxidación, este es el caso del doble mutante acx1-1acx2-1, el mutante simple mfp2, o el kat2/ped1 (revisado por Graham, 2008). Más recientemente, se ha observado este fenotipo en mutantes de pérdida de función en los genes que codifican la malato deshidrogenasa del peroxisoma, pmdh1pmdh2, cuyo fenotipo de debe a un bloqueo producido en el flujo de la �-oxidación (Pracharoenwattana et al., 2007).

Adicionalmente, también plántulas de Arabidopsis que tienen impedida la actividad de dos enzimas del ciclo del glioxilato, mutantes en la MLS (malato sintasa; mls-1) o en la ICL (isocitrato liasa; icl-1/icl-2), o mutantes afectados en la gluconeogénesis endospérmica como ocurre en los mutantes simples en la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PCK1), pck-1, pck-2, muestran dependencia de sacarosa en el establecimiento de la plántula (Penfield et al., 2004). Los mutantes icl-1/2 y mls-1 no tienen tan severamente afectado el porcentaje de establecimiento como ocurre con mutantes de la �-oxidación. Esto es debido a que en el caso de icl1/2, estos mutantes son capaces de respirar los lípidos, es decir, en ausencia del encima ICL, el acetil-CoA de la �-oxidación pasa al ciclo de Krebs de la mitocondria para obtener energía respiratoria (Eastmond et al., 2000; Pracharoenwattana et al., 2007). En cuanto a los mutantes mls-1, el glioxilato producido por el enzima ICL puede ser metabolizado por una ruta alternativa fotorrespiratoria, con lo que aún son capaces de realizar la gluconeogénesis (Cornah et al., 2004).

También el doble mutante en el enzima citrato sintasa del peroxisoma (csy2csy3) muestra, una vez germinado, el fenotipo de dependencia de sacarosa para establecer plántula. Este enzima es clave para exportar el acetil-CoA, a través de su conversión en citrato, desde el peroxisoma a la mitocondria para su posterior respiración. El mutante csy2csy3 muestra el fenotipo más dramático observado en mutantes de la �-oxidación, es incapaz de movilizar los TAGs por lo que no puede germinar a no ser que se elimine el impedimento físico de la cubierta seminal y ni la sacarosa rescata el fenotipo durmiente. Una vez germinado tampoco puede establecer en ausencia de fuente de carbono debido a que el acetil-CoA no puede seguir siendo metabolizado, de modo que el uso de los lípidos queda bloqueado. Posiblemente que el acetil-CoA no salga del peroxisoma bloquea la �-oxidación. Otra explicación posible sería que el CoA queda secuestrado dentro del peroxisoma como acetil-CoA o bien por un efecto tóxico del acetil-CoA inhibiendo el crecimiento (Cornah et al., 2004).

El fenotipo que muestra el mutante aaBb de dependencia de sacarosa para establecerse parece más similar al observado en mutantes que tienen la movilización lipídica impedida (bien por fallo en la �-oxidación o bien porque el acetil-CoA no puede seguir siendo metabolizado), que al fenotipo que muestran los mutantes mls o icl, los cuales todavía pueden seguir metabolizando el acetil-CoA. En definitiva, el mutante aaBb parece incapaz de responder a la demanda en CoA exigida durante la etapa

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de establecimiento de la plántula para realizar la �-oxidación, lo que origina la dependencia de una fuente exógena de sacarosa.

El rescate del mutante heterozigoto aaBb por adición de sacarosa al medio durante el establecimiento de la plántula indica que este mutante es capaz de utilizar esta sacarosa como fuente de energía respiratoria. En este caso, la sacarosa y el acetil-CoA obtenido de ésta, se metabolizarían por la vía de ciclo de Krebs obteniendo energía y ayudando de este modo a superar la falta de CoA peroxisomal en el mutante. De manera adicional a este efecto de la sacarosa, es sabido que ésta retrasa la movilización de los lípidos (Eastmond et al., 2000; To et al., 2002; Martin et al., 2002). Por tanto, la adición de sacarosa al medio de crecimiento causaría una demanda menos inmediata del CoA peroxisomal ya que los procesos de movilización como la �-oxidación estarían retrasados y la energía obtenida del catabolismo de dicha sacarosa facilitaría el establecimiento.

Cabe mencionar también que son conocidos los efectos de la sacarosa como molécula señalizadora del metabolismo, de modo que la sacarosa debe tener múltiples efectos tanto a nivel de la transcripción de multitud de genes implicados en reacciones metabólicas así como a nivel post-transcripcional (Smeekens et al., 2000), que podrían explicar la superación de la inhabilidad en el establecimiento.

No obstante, el hecho de que la sacarosa rescate el fenotipo de dependencia de ésta para establecer plántula en aaBb, indica que el mutante tiene específicamente un defecto en la movilización de los lípidos causado por bajos niveles de CoA. Y el hecho de que Aabb no tenga este fenotipo prueba genéticamente el predominio de HAL3A sobre HAL3B.

1.4 Análisis de los perfiles de aciles-CoA y de ácidos grasos en dichos mutantes

Se midieron los niveles totales de aciles-CoA en los mutantes hal3a-1, hal3b, en el mutante aaBb y en el silvestre, en medio suplementado y sin suplementar con sacarosa y en la etapa de 5 días tras la imbibición de la semilla (momento en el que gran parte de la movilización lipídica ya ha tenido lugar).

Así, en hal3a-1 y hal3b, los niveles totales de aciles-CoA eran menores en dichos mutantes en medio sin sacarosa respecto a medio con sacarosa. Se observa en éstos mutantes, el efecto de la sacarosa de retraso sobre la movilización lipídica y por tanto de mayores niveles de los aciles-CoA en presencia de sacarosa. Además, ambos mutantes sencillos, hal3a-1 y hal3b, en medio sin sacarosa y en esa etapa tenían un 65% y un 79% respectivamente del nivel total de aciles-CoA del tipo silvestre.

Plántulas del mutante aaBb, seleccionadas por su fenotipo en medio sin sacarosa, presentaban sólo un 44% de niveles de aciles-CoA respecto al tipo silvestre. En comparación, en mutantes afectados en la �-oxidación se observan mayores niveles del pool total de aciles-CoA (revisado por Graham, 2008). El siguiente paso por tanto fue analizar el uso de los lípidos en dicho mutante aaBb. Al analizar en el mutante aaBb la cinética de utilización de los ácidos grasos desde semilla seca hasta día 5 tras la imbibición de la semilla y concretamente en medio sin sacarosa, hay un cierto consumo

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de los niveles totales de ácidos grasos lo que parece indicar que algo de catabolismo tiene lugar respecto a los niveles iniciales en semilla seca. No obstante, al analizar específicamente el perfil de los ácidos grasos, en el mutante aaBb a día 5 tras la imbibición, se observaba catabolismo incompleto de los ácidos grasos. En concreto, un ácido graso específico de reserva como es el eicosenoico (20:1) se acumulaba en el mutante aaBb. Este dato de catabolismo de ácidos grasos incompleto no parecería correlacionar con el de menores niveles de aciles-CoA, si se compara con lo observado en mutantes afectados en la �-oxidación. Sin embargo, parece ser que este catabolismo de los lípidos incompleto en aaBb, tendría que ver con una menor síntesis de aciles-CoA como consecuencia de síntesis de CoA reducida en dicho mutante. Además, esta limitación en CoA en dicho mutante afectaría también a la síntesis de ácidos grasos en la etapa de inicio de la fase fotoautotrófica –cuando se están formando las membranas cloroplásticas del primer par de hojas-, por esto, los niveles de un ácido graso característico de síntesis de membrana del cloroplasto como es el hexadecatrienoico (16:3n3) son muy bajos a día 5 tras las imbibición en el mutante aaBb.

De manera complementaria a esta explicación, se postula en la bibliografía que los aciles-CoA son reguladores de múltiples procesos entre los que destaca la inhibición de la propia �-oxidación. En concreto una limitación en los niveles de CoA causa una inhibición del enzima que cataliza el último paso de tiólisis del enlace � de los aciles-CoA que son degradados (Graham et al 2002). En el mutante aaBb hay acumulación de todos los tipos de aciles-CoA -desde los de 4 carbonos a los de 20 carbonos-, de modo que la la inhibición de esta tiolasa, por falta de niveles adecuados de CoA, también tendría sentido. El acetil-CoA (2C) estaba reducido un 20% en el mutante aaBb respecto al silvestre, en cambio, el succinil-CoA (4C) se acumulaba. En conclusión, los menores niveles de CoA del mutante aaBb parecen limitar la �-oxidación y por tanto la producción de acetil-CoA.

Además, los ácidos grasos de reserva que predominan en las semilla de Arabidopsis contienen en su estructura mayoritariamente 16 y 18 carbonos (palmítico (16:0), oleico (18:1), linoleico (18:2), linolénico (18:3), eicosenoico (20:1) y erúcico (22:1)). Al analizar el perfil de aciles-CoA en el mutante aaBb, los aciles-CoA correspondientes a los ácidos grasos de 16C y 18C cuantificados y referidos por plántula, no se acumulan en el mutante aaBb, lo que está reflejando un defecto en la acilación de los ácidos grasos en dicho mutante por carecer de niveles de CoA suficientes.

1.5 Fenotipo del mutante aaBb durante el desarrollo vegetativo y la producción de silícuas

Durante el desarrollo vegetativo, ni el mutante aaBb ni el Aabb mostraban fenotipo de menor desarrollo. En esta etapa de desarrollo una copia del gen HAL3A o una de HAL3B aportan el suficiente CoA demandado. Sin embargo, durante el desarrollo reproductivo, el mutante aaBb mostraba una reducción en el número de tallos y como consecuencia producía menor número de semillas comparado con el silvestre. Este

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fenotipo se observaba en el mutante Aabb aunque no era tan acentuado. En estadíos específicos de desarrollo, como en este caso el reproductivo, donde se presume que la demanda de CoA es mayor, son necesarias dos copias de HAL3B (aaBB) en lugar de una para compensar la falta de HAL3A; al igual que ocurría durante el estadío de establecimiento de la plántula.

1.6 Sensibilidad de la respuesta a estrés salino del mutante aaBb en ausencia de sacarosa en el medio

Los individuos aaBb, comparados con el silvestre, eran más sensibles a estrés salino en medio sin sacarosa. En medio con sacarosa la severidad de la respuesta se atenuaba. Posiblemente, el fallo que aaBb experimenta en la movilización de las reservas como consecuencia de contener menores niveles de CoA, acentuado por la carencia de sacarosa en el medio (y por tanto por la falta de energía oxidativa), provoca un efecto más marcado de sensibilidad a estrés por sal que si el medio contiene sacarosa.

Se ha comprobado que los genes AtHAL3A y AtHAL3B están inducidos por estrés salino (Espinosa-Ruiz et al., 1999). Existen también antecedentes previos sobre el efecto de sobreexpresar HAL3A en Arabidopsis observándose además de un aumento en el crecimiento de la planta, un aumento en la tolerancia al estrés salino y osmótico (Espinosa-Ruiz et al., 1999). También la sobreexpresión de HAL3A de Nicotiana tabacum conduce a una mejora en la tolerancia al estrés por litio, sal y aumenta la síntesis de prolina y arginina (Yonamine et al., 2004). En estos dos trabajos previos no se llegaron a medir los niveles de CoA en esas líneas, de modo que no se podría afirmar con rotundidad que el efecto en la tolerancia a dicho estrés se deba directamente a un mayor contenido en el cofactor.

Por tanto, la explicación más razonable para la mayor sensibilidad de aaBb al estrés salino tendría que ver con efectos de menor desarrollo y biomasa junto con otros efectos metabólicos (como los relacionados con la síntesis del osmolito prolina). En la síntesis de prolina interviene el ciclo de Krebs y por tanto también influyen los niveles de acetil-CoA en la célula. Resulta necesaria una integración entre respuesta a estrés y desarrollo y metabolismo de la plántula, y por tanto con niveles de CoA. Esta teoría queda reforzada en el trabajo con las líneas de sobreexpresión del siguiente gen de la ruta, PPAT, y su mejora de la tolerancia al estrés salino y osmótico, como se verá en su apartado.

2.1 Aislamiento y caracterización del mutante ppat-1 con pérdida parcial de función en la fosfopanteteína adenilato transferasa, PPAT

Los dos últimos pasos de la ruta están codificados por dos genes de copia única, gen PPAT (CoaD) y DPCK (CoaE).

Dados los antecedentes con el doble mutante aabb, era de esperar que mutantes de pérdida de función en alguno de estos dos últimos genes condujera también a letalidad embrionaria. Afortunadamente, pudimos identificar en la colección de SALK un

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mutante de T-DNA en el gen PPAT cuya inserción estaba localizada en medio de un largo intrón. Al analizar por qRT-PCR los niveles de transcrito del gen en el fondo ppat-1, se comprobó que el mutante presentaba un 10% expresión residual del gen PPAT. Esto nos permitiría analizar el fenotipo en la planta de este mutante parcial en la síntesis de CoA.

Plántulas de ppat-1 mostraban una reducción del desarrollo en general, crecidas en medio suplementado y sin suplementar con sacarosa. Sin embargo, el fenotipo de dependencia de sacarosa observado en el mutante aaBb, no lo mostraba ppat-1. Como se comentó en la introducción por los datos del GENEVESTIGATOR, el gen HAL3A muestra niveles de transcrito más elevados respecto al gen PPAT a lo largo de todo el desarrollo de la planta. La pérdida de función de HAL3A y el poseer sólo una copia de HAL3B es más determinante para el establecimiento de la plántula que el 10% de expresión de PPAT que permite al mutante ppat-1 llevar a cabo el establecimiento.

En cuanto al desarrollo vegetativo, en cambio, el mutante ppat-1 mostraba un bajo porcentaje de supervivencia en tierra así como el desarrollo vegetativo general de la planta y el desarrollo reproductivo -incluyendo la producción de semillas- afectados. Estos defectos de desarrollo en el mutante ppat-1 fueron complementados con las líneas de complementación al introducir la construcción 35S:PPAT en el fondo mutante. Este hecho explica que los defectos en desarrollo vegetativo se debieran a una síntesis del CoA limitada en el mutante ppat-1. Además, plantas de 12 días del mutante ppat-1 mostraban una reducción de la mezcla CoA/acetil-CoA del 60% y del 80% respecto al silvestre en medio con y sin sacarosa respectivamente .

En definitiva, el fenotipo de desarrollo comprometido en ppat-1 se explica por el importante papel del CoA dentro del metabolismo en general, tanto del catabolismo de aminoácidos y ácidos grasos como de otras rutas de biosíntesis entre las que estarían incluidas la de los lípidos, de aminoácidos o la síntesis de precursores de intermediarios del ciclo de Krebs (Begley et al., 2001).

2.2 Caracterización de líneas de complementación (C ) y líneas de sobreexpresión del gen AtPPAT (OE)

Las líneas de complementación (C) mostraban mayores niveles de transcrito de PPAT que el silvestre y las líneas de sobreexpresión (OE) mostraban niveles de transcrito mayores que las líneas de complementación. Las líneas de complementación restauraban el fenotipo de menor desarrollo que mostraba ppat-1 e incluso algunos caracteres como el tamaño de la raíz, la producción de semillas o el contenido en ácidos grasos de las semillas eran mayores al silvestre, como si fueran líneas de sobreexpresión débiles.

La sobreexpresión de PPAT en fondo silvestre dio como resultado un mayor desarrollo vegetativo, reproductivo y de producción de semillas comparado con el silvestre. Durante el desarrollo de la plántula también la raíz y el tamaño de los cotiledones tenían un claro mayor desarrollo comparado con el tipo silvestre.

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2.3 Efecto de los niveles de transcrito del gen PPAT en la síntesis de CoA

Los niveles de la mezcla acetil-CoA y CoA fueron medidos mediante un ensayo espectrofotométrico acoplado a ensayo enzimático cíclico (Allred y Guy, 1969) en plantas de 12 días crecidas en medio con y sin sacarosa. Las líneas OE a día 12 mostraban mayores niveles (1.6 veces más) que el silvestre en medio con y sin sacarosa. Además, como hemos comentado, plantas de 12 días del mutante ppat-1 mostraban una reducción de la mezcla CoA/acetil-CoA del 60% y del 80% respecto al silvestre en medio con y sin sacarosa respectivamente.

Se confirma así que el gen PPAT tiene un papel destacable en la determinación de los niveles de CoA.

Dado que las líneas OE mostraban un mayor desarrollo en general, y los mutantes ppat-1 una disminución de éste, se puede sugerir que manipular los niveles de CoA a través de la expresión del gen PPAT afecta al desarrollo de la planta.

2.4 Perfil metabólico de ácidos grasos en ppat-1 y en las líneas de complementación (C) y de sobreexpresión (OE)

Semillas de las líneas OE contenían desde un 35% hasta un 50% más de ácidos grasos de reserva respecto al tipo silvestre. Los niveles del ácido oleico (18:1), linoleico (18:2), linolenico (18:3) y eicosenoico (20:1) llegaban a ser un 50% superiores en semillas de las líneas OE respecto al silvestre (figura 15). Mientras que semillas de ppat-1 sólo mostraban niveles de ácidos grasos modestamente menores que los del silvestre (figura 15). Al igual que ocurría en aaBb, el que el mutante tuviera afectada la síntesis de CoA tampoco tenía un impacto importante en la deposición de los ácidos grasos.

Se comprueba que sobreexpresar el gen PPAT tiene efectos importantes durante la síntesis de los lípidos de reserva. Además, en general, mayores niveles de CoA y acetil-CoA en la célula deben favorecer reacciones como la síntesis de lípidos o de aminoácidos.

Como ocurría con plantas aaBb, el mutante ppat-1 muestra menor producción de semillas por planta, posiblemente éste es un recurso de la planta para producir menos semillas pero con los niveles adecuados de CoA como para que la deposición de los ácidos grasos sea óptima para su futura supervivencia. Al cuantificar los ácidos grasos totales en ambos mutantes y relacionarlos por planta en lugar de por semilla, la producción de ácidos grasos por planta cae más de un 50% en ambos mutantes.

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Figura 15. Cuantificación (en nmol/semilla) de los principales ácidos grasos de reserva en semillas

de las líneas que sobreexpresan PPAT (líneas de complementación y sobreexpresoras (OE)), del mutante ppat-1 y del silvestre. En el eje de ordenadas se muestran los ácidos grasos: palmítico (16:0), oleico (18:1), linoleico (18:2), linolénico (18:3) y eicosenoico (20:1). Los niveles de linoleico (18:2) en las líneas OE llegaban a ser un 50% superiores a los del tipo silvestre.

Al final de la etapa de morfogénesis del embrión tiene lugar la síntesis de las reservas lipídicas de Arabidopsis. La fase de maduración de la semilla, tras la morfogénesis del embrión, es una de las fases más importantes de la vida de una planta puesto que es en esta fase donde se sintetizan las reservas energéticas y estructurales que van a determinar la supervivencia y el vigor de la futura planta.

Se deduce de estos resultados y de los obtenidos con el mutante heterozigto hal3 (aaBb), que la expresión residual de PPAT o de una copia de HAL3B en la planta aporta el CoA suficiente para que la deposición de los lípidos por semilla sea la adecuada a expensas de reducir la producción de lípidos por planta.

2.5 Respuesta de mutantes afectados en el gen PPAT durante el proceso de establecimiento de la plántula en medio suplementado con sacarosa y sin suplementar. Perfiles de ácidos grasos y de aciles-CoA durante esta fase�

Plántulas ppat-1 establecían con normalidad pero tenían severamente afectado el desarrollo de la plántula comparadas con el silvestre. Mostraban menor desarrollo de raíz y menor tamaño de cotiledones y este fenotipo se acentuaba ligeramente en ausencia de sacarosa en el medio.

Por el contrario, durante esta etapa de crecimiento post-germinativo temprano, las líneas OE mostraban un mayor desarrollo y vigor en general respecto al silvestre tanto con como sin sacarosa en el medio. En ausencia de sacarosa, el silvestre reducía su desarrollo mientras que las líneas OE apenas quedaban afectadas por la falta de la fuente de carbono. A partir de estos datos, podemos sugerir que el metabolismo en las líneas OE está favorecido en general, de modo que en ausencia de sacarosa, las plántulas OE deben utilizar de manera eficiente el acetil-CoA y CoA, obteniendo

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eficientemente energía sin necesidad de obtenerla de la sacarosa. De manera alternativa, es posible también que el efecto que tiene la sacarosa en el retraso de la movilización de las reservas esté acentúado en las líneas OE debido a una mayor sensiblidad a la sacarosa en éstas.

Para estudiar cómo se estaban utilizando las reservas lipídicas en estos mutantes durante esta etapa de desarrollo heterotrófico, se analizaron los perfiles de ácidos grasos y los niveles de aciles-CoA en los distintos mutantes.

Al analizar los niveles de aciles-CoA totales en el mutante ppat-1 al final del desarrollo heterotrófico (día 5 tras la imbibición de la semilla) en medio suplementado y sin suplementar con sacarosa, se comprueba que ppat-1 muestra una reducción del 23% y del 50% (respectivamente) de aciles-CoA respecto al silvestre. Por el contrario, las líneas OE contenían 1.4 y 1.3 veces más aciles-CoA que el silvestre (respectivamente).

De nuevo, al igual que ocurría con aaBb (cuya reducción en el total de aciles-CoA era de más del 50%), se deduce que el tener menor número de copias en un enzima de la ruta de síntesis de CoA conduce a menores niveles del total de aciles-CoA, y que el sobreexpresar el gen PPAT implica mayores niveles de CoA y de sus tioésteres. Por otro lado, de nuevo, la presencia de sacarosa en el medio conduce a mayor número de aciles-CoA respecto a medio sin sacarosa, al igual que ocurría en el trabajo anterior con mutantes Athal3.

También se realizó una cinética del consumo de los ácidos grasos en medio con y sin sacarosa a día 0, 2 y 5 tras la imbibición de la semilla. A día 5 tanto en ppat-1 como en las líneas OE o el silvestre, los lípidos habían sido consumidos tanto en medio con como sin sacarosa. De hecho a día 5, el mutante ppat-1 llegaba a establecerse dado que había consumido los lípidos de reserva. Si lo comparamos con el mutante aaBb, éste no establecía y el catabolismo de los lípidos a día 5 en ausencia de sacarosa aún estaba retrasado.

Sin embargo, a día 2 tras la imbibición, el uso temprano de los lípidos está comprometido en ppat-1 en medio con sacarosa (el ácido eicosenoico (20:1), se ha consumido un 40 % en el silvestre, en cambio en ppat-1 no ha empezado a consumirse). Por otro lado, en ausencia de sacarosa a día 2, el mutante ppat-1 muestra tan sólo un ligero retraso en la movilización del eicosenoico. Por tanto, parece ser que ppat-1 tiene la �-oxidación del uso temprano de los lípidos afectada, posiblemente por el fallo en la síntesis del CoA (al igual que ocurría con el mutante aaBb). En este caso sólo afecta al uso temprano de los lípidos y la sacarosa en el medio acentúa el retraso en el uso de los ácidos grasos.

En cuanto a la respuesta de las líneas OE en esa cinética de los ácidos grasos, también a día 5 han consumido todas las reservas lipídicas.

Sorprendentemente, en las líneas OE (las cuales tienen mayores niveles de CoA), a día 2 y en medio con sacarosa, los ácidos grasos no estaban siendo degradados. Al

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contrario, acumulaban eicosenoico (20:1), al igual que ppat-1. Posiblemente, en las líneas OE el uso temprano de los lípidos en medio con sacarosa no tiene lugar porque poseen una capacidad más eficiente de usar la sacarosa. Dado que tienen más niveles de acetil-CoA y CoA, no tienen que recurrir a usar los lípidos en ese momento. Se ha mencionado anteriormente que la sacarosa tiene un claro efecto en el retraso del uso de los lípidos y probablemente, en las líneas OE la sacarosa se utiliza de modo más eficiente. Además, como dijimos anteriormente, la sacarosa tiene múltiples efectos en el metabolismo como molécula señalizadora de modo que puede actuar a nivel de la transcripción o post-traduccional de muchas rutas metabólicas.

Complementariamente, se ha observado en un trabajo reciente, que la mezcla de CoA y oleoil-CoA tiene un efecto inhibitorio de la lipasa de los lípidos SDP1 en ricino (Hills et al., 1989).

Otra explicación podría ser que unos mayores niveles de aciles-CoA y de CoA en las líneas OE conduzcan a algún tipo de inhibición en alguno de los procesos implicados en la movilización de las reservas; de hecho, se han sugerido efectos de los aciles-CoA como señalizadores de estos procesos (Eastmond y Graham, 2002).

2.6 Efecto de la sobreexpresión del gen PPAT en la respuesta al estrés salino/osmótico

La explicación más razonable para la tolerancia al estrés salino y osmótico de las líneas OE tendría que ver con efectos metabólicos relacionados con la síntesis del osmolito prolina, en la que intervienen el ciclo de Krebs y por tanto influyen los niveles de acetil-CoA en la célula. También estaría relacionada con la idea de integración entre desarrollo y niveles de CoA.

En medio con sacarosa, la síntesis de prolina en respuesta a estrés salino era similar entre el silvestre y las líneas de sobreexpresión del gen PPAT (OE). El mismo estrés pero quitando la sacarosa del medio, apenas provoca una reducción de los niveles de prolina en las líneas OE, mientras que en el silvestre disminuyen en dos veces los niveles de prolina respecto a medio con sacarosa. Estas líneas OE son menos dependientes de la sacarosa para responder al estrés manteniendo altos los niveles de prolina. De hecho, esta situación es muy ventajosa para responder al estrés por deshidratación ya que la síntesis de sacarosa y su transporte floemático se ven perjudicados bajo estas condiciones de estrés (Wardlaw, 1976; Tully et al., 1979).

Además, parece ser que el mayor contenido en CoA y acetil-CoA en estas líneas OE favorece el metabolismo en general, incluyendo la síntesis de derivados de los intermediarios del ciclo de Krebs, como es el caso de la prolina, y aumentando la biomasa de las líneas OE. Tanto la longitud, como el número de raíces secundarias y en definitiva, el mayor vigor contribuiría a explicar la mejora en la tolerancia a los estreses salino y osmótico de estas líneas.

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2.7 Mecanismo de regulación bioquímica del enzima PPAT recombinante, como segundo punto de control del flujo de la ruta

Por otro lado, en esta memoria se describe por primera vez en planta, el modo de regulación bioquímica del enzima recombinante PPAT (AtCoaD).

PPAT se ha comprobado que es el segundo enzima regulador de la ruta de síntesis del CoA en E. coli (Jackowski y Rock, 1984; Rock et al., 2000, 2003); por tanto, resultaba interesante estudiar el modo de regulación de PPAT de Arabidopsis. En E. coli PPAT queda inhibida por CoA de forma competitiva con el ATP, con el sustrato PhP (4´-fosfopanteteína) y con el dPCoA (Miller et al., 2007). Dada la conexión entre sobreexpresión de transcrito de PPAT y mayores niveles de CoA junto con el aumento de la biomasa de las líneas OE y su tolerancia a los estreses salino y osmótico, el aumento del conocimiento de la regulación del enzima de planta podría tener aplicaciones biotecnológicas interesantes.

Cuando en trabajos anteriores se usaron cepas de E. coli con el enzima PANK refractario a inhibición por CoA, los niveles de PhP aumentaban considerablemente y algo menos los del CoA (Rock et al., 2003). En mamíferos la sobreexpresión de la isoforma PANK1�, conduce a un aumento de 13 veces en los niveles de CoA y de unas 3 veces en los de PhP (Rock et al., 2000). En esta memoria, se ha comprobado que la sobreexpresión de PPAT da lugar a un aumento de los niveles de CoA, indicando en cierto modo que este enzima regula los niveles de CoA. Miller y colaboradores (2007), en su trabajo con el enzima PPAT de E. coli, han propuesto un modelo de regulación de este enzima dependiente de la concentración del sustrato, PhP, de modo que PPAT actuaría como enzima de apoyo al primer enzima controlador del flujo de la ruta, PANK.

Desafortunadamente no se pudo medir actividad PPAT en extractos de las líneas OE por lo que no se pudo demostrar la actividad in vivo. Posiblemente, este impedimento sea debido a la baja concentración del enzima en la planta y también por compuestos del extracto de plantas que interfieren con las medidas de formación de ATP y PPi de la reacción.

En cambio, el ensayo in vitro con el enzima recombinante permitió determinar una KM para el sustrato dPCoA de 37 µM. Este es un valor en el mismo de orden de magnitud que el publicado anteriormente para la PPAT bacteriana o de mamíferos (7 y 11 µM respectivamente; Geerlof et al., 1999; Aghajanian y Worral, 2002). Se calculó también la concentración de inhibidor necesaria para que la actividad del enzima cayera un 50%. Es decir se obtuvo la IC50 del enzima PPAT utilizando como inhibidores CoA y acetil-CoA y se demostró un efecto inhibitorio del CoA (IC50 de 38 µM) sobre la actividad de PPAT. Es difícil estimar con exactitud la concentración del CoA libre en los diferentes tejidos de la planta y en diferentes estadíos de desarrollo para así evaluar la relevancia fisiológica de la inhibición de PPAT por el CoA (Tumaney et al., 2004). En hojas de espinaca (Spinacia oleracea), la concentración citosólica de acetil-CoA es del orden de 40 a 65 µM. Normalmente en semillas de Arabidopsis los niveles de acetil-CoA predominan sobre los de CoA libre, pero en hojas de espinaca o en las valvas de sus silícuas ambos metabolitos están presentes en cantidades del mismo orden de

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magnitud (Gibon et al., 2002, Tumaney et al., 2004). Además, dado que la concentración de CoA que inhibe el 50% de la actividad de PPAT (38 µM) es muy similar a la KM para el sustrato dPCoA, (37 µM), sería razonable postular que en condiciones fisiológicas el CoA tenga un efecto inhibitorio de PPAT.

Aplicaciones biotecnológicas

En esta memoria hemos comprobado cómo variaciones en los niveles de transcrito de genes de la ruta de síntesis del CoA en plantas como HAL3A/3B o PPAT, conducen a variaciones en los niveles de CoA. También se ha estudiado la conexión entre el CoA y el metabolismo de degradación de los ácidos grasos o la ruta de movilización de los lípidos en general, así como también con la síntesis de derivados de intermediarios del ciclo de Krebs (como es el caso de la biosíntesis de prolina), y también la implicación del CoA en la síntesis de ácidos grasos especialmente durante la fase de deposición de las reservas. La regulación por estadío de desarrollo particularmente en estadío de plántula y de maduración de la semilla, induce los genes HAL3A, PPAT y coincide con una importante demanda energética en estos estadíos del ciclo de vida de planta. Se sugiere en este trabajo que niveles fisiológicos CoA deben regular por retroinhibición el enzima PPAT. No obstante los conocimientos acerca de la regulación de estos genes en la ruta o de la regulación de los niveles de CoA son todavía muy escasos.

La conexión establecida en esta memoria entre mayores niveles de CoA y la mejora en el desarrollo general de la planta, de la producción de semillas y de la tolerancia al estrés salino y osmótico, así como, dentro del metabolismo anabólico, del aumento en la síntesis de los ácidos grasos de reserva, convierten a esta ruta de síntesis de plantas y en particular al gen PPAT, en un objetivo sencillo y atractivo biotecnológicamente. En este sentido, resulta interesante tener plantas que produzcan más semillas con mayor contenido en lípidos (industria alimentaria y del biodiesel), además de con más biomasa y más tolerantes a suelos empobrecidos. De hecho, la empresa BASF-Agrochemicals se ha interesado por la patente que recoge nuestro trabajo sobre PPAT.

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1. La letalidad embrionaria del mutante aabb revela un papel crucial de los niveles de CoA durante la etapa temprana del desarrollo embrionario. Además, esta letalidad implica que una única copia de HAL3A (individuos Aabb), o de HAL3B (aaBb), en las plantas maternas, no soporta el desarrollo embrionario de individuos progenie aabb y es necesaria la biosíntesis de CoA de novo en el embrión para que la embriogénesis tenga lugar.

2. La función de HAL3A es particularmente crucial para el establecimiento de la plántula. En cambio, una copia única de HAL3B no es suficiente para soportar el establecimiento de la plántula en medio sin sacarosa. Sin embargo, el tener ambas copias del gen HAL3B rescata el fenotipo. Estos datos demuestran que la función catalítica del gen HAL3B es la misma que la de HAL3A. También se demuestra que la síntesis del CoA es necesaria para el establecimiento de la plántula.

3. El fenotipo que muestra el mutante aaBb de dependencia de sacarosa para establecerse es similar al observado en mutantes que tienen la movilización lipídica impedida (bien por fallo en la �-oxidación o bien porque el acetil-CoA no puede seguir siendo metabolizado). El hecho de que la sacarosa rescate el fenotipo de dependencia de ésta para establecer plántula, indica que el mutante aaBb tiene específicamente un defecto en la movilización de los lípidos causado por bajos niveles de CoA.

4. El catabolismo incompleto de los lípidos en el mutante aaBb tendría que ver con una menor síntesis de aciles-CoA como consecuencia de una síntesis de CoA impedida.

5. La mayor sensibilidad de aaBb respecto al tipo silvestre al estrés salino y en medio sin sacarosa, estaría relacionada con efectos de menor desarrollo y menor biomasa junto con defectos metabólicos en general.

6. El gen PPAT limita los niveles de CoA en la planta. Además, dado que las líneas OE mostraban un mayor desarrollo en general, y los mutantes ppat-1 una disminución de éste, se puede sugerir que manipular los niveles de CoA a través de la expresión del gen PPAT afecta al desarrollo de la planta.

7. La pérdida de función de HAL3A y el poseer sólo una copia de HAL3B es más determinante para el establecimiento de la plántula que el 10% de expresión de PPAT.

8. La sobreexpresión de PPAT tiene efectos importantes en el metabolismo lipídico durante la deposición de los lípidos de reserva en las semillas. La expresión residual de PPAT o de una copia de HAL3B en la planta aporta el CoA suficiente para que la deposición de los lípidos por semilla sea la adecuada a expensas de reducir la producción de lípidos por planta (más de un 50% de reducción).

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9. El mutante ppat-1 tiene la �-oxidación del uso temprano de los lípidos afectada, posiblemente por menores niveles de CoA (al igual que ocurría con el mutante aaBb).

<�= Las líneas OE, en presencia de sacarosa, también tienen comprometido el uso temprano de los lípidos, en este caso debido a que poseen una capacidad más eficiente para utilizar la sacarosa. Además, la sacarosa tiene un claro efecto en el retraso del uso de los lípidos, y en las líneas OE la sacarosa se utiliza de modo más eficiente. �

11. Las líneas OE son menos dependientes de la sacarosa para responder al estrés manteniendo altos los niveles de prolina. Esta situación es muy ventajosa para responder al estrés por deshidratación ya que la síntesis de sacarosa y su transporte floemático se ven perjudicados bajo estas condiciones de estrés.

12. El mayor contenido en CoA y acetil-CoA en estas líneas OE favorece el metabolismo en general, incluyendo la síntesis de intermediarios del ciclo de Krebs,l como la prolina, y aumentando la biomasa de las líneas OE. Tanto la longitud, como el número de raíces secundarias y en definitiva, el mayor vigor contribuiría a explicar la mejora en la tolerancia a los estreses salino y osmótico de estas líneas.

13. El ensayo in vitro con el enzima recombinante PPAT permitió determinar una KM para el sustrato dPCoA de 37 µM. Asimismo, se demostró un efecto inhibitorio del CoA (IC50 de 38 µM) sobre la actividad de PPAT. Además, dado que la concentración de CoA que inhibe el 50% de la actividad de PPAT (38 µM) es muy similar a la KM para el sustrato dPCoA (37 µM) sería razonable postular que en condiciones fisiológicas el CoA tenga un efecto inhibitorio sobre el enzima PPAT de plantas.

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