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Metilación del promotor SOX17 en células tumorales circulantes y ADN coincidente de células libres aislado del plasma de pacientes con cáncer de mama

M. Chimonidou, A. Strati, N. Malamos, V. Georgoulias y E.S. Lianidou

Enero de 2013

www.clinchem.org/content/59/1/270.full

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IntroducciónIntroducción

Células tumorales circulantes (CTC)•Las CTC juegan un papel fundamental en la diseminación metastásica de los carcinomas y su detección está asociada con el pronóstico en diversos tipos de cáncer humano, mientras que su enumeración ha sido esclarecida por la FDA para el seguimiento de pacientes con cáncer de mama, colon y próstata, a quienes se les han confirmado metástasis.

•Las CTC representan una herramienta diagnóstica nueva y promisoria, especialmente para pacientes con cáncer en etapa avanzada, en quienes las CTC pueden usarse como una "biopsia líquida", que permite a los médicos llevar un seguimiento de los cambios del cáncer con el paso del tiempo y adaptar el tratamiento de forma correspondiente.

•No obstante, actualmente queda claro que la simple enumeración de las CTC no es suficiente.

•La caracterización molecular de las CTC es muy importante ya que puede jugar un papel fundamental en la comprensión de la biología de la metástasis y en la selección de pacientes para el tratamiento dirigido.

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ADN de células libres (ADNcf)•El ADNcf circula en el plasma de pacientes con cáncer a elevadas concentraciones.

•Muchos equipos se han enfocado al desarrollo de ensayos que permitan la detección específica de pequeñas cantidades de ADNcf específico del tumor en la sangre periférica de pacientes con cáncer.

•La detección de alteraciones en el ADN específico del tumor, como mutaciones y metilación en el ADNcf, proporciona una fuente de ADN para el análisis genético menos invasiva y de más fácil acceso que las biopsias de tumores.

•Diversos estudios han descrito la metilación de los genes supresores de tumores en muestras de suero o plasma y en los correspondientes tumores de mama primarios, aunque la metilación de ADN no se detectó en el plasma ni en el suero de donantes sanos.

IntroducciónIntroducción

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SOX17

•Es un miembro de la familia de los factores transcripción SOX (caja del grupo de alta movilidad relacionado con el gen SRY).

•Juega un papel fundamental en la regulación del desarrollo y la función de células precursoras o células madre, parcialmente a través de la represión de la vía canónica de señalización Wnt/beta-catenina.

•El análisis global de la hipermetilación de islas de CpG y la expresión genética en líneas celulares de cáncer demostraron que el silenciador génico SOX17 está asociado con la hipermetilación de ADN de una isla de CpG localizada en la región del promotor

•El promotor SOX17 está metilado en las CTC aisladas de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama.

IntroducciónIntroducción

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PreguntaPregunta:

¿Existe una conexión directa entre la presencia de CTC y el ADN de células libres en pacientes con cáncer de mama operable a quienes se les ha realizado la resección del tumor primario?

Para contestar esta pregunta los autores escogieron usar el mismo marcador y la misma metodología en las muestras clínicas coincidentes.

Los autores evaluaron si la metilación del promotor SOX17 en las CTC estaba asociada con el patrón de metilación de este gen en el ADNcf coincidente aislado del plasma de pacientes con cáncer de mama.

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21 mL de sangre periférica en EDTA

Cáncer de mama temprano(N=55)

Cáncer de mama avanzado con metástasis confirmada

(N=59)

Individuos sanos(N=13)

20 mL: Aislamiento de PBMC mediante centrifugación por

gradiente de densidad (Ficoll)

1 mL: separación de plasma

Aislamiento de ADNcf del plasma (200 mcL) Selección positiva de CTC mediante separación inmunomagnética

(EpCAM)

Fracción de CTC

Aislamiento de ARN total (Trizol)

Aislamiento de RNAm (oligo-dTbeads)

Síntesis de ADNc

RTq-PCR para CK-19

Aislamiento de ADN genómico (Trizol)

Conversión con SB del ADN genómico

MSP en tiempo real para SOX17

Figura 1. Diagrama esquemático del flujo de trabajo del estudio.

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20 mL de sangre periférica

Gradiente de Ficoll

PBMC

Recuento de células

Selección positiva (EpCAM)

Aplicación de imán

Extracción de ADN de las CTC

Aislamiento de CTC

Aislamiento de ADN de

células libres

Plasma

MetodologíaMetodología

Figura 2. Esquema de la obtención de ADN de células libres y CTC.

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PCR específica de metilación (MSP)

La reacción de MSP es una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en conversión con bisulfito para el estudio de la metilación CpG del ADN.

El bisulfito de sodio convierte a uracilo todas las citosinas no metiladas (no así las metiladas).

MetodologíaMetodología

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¿Cómo se diseñaron las sondas y los cebadores específicos de metilación?

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MetodologíaMetodología

Diseño de cebadores para MSPPara una discriminación máxima entre los alelos metilados y los no metilados, el cebador debe contener al menos un sitio CpG con un saliente de 3’.

Además de los sitios con un saliente de al menos 3’, se prefieren más sitios CpG en las secuencias del cebador.

Tanto los cebadores como las sondas de MSP deben incluir bases T derivadas de las regiones C modificadas no metiladas para discriminar y amplificar el ADN convertido del no convertido.

GATUUTGATTGC

tratamiento con bisulfito

adición de cebadores metilados específicos para ADN

adición de cebadores no metilados específicos para ADN

inicio de la reacción PCR

inicio de la reacción PCR

hibridación del cebador, prosigue la elongación, generación de diversos fragmentos de ADN por amplificación de PCR; por tanto, se produce la metilación de CpG

el cebador no logra realizar la hibridación de forma correcta, sin productos de PCR; por tanto, se produce la metilación de CpG

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MSP con cebador metilado específico y sonda

control 100% metilado

50% metilado

1% metilado

0% metilado

Tratamiento del ADN genómico con bisulfito

Especificidad del ensayo MSP de SOX17

PCR específica de metilación en tiempo real

ADN metiladoADN no metilado

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Reacción de MSP en tiempo real para SOX17 con ADN aislado de fracciones de CTC de:

Resultados: graficas de las características

a) donantes sanos b) cáncer de mama operable c) metástasis confirmada

MSP en tiempo real para SOX17 con ADN aislado de ADNcf de:

a) donantes sanos b) cáncer de mama operable c) metástasis confirmada

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 Cáncer de mama temprano (n=55)

       

SOX17 de CTC                                                                                                                      

ADN de células libres                                                                                                                      

CK19                                                                                                                      

       

 Metástasis confirmada (n=59)

SOX17 de CTC                                                                                                                      

ADN de células libres                                                                                                                      

CK19                                                                                                                      

Mapa de calor de la metilación del promotor SOX17 en muestras coincidentes:Fracción de CTC y ADNcf de pacientes con: (a) cáncer de mama operable (n=55), (b) metástasis confirmada (n=59)En paralelo, la expresión del marcador epitelial CK-19 se muestra en la fracción de CTC

RESULTADOS

SOX17 metilado

Muestras no metiladas

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Cáncer de mama

operable (N=55)

ADN de células libres

Fracción de CTC SOX17 metilado SOX17 no metilado Total

SOX17 metilado 11 8 19

SOX17 no metilado 8 28 36

Total 19 36 55

Acuerdo 39 de 55 (70.9%), P*=0.008

Metástasis confirmada

(n=59)

ADN de células libres

Fracción CTCSOX17 metilado SOX17 no metilado Total

SOX17 metilado 13 14 27

SOX17 no metilado 11 21 32

Total 24 35 59

Acuerdo 34 de 59 (57.6%), P*=0.283

Tabla 1. Esquema de la obtención de ADN de células libres y CTC.

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¿Por qué la metilación del promotor SOX17 en las CTC y el ADNcf está altamente correlacionada en el cáncer de mama primario en contraste con la metástasis confirmada?

PreguntaPregunta

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• La metilación del promotor SOX17 en las CTC y el ADNcf coincidente muestra una alta correlación en el cáncer de mama temprano pero no en la metástasis.

• Este hallazgo apunta hacia una conexión directa entre la presencia de CTC y ADNcf en pacientes con cáncer de mama operable, después de la remoción quirúrgica del tumor primario.

• En el grupo de pacientes con metástasis confirmada, no se observó tal conexión, incluso cuando en varios casos hubo concordancia entre la metilación de SOX17 en CTC y ADNcf.

• Esto podría deberse posiblemente al hecho de que en este caso la metástasis ya estuviera presente y el ADNcf podría liberarse también de células apoptóticas que se escapan del sitio metastásico.

AnálisisAnálisis

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ConclusionesConclusiones

• La metilación del promotor SOX17 en las CTC y ADNcf coincidente está altamente correlacionada en el cáncer de mama temprano pero no en la metástasis.

• Este hallazgo apunta hacia una conexión directa entre la presencia de CTC y ADNcf en pacientes con cáncer de mama operable, después de la remoción quirúrgica del tumor primario.

• Dado que este estudio fue prospectivo, la importancia clínica de este hallazgo se debe seguir evaluando hasta que se conozcan los resultados clínicos de estos pacientes con cáncer de mama temprano.

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